专利名称：一种特异性半定量检测苯并芘的方法
技术领域：
本发明涉及一种简便、快速、准确的特异性半定量检测苯并芘的新方法。
背景技术：
苯并芘是具有长期残留性、生物积累性、半挥发性和高毒性，并能通过诸如大气、 水、生物体等环境介质长距离迁移并对人体健康和环境具有严重危害的持久性有机污染 物。实现对苯并芘的简便、快速、特异性检测对于监测环境中苯并芘污染程度，研究生物体 中苯并芘生物毒性具有重要意义。目前主要使用高效液相色谱、气相色谱、荧光仪等高端仪 器来检测苯并芘。这些方法耗时、昂贵、样品前处理复杂、不利于实现苯并芘的快速、简便的 检测。本发明使用的方法实现了简便、快速、准确的特异性半定量检测苯并芘。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、准确的特异性半定量检测苯并芘的新方法。本发明的目的是通过以下方式实现的。1、抗原合成使用2mL预冷的pH 1. 5-2. 0盐酸配制质量浓度为10. 86g/L的1-氨基芘溶液；在 上述溶液中缓慢滴加过量的预冷PH 2.0的亚硝酸钠溶液后，在0-5°C进行重氮化反应1小 时；将反应完全的1-氨基芘重氮盐溶液逐滴加入到配制好的体积为5mL，pH值为7. 5、浓度 为0. lmol/L含有68mg牛血清白蛋白的磷酸缓冲液中；使用lmol/L氢氧化钠溶液将pH值 调至7. 5，4°C反应过夜；反应液使用0. 9%生理盐水透析后制得抗原。2、抗原固定使用移液器将稀释浓度为1 200的抗原溶液点加到硝酸纤维素膜上，室温条件 下放置1小时；使用含有5%的脱脂牛奶的磷酸缓冲液将膜封闭1小时。3、苯并芘检测使用磷酸缓冲液配置不同浓度的苯并芘溶液；在塑料反应容器中将点加有抗原的 硝酸纤维素膜、稀释浓度为1 2500抗多环芳烃抗体(抗多环芳烃抗体由SANTA CRUZ提 供，型号sc-69887)和不同浓度的苯并芘溶液混合，室温条件下反应1小时。4、检测信号的获得使用磷酸缓冲液将反应后的硝酸纤维素膜漂洗三次，每次10分钟；使用含有5% 的牛血清白蛋白磷酸缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗(二抗由Invitrogen提供，型 号G21040)，稀释浓度为1 1000 ；在塑料反应容器中将漂洗后的硝酸纤维素膜和二抗混 合，室温条件下反应30分钟；使用磷酸缓冲液再次将反应后的硝酸纤维素膜漂洗三次，每 次10分钟；加入辣根过氧化物酶的化学发光底物4mL(酶化学发光底物由Invitrogen提 供，型号WP20005)，在暗室中反应5-10分钟后，使用感光胶片对信号进行收集曝光，再将 曝光后的感光胶片分别放入20mL显影和定影液进行显影、定影，显影时间为10分钟，定影 时间为5分钟。
5、检测信号的分析将曝光后的胶片扫描到电脑中，使用Photoshop 7. 0图片处理软件对图像进行预 处理；然后再使用Gel-Pro Analyzer 4. O专业分析软件对检测信号进行分析，获得与检测 信号相对应的苯并芘浓度。通过该方法，实现了对环境水样中的苯并芘进行半定量、特异性、快速检测。该方 法与传统方法相比，不仅具有较高灵敏度和特异性；同时，检测时间短、样品处理简单。本方 法通过对感光胶片曝光收集检测信号可以实现对检测样品可视化分析。与传统检测方法相 比，本方法同时可以在不使用任何仪器的情况下对检测样品进行半定量分析。 显影方法具有简便、快速、准确、操作简单、检测条件要求不高等优势特点。将显影 方法应用于环境样品苯并芘检测，充分发挥了该方法优越性，同时开辟了显影方法应用新 领域。
图1为本发明的原理示意图；图2为本发明实际样品中苯并芘含量检测流程图；图3为本发明实际样品中苯并芘含量检测结果图。
具体实施例方式以下实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。通过本发明方法发明人对湘江流域湖南大学段某个下水道出水口处水中苯并芘 进行半定量测定。1、抗原合成使用2mL预冷的pH 1. 5-2. 0盐酸配制质量浓度为10. 86g/L的1_氨基芘溶液；在 上述溶液中缓慢滴加过量的预冷PH 2.0的亚硝酸钠溶液后，在0-5°C进行重氮化反应1小 时；将反应完全的1-氨基芘重氮盐溶液逐滴加入到配制好的体积为5mL，pH值为7. 5、浓度 为0. lmol/L含有68mg牛血清白蛋白的磷酸缓冲液中；使用lmol/L氢氧化钠溶液将pH值 调至7. 5，4°C反应过夜；反应液使用0. 9%生理盐水透析后制得抗原。2、抗原固定使用移液器将稀释浓度为1 200的抗原溶液点加到硝酸纤维素膜上，室温条件 下放置1小时；使用含有5%的脱脂牛奶的磷酸缓冲液将膜封闭1小时。3、苯并芘检测使用磷酸缓冲液配置不同浓度的苯并芘溶液；在塑料反应容器中将点加有抗原的 硝酸纤维素膜、稀释浓度为1 2500抗多环芳烃抗体和不同浓度的苯并芘溶液混合，室温 条件下反应1小时。4、检测信号的获得使用磷酸缓冲液将反应后的硝酸纤维素膜漂洗三次，每次10分钟；使用含有5% 的牛血清白蛋白磷酸缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，稀释浓度为1 1000;在塑 料反应容器中将漂洗后的硝酸纤维素膜和二抗混合，室温条件下反应30分钟；使用磷酸缓 冲液再次将反应后的硝酸纤维素膜漂洗三次，每次10分钟；加入辣根过氧化物酶的化学发光底物4mL，在暗室中反应5-10分钟后，使用感光胶片对信号进行收集曝光，再使用各20mL 显影和定影液对胶片进行显影、定影。5、检测信号的分析将曝光后的胶片扫描到电脑中，使用Photoshop 7. 0图片处理软件对图像进行预 处理；然后再使用Gel-Pro Analyzer 4. O专业分析软件对检测信号进行分析，获得与检测 信号相对应的苯并芘浓度。结果见图3。
权利要求
一种特异性半定量检测苯并芘的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)抗原合成使用2mL预冷的pH 1.5-2.0盐酸配制质量浓度为10.86g/L的1-氨基芘溶液；在上述溶液中缓慢滴加过量的预冷pH 2.0的亚硝酸钠溶液后，在0-5℃进行重氮化反应1小时；将反应完全的1-氨基芘重氮盐溶液逐滴加入到配制好的体积为5mL，pH值为7.5、浓度为0.1mol/L含有68mg牛血清白蛋白的磷酸缓冲液中；使用1mol/L氢氧化钠溶液将pH值调至7.5，4℃反应过夜；反应液使用0.9％生理盐水透析后制得抗原；(2)抗原固定将稀释浓度为1∶200的抗原溶液点加到硝酸纤维素膜上，室温条件下放置1小时；使用含有5％的脱脂牛奶的磷酸缓冲液将膜封闭1小时；(3)苯并芘检测使用磷酸缓冲液配置不同浓度的苯并芘溶液；将点加有抗原的硝酸纤维素膜、稀释浓度为1∶2500抗多环芳烃抗体和磷酸缓冲液配置的不同浓度苯并芘溶液混合，室温条件下反应1小时；(4)检测信号的获得使用磷酸缓冲液将反应后的硝酸纤维素膜漂洗三次，每次10分钟；使用含有5％的牛血清白蛋白磷酸缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，稀释浓度为1∶1000；将漂洗后的硝酸纤维素膜和二抗混合，室温条件下反应30分钟；使用磷酸缓冲液再次将反应后的硝酸纤维素膜漂洗三次，每次10分钟；加入辣根过氧化物酶的化学发光底物4mL，在暗室中反应5-10分钟后，使用感光胶片对信号进行收集曝光，再将曝光后的感光胶片分别放入20mL显影和定影液进行显影、定影，显影时间为10分钟，定影时间为5分钟。(5)检测信号的分析，获得与检测信号相对应的苯并芘浓度。
2.根据权利要求1所述的一种特异性半定量检测苯并芘的方法，其特征在于，所述的 步骤(2)、(3)、(4)中的磷酸缓冲液的浓度为10mM。
全文摘要
本发明公开了一种特异性半定量检测苯并芘的方法，包括抗原合成、抗原固定、苯并芘检测、检测信号的获得。其关键在于，加入辣根过氧化物酶的化学发光底物后在暗室中反应，使用感光胶片对信号显影曝光，再对检测信号进行分析。此外，还摸索出一套适合检测的条件。该方法比普通的检测苯并芘的方法要简便，快速，实用，无需使用任何仪器，节省了成本，结果准确。为环境中苯并芘的监测提供了一条新途径。
文档编号G01N33/543GK101806798SQ20101014442
公开日2010年8月18日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者何晔娟, 刘承斌, 刘玉堂, 罗胜联, 蔡青云, 陈玉芳, 陈章 申请人:湖南大学