专利名称：分子印记固相萃取-液相色谱测定体液中可天宁的方法
技术领域：
本发明涉及体液中可天宁的测定方法，特别是一种利用合成可天宁分子印记聚合 物测定体液中可天宁的方法的方法。
背景技术：
随着全球性控烟运动的不断推进，社会公众对于吸烟与健康问题日益关注。可天 宁是尼古丁在人体代谢的主要产物，具有半衰期长、可从生物体液中准确测定等优点。尿 液、血液和血浆、吐液中的可天宁，被认为是一种特效、高灵敏、最可信的生物学标记物，能 反映人体通过吸烟或饮食摄入尼古丁剂量的大小。吸烟人群和非吸烟人群暴露于烟草烟气 的程度与其体液中检测出的可天宁浓度存在良好的正相关关系。因此可天宁是合适的评价 人体暴露烟草主流烟气或环境烟草烟气的生物标记物。目前测定人体体液中可天宁的分析方法包括分光光度法、气相色谱-氮磷检测 法、离子阱质谱法或电离源质谱法、高效液相色谱(HPLC)紫外检测法，HPLC原子力化学电 离源质谱法、柱前衍生化HPLC分析法、125I放射免疫检测法以及单克隆抗体酶免疫检测法 等。为了净化或预浓缩被测样品，几乎所有的分析方法都采用包括液液萃取(LLE)、固相萃 取(SPE)等样品前处理技术。LLE过程烦琐、费时、消耗大量的有机溶剂、对操作者健康以及 对环境造成不利影响。而针对复杂体系样品，经典SPE吸附剂又缺乏选择性，无法快速、准 确的对人体体液中的可天宁进行定量分析。
发明内容
本发明的目的正是针对现有技术中存在的不足之处，提供一种分子印记固相萃 取_液相色谱测定体液中可天宁的方法。该方法首先制备高选择性的可天宁分子印记聚合 物将体液中可天宁完全萃取，然后经过固相萃取洗脱，从而实现其中可天宁的快速、准确定 量分析。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种分子印记固相萃取-液相色谱测定体液中可天宁的方法，依次包括以下步 骤(1)将可天宁、单体、交联剂和引发剂、生孔剂超声脱气、通氮气后密封，在水浴下 聚合，然后将聚合物研磨、筛分，收集25-36 μ m的聚合物，用丙酮反复沉降去除细小颗粒 后得到所需颗粒。将所需颗粒装入玻璃层析柱中，分别用100mL-400mL的有机酸溶液和 100mL-300mL醇淋洗，洗脱印迹聚合物中的模板分子可天宁。洗脱后的聚合物颗粒置于烘箱 中干燥，得合成的可天宁分子印记聚合物。(2)将合成的聚合物作为固相萃取吸附剂，称取200mg-300mg装填于3mL的SPE聚 丙烯空柱(Supelco，Bellefonte，USA)中，制备固相萃取小柱。(3)采用含有机酸、水的乙腈溶液、醇、缓冲溶液依次淋洗固相萃取小柱，采用缓冲 溶液调节体液样品PH后上样，用缓冲溶液和有机胺的乙腈溶液淋洗小柱，去除体液样品中的盐及其它基体化合物，采用含有机酸、水的乙腈溶液对小柱进行洗脱。(4)分别收集步骤(3)淋洗、流出环节的溶液，浓缩至近干，加入乙酸盐缓冲溶液， 得检测液。(5)利用高效液相色谱测定步骤(4)所得检测液中的可天宁。色谱条件色谱柱=ZorbaxSB-C18 (250 X 4. 6mm，5 μ m，Agilent 公司)；流动相=A 相为缓冲盐溶液，B相为乙腈，等度洗脱，洗脱比例A B = 88%: 12%;流动相中包含浓 度为0. 02mol/L庚烷基磺酸钠作离子对试剂；流速1. OmL/min ；检测器二极管阵列检测 器；检测波长为260nm ；进样量20 μ L。本发明中，所述体液可为尿液、血液、血浆或吐液。所述步骤(1)中单体为包括一个、二个或三个碳原子取代烷基的烯酸。交联剂为 包括一个、二个或三个碳原子取代烷基的烯酸一元醇酯或多元醇酯。生孔剂为一个、二个或 三个碳原子的一取代或多取代氯代烃；引发剂为一个、二个或三个烃基的一取代或多取代
偶氮腈。所述步骤(1)中脱气时间为5-20min ；通氮气时间为5-20min ；水浴温度控制在 40 0C -80 0C ；水浴时间为 12h-36h。所述步骤(1)的淋洗液中有机酸为一个、二个或三个碳原子的一元有机酸或多元 有机酸。醇为一个、二个或三个碳原子的一元醇或多元醇。聚合物颗粒干燥温度控制在 IOO0C -150°Co干燥时间控制在12h-36h。所述步骤(3)的含有机酸、水的乙腈溶液中有机酸为一个、二个或三个碳原子的 一取代或多取代氟代有机酸；有机酸比例为_5%，水比例为-5%。所述步骤(3)的调节固相萃取小柱的醇为一个、二个或三个碳原子的一元醇或多元醇。所述步骤(3)中调节、淋洗固相萃取小柱，调节体液样品的缓冲盐为一个、二个或 三个碳原子的一元酸铵或多元酸铵和氨水溶液组成。调节体液样品的PH范围为8-11。淋 洗固相萃取小柱的有机胺乙腈溶液中有机胺为一个、二个或三个烃基取代铵。步骤(4)中的浓缩至干过程是在惰性气体保护下进行的，温度为30-50°C。乙酸盐 缓冲溶液PH范围3-5，量控制在100-500 μ L。本发明的突出优点在于本发明以可天宁为模版，采用非共价合成方法制备可天 宁分子印迹聚合物，高选择性的可天宁分子印记聚合物能够有效地将体液中可天宁完全萃 取，然后经过有效的固相萃取柱洗脱，从而实现其中可天宁的快速、准确定量分析。本发明 的方法不仅可以测定诸如体液这样的复杂体系中可天宁含量，而且选择性强、灵敏度高、准 确性好、操作简便快速。
具体实施例方式本发明以下将结合实施例作进一步描述，但并不限制本发明。实施例a、采用非共价合成方法制备可天宁分子印迹聚合物。将Immol的可天宁，4mmol 的甲基丙烯酸和5. 6mL的二氯甲烷加入到20mL的安培瓶中，充分混合后，再加入20mmol的 乙二醇二甲基丙烯酸酯和0. 24mmol的偶氮二异丁腈。超声脱气10分钟，通氮气5分钟，密封，置入60°C水浴中聚合24小时。破碎安培瓶取出块状聚合物，研磨、筛分，收集25-36 μ m 粒径的聚合物，用丙酮反复沉降去除细小颗粒。取所得颗粒lg，装入玻璃层析柱中，分别用 300mL的甲醇/乙酸(90 10) (ν/ν)和IOOmL甲醇淋洗，洗脱印迹聚合物中的模板分子。 聚合物颗粒置于105°C烘箱中干燥处理24小时，储存备用。b、将200mg聚合物颗粒装填于3mL的SPE聚丙烯空柱中制备SPE小柱。C、萃取体液样品。在上样之前，分别用50mmol/L的乙腈-H2O-三氟乙酸 (95 2. 5 2. 5，ν/ν)溶液 5mL、甲醇 3mL 和 CH3COONH4-NH3iaq)缓冲溶液(pH = 9. 0) 2mL,调 节SPE小柱。用CH3COONH4-NH3iaq)缓冲溶液(pH = 9. 0)，调节尿液样品的pH值并用0. 45 μ m 的水系滤膜过滤，上样体积为1. OmL。分别用1. OmLCH3COONH4-NH3iaq)缓冲溶液以及ImL三 乙胺乙腈溶液(99 1，ν/ν)淋洗SPE柱，以去除尿液样品中的盐及其它基体化合物。洗脱 溶液为乙腈-H2O-三氟乙酸(95 2. 5 2. 5, ν/ν)溶液2. OmL。d、收集淋洗、流出环节的所有溶液，40°C N2吹至近干，再加入200 μ LpH 3. 1的乙
酸盐缓冲溶液。e、对所得样品进行液相色谱_ 二极管阵列检测器分析。
权利要求
分子印记固相萃取 液相色谱测定体液中可天宁的方法，其特征在于依次包括以下步骤(1)将可天宁、单体、交联剂和引发剂、生孔剂超声脱气、通氮气后密封，在水浴下聚合，然后将聚合物研磨、筛分，收集25 36μm的聚合物，用丙酮反复沉降去除细小颗粒后得到所需颗粒，将所需颗粒装入玻璃层析柱中，分别用100mL 400mL的有机酸溶液和100mL 300mL醇淋洗，洗脱印迹聚合物中的模板分子可天宁，洗脱后的聚合物颗粒置于烘箱中干燥，得合成的可天宁分子印记聚合物；(2)将合成的聚合物作为固相萃取吸附剂，称取200mg 300mg装填于3mL的SPE聚丙烯空柱中，制备固相萃取小柱；(3)采用含有机酸、水的乙腈溶液、醇、缓冲溶液依次淋洗固相萃取小柱，采用缓冲溶液调节体液样品pH后上样，用缓冲溶液和有机胺的乙腈溶液淋洗小柱，去除体液样品中的盐及其它基体化合物，采用含有机酸、水的乙腈溶液对小柱进行洗脱；(4)分别收集步骤(3)淋洗、流出环节的溶液，浓缩至近干，加入乙酸盐缓冲溶液，得检测液；(5)利用高效液相色谱测定步骤(4)所得检测液中的可天宁色谱条件色谱柱Zorbax SB C18(250×4.6mm，5μm，Agilent公司)；流动相A相为缓冲盐溶液，B相为乙腈，等度洗脱，洗脱比例A∶B＝88％∶12％；流动相中包含浓度为0.02mol/L庚烷基磺酸钠作离子对试剂；流速1.0mL/min；检测器二极管阵列检测器；检测波长为260nm；进样量20μL。
2.根据权利要求1所述的一种分子印记固相萃取_液相色谱测定体液中可天宁的方 法，其特征在于所述体液为尿液、血液、血浆或吐液。
3.根据权利要求1所述的一种分子印记固相萃取_液相色谱测定体液中可天宁的方 法，其特征在于所述步骤(1)中单体为包括一个、二个或三个碳原子取代烷基的烯酸；交 联剂为包括一个、二个或三个碳原子取代烷基的烯酸一元醇酯或多元醇酯；生孔剂为一个、 二个或三个碳原子的一取代或多取代氯代烃；引发剂为一个、二个或三个烃基的一取代或 多取代偶氮腈。
4.根据权利要求1所述的一种分子印记固相萃取_液相色谱测定体液中可天宁的方 法，其特征在于所述步骤(1)中脱气时间为5-20min ；通氮气时间为5-20min ；水浴温度控 制在400C -800C ；水浴时间为12h-36h。
5.根据权利要求1所述的一种分子印记固相萃取_液相色谱测定体液中可天宁的方 法，其特征在于所述步骤(1)的淋洗液中有机酸为一个、二个或三个碳原子的一元有机酸 或多元有机酸；醇为一个、二个或三个碳原子的一元醇或多元醇；聚合物颗粒干燥温度控 制在100°C -150°c ；干燥时间控制在12h-36h。
6.根据权利要求1所述的一种分子印记固相萃取_液相色谱测定体液中可天宁的方 法，其特征在于所述步骤(3)的含有机酸、水的乙腈溶液中有机酸为一个、二个或三个碳 原子的一取代或多取代氟代有机酸；有机酸比例为_5%，水比例为-5%。
7.根据权利要求1所述的一种分子印记固相萃取_液相色谱测定体液中可天宁的方 法，其特征在于所述步骤(3)的调节固相萃取小柱的醇为一个、二个或三个碳原子的一元 醇或多元醇。
8.根据权利要求1所述的一种分子印记固相萃取-液相色谱测定体液中可天宁的 方法，其特征在于所述步骤(3)中调节、淋洗固相萃取小柱，调节体液样品的缓冲盐为一 个、二个或三个碳原子的一元酸铵或多元酸铵和氨水溶液组成；调节体液样品的pH范围为 8-11 ；淋洗固相萃取小柱的有机胺乙腈溶液中有机胺为一个、二个或三个烃基取代铵。
9.根据权利要求1所述的一种分子印记固相萃取_液相色谱测定体液中可天宁的方 法，其特征在于步骤(4)中的浓缩至干过程是在惰性气体保护下进行的，温度为30-50°C。 乙酸盐缓冲溶液PH范围3-5，量控制在100-500 μ L。全文摘要
一种分子印记固相萃取-液相色谱测定体液中可天宁的方法，涉及体液中可天宁的测定方法。该方法依次包括以下步骤(1)以可天宁为模板，合成可天宁分子印记聚合物；(2)将合成的聚合物作为固相萃取吸附剂，制备固相萃取小柱；(3)采用含有机酸、水的乙腈溶液、醇、缓冲溶液依次淋洗固相萃取小柱；(4)将洗脱液浓缩至干，加入乙酸盐缓冲溶液，得检测液；(5)利用高效液相色谱测定检测液中的可天宁。本发明首先将体液中可天宁完全萃取，然后经过固相萃取洗脱，从而实现其中可天宁的快速、准确定量分析。
文档编号G01N30/06GK101963600SQ20101018227
公开日2011年2月2日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者周平, 杨俊 , 蔡继宝, 邓宇 申请人:江西中烟工业有限责任公司