专利名称：一种量子点免疫荧光探针的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种量子点免疫荧光探针的制备方法，属于纳米材料学、生物分析化 学、纳米生物医学领域。
背景技术：
量子点(quantum dots, QDs)，又称半导体纳米晶，其半径小于或接近激子波尔半 径，主要由II-VI族元素(如CdTe、CdSe)或III-V族元素(如GaAs、InP)构成。量子点因 具有独特的光学与电学特性近年来引起了科学界的广泛关注，其在紫外-可见光范围内广 泛而连续的吸收光谱，窄且对称的荧光发射光谱使之具有单激发、多发射的多色标记功能。 量子点还具有光稳定性好、耐光漂白的独特性质，使其有望取代传统的有机荧光染料，获得 在生物医学荧光标记领域的广泛应用。量子点在生物医学标记领域的应用，通常先需要与生物素/亲和素、抗体、寡核苷 酸等生物分子结合，形成生物荧光探针，再加入样品中结合欲标记的相应配体、抗原或者核 酸。量子点与抗体的结合可通过静电吸附法直接与抗体结合，这种方法虽然简单易行，但结 合不够可靠，PH、温度、离子强度等环境因素改变可使量子点-抗体复合物解偶联。直接在 水相中制备的水溶性量子点在制备过程中在其表面引入了大量的氨基或者羧基，因此可以 通过这些功能集团与抗体蛋白分子中的氨基或者羧基形成化学共价偶联，得到稳定的量子 点-抗体荧光探针
发明内容
为拓展量子点在生物医学领域内应用，本发明提供了一种将水溶性羧基化量子点 用于标记具有生物活性的抗体蛋白进而制备免疫荧光探针的方法，该方法可将羧基化量子 点有效地与抗体蛋白连接，并很好地保持抗体的生物活性，可应用于基于抗原抗体特异性 结合的生物标记分析领域，例如基于测量荧光强度的抗原/抗体定量分析、酶联免疫吸附 分析、标记细胞中特定蛋白的胞内定位、研究核酸杂交等。本发明的量子点免疫荧光探针是在羧基化量子点末端连接特异性的抗体，通常可 连接一个或者一个以上抗体分子，数目可以通过控制量子点和抗体的比例进行调整。其中羧基化量子点的核心为CdTe、CdSe、CdTe/ZnS、CdSe/ZnS中的任意一种，且为 水相中直接制备的，以巯基丙酸或者其他含羧基的巯基化合物修饰的水溶性量子点。所用 的抗体可以是针对一种蛋白或者某蛋白的一个结构域，或者一段多肽的单克隆抗体，也可 以是针对来自不同物种蛋白的多克隆抗体。—种量子点免疫荧光探针的制备方法，其特征在于采用如下步骤A)用浓度为0. 2mol/L, pH值为7. 2-7. 6的磷酸盐缓冲液溶解1_乙基_3_ (3- 二甲 氨丙基)碳二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺，配制成羧基活化剂，活化剂中1-乙基-3-(3-二甲 氨丙基)碳二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺的浓度均为50mg/mL，将该活化剂按体积比1 8 加入至浓度为lmg/mL市售羧基化量子点中，在室温下轻微振荡使羧基活化形成活泼酯，经高速离心机分离使量子点沉降，弃去上清液；B)往步骤A)的量子点沉淀中加入A)中使用的磷酸盐缓冲液，在涡旋振荡器上轻 微振荡使量子点重新悬浮至A)加入活化剂后的体积，再高速离心机分离及重悬，照此重复 2次，再次高速离心使量子点沉降；C)加入浓度为lmg/mL的抗体溶液，轻微振荡使量子点在抗体溶液中重新悬浮至 步骤A)中加入活化剂后的体积，并使抗体与羧基活化的量子点充分接触，发生共价偶联反 应，在室温下放置lh，每隔20min轻微振荡一次，Ih后经低速离心机分离使形成的量子点团 块沉降，所得上清液即为量子点免疫荧光探针。本发明是在近年来发展起来的水热法直接制备水溶性量子点技术的基础上，用巯 基丙酸作为稳定剂修饰量子点表面，使之带有大量的羧基功能基团，利用EDC和NHS或者其 中之一作为羧基与氨基的偶联剂，将抗体可靠地连接在量子点表面。该方法简单易行、安全 可靠，无需特殊仪器试剂，在大多数生物、化学实验室均可完成，适合推广应用于生物医学 标记分析领域。
图1为为量子点免疫荧光探针的照片。图2为量子点免疫荧光探针的TEM图像。图3为量子点免疫荧光探针结合了 ELISA板底部的抗原后的荧光显微镜照片。
具体实施例方式实施例1 将0. 4g的NaBH4和0. 08g碲粉加入50mL锥形瓶中，加入5mL去离子水，通氮气 20min，立即塞紧软胶塞，插入一个注射器针头，磁力搅拌2h，得到乳白色新鲜制备的NaHTe 溶液。取0. 5mL浓度为200mmol/L的CdCl2水溶液，0. 5mL浓度为200mmol/L新鲜配制的巯 基丙酸水溶液，加入另一个50mL锥形瓶中，加入14ml去离子水，滴加浓度为lmol/L的NaOH 溶液，调整PH为12. 0，向上述溶液中通氮气20min，立即塞紧软胶塞，插入一个注射器针头， 用ImL注射器抽取新鲜制备的NaHTe溶液0. 2mL，快速注入装有Cd前驱液的锥形瓶中，将锥 形瓶放入96°C水浴锅中加热lh，取出自然冷却至室温；打开装有反应混合物的锥形瓶的软 胶塞，将溶液等分于两只15mL离心管中，再分别向两只离心管中加入与上清液等体积的无 水乙醇，待有絮状物产生时，用3000rpm/min的速度离心分离lOmin，吸出上清液，重复无水 乙醇洗涤、离心分离步骤2次，最后一次将上清液除去后将离心管放置于恒温恒湿柜中过 夜，得到CdTe量子点干粉。按如下方法取用水溶性量子点将用PBS复溶的量子点干粉用2%的优级纯硝酸 稀释100，000倍，根据卫生部标准WS-T 174-1999所述方法，用石墨炉原子吸收光谱法定量 量子点中Cd的浓度，并换算成CdTe的浓度。用pH值为7. 2-7. 6，0. 2M的PBS稀释量子点 溶液至1. Omg/mL，在涡旋振荡器上振荡分散20s，取ImL备用。若抗体为自行纯化得到，则应避免添加叠氮钠作为防腐剂，可使用prOClin300作 为防腐剂，终质量百分浓度为0. 02% ；若抗体为商品化的产品，则应在4°C条件下对PBS透 析过夜后使用，防止叠氮钠与活化的羧基结合，进而将其灭活，阻碍抗体的结合。抗体的浓度可根据需要调整，优选0. l_5mg/mL，更优选0. 5-2mg/mL用于与量子点的偶联。将EDC和NHS分别配制成浓度为50mg/mL的溶液，为保证偶联的效率，偶联剂溶液 应新鲜配制。取2个1.5mL离心管，向每个离心管中依次加入100 μ L分散好的量子点、540 μ L 去离子水，240yL PBS以及60yL EDC和60yL NHS溶液。将离心管以锡纸包裹，放在摇床 上室温下避光反应30min。取出离心管，置于高速离心机中，室温下12000rpm离心分离5min，使量子点沉降， 弃去上清液。加入1. OmL PBS，涡旋振荡20s重悬量子点，之后再次高速离心分离，重复2 次，除去溶液中剩余的偶联剂。加入200 μ L浓度为1. Omg/mL不含叠氮钠的抗体溶液，加入装有量子点的离心管
中，在涡旋振荡器上轻轻振荡使量子点在抗体溶液中均勻分散。用锡箔纸包裹离心管，放置 在摇床上室温下振荡反应Ih。取出离心管，置于低速离心机中，3000rpm离心5min，去除可能形成的沉淀，所得 上清即为水溶性量子点_抗体免疫荧光探针。将量子点免疫荧光探针通过透射电子显微镜(TEM)观察，可以看到所制备的探针 中量子点具有良好的单分散性(图2)。用相应的抗原包被ELISA板，加入量子点免疫荧光 探针与之结合，再分别用含有Tween-20的洗涤液以及PBS洗板3次，之后在荧光显微镜下 观察，可清楚地看到探针的荧光(图3)，表明探针具有良好的生物活性。进一步采用ELISA 法测定探针中抗体的效价，结果可达106，证明抗体的生物活性在探针制备的偶联反应中得 到了很好的维持。
权利要求
一种量子点免疫荧光探针的制备方法，其特征在于采用如下步骤A)用浓度为0.2mol/L，pH值为7.2 7.6的磷酸盐缓冲液溶解1 乙基 3 (3 二甲氨丙基)碳二亚胺和N 羰基琥珀酸亚胺，配制成羧基活化剂，活化剂中1 乙基 3 (3 二甲氨丙基)碳二亚胺和N 羰基琥珀酸亚胺的浓度均为50mg/mL，将该活化剂按体积比1∶8加入至浓度为1mg/mL市售羧基化量子点中，在室温下轻微振荡使羧基活化形成活泼酯，经高速离心机分离使量子点沉降，弃去上清液；B)往步骤A)的量子点沉淀中加入A)中使用的磷酸盐缓冲液，在涡旋振荡器上轻微振荡使量子点重新悬浮至A)加入活化剂后的体积，再高速离心机分离及重悬，照此重复2次，再次高速离心使量子点沉降；C)加入浓度为1mg/mL的抗体溶液，轻微振荡使量子点在抗体溶液中重新悬浮至步骤A)中加入活化剂后的体积，并使抗体与羧基活化的量子点充分接触，发生共价偶联反应，在室温下放置1h，每隔20min轻微振荡一次，1h后经低速离心机分离使形成的量子点团块沉降，所得上清液即为量子点免疫荧光探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于抗体是针对不同蛋白，或者蛋白的一 个结构域，或者一段多肽的单克隆抗体，或者是针对来自不同物种蛋白的多克隆抗体。
全文摘要
本发明提供一种量子点免疫荧光探针的制备方法，水溶性量子点标记的单克隆抗体荧光探针是在羧基化修饰的量子点末端共价连接单克隆抗体，通常每个量子点可以连接一个或者一个以上的抗体分子，其制备方法是先在水溶液中利用水热法制得巯基丙酸修饰的量子点，再通过共价偶联的方法使羧基修饰的量子点连接抗体蛋白，得到既有良好的荧光特性又有优异的生物活性的量子点免疫荧光探针。同现有技术比较，本发明的优点是该探针分散性好、特异性强、荧光强度大且耐光漂白，可应用于与免疫检测、细胞信号转导、生物细胞或组织的荧光成像技术等相关生物医学研究领域。该方法简单易行，可在一般的生物、化学实验室完成。
文档编号G01N33/536GK101907625SQ20101022027
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者张路遥, 潘敏, 牛婉婷, 陈裕泉 申请人:浙江大学