专利名称：将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法
技术领域：
由于人羊膜间充质细胞(human Amnion mesenchymal cells, hAMCs)具有增殖活 性和多分化潜能等干细胞生物学特点，本发明涉及了一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成 胰岛分泌细胞的方法。
背景技术：
由于羊膜是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，其表面人类白细胞 抗原(HLA)-A、B、C低表达，不表达HLA-DR，提示羊膜移植不引发免疫排斥。间充质干细胞 是低免疫原性细胞，不引发异常淋巴细胞增殖反应，并且能通过抑制T细胞、B细胞和NK细 胞功能，影响树突状细胞活性，此外还可以产生各种生长因子、细胞因子、趋化因子和蛋白 酶来调节免疫反应和改变组织微环境，刺激内源性干细胞减轻免疫炎症反应。人羊膜间充 质细胞低表达MHC-I，不表达MHC-II，可以避免免疫排斥反应，SUSANNE等对同一条件下人 羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞与脂肪组织来源的干细胞的免疫调节活性进行比较，发 现羊膜来源的间充质干细胞和上皮干细胞免疫抑制作用的发挥依赖于细胞接触和细胞剂 量。干细胞是一群具有极强自我更新能力和多向分化潜能的细胞，易分离，体外可大 量扩增，异体移植不引起免疫排斥反应。诱导分化的胰岛细胞可以发挥对血糖的生理性调 节作用，被认为是获取胰岛细胞的最佳种子细胞。Lumelsky等[1]成功地将小鼠胚胎干细 胞(embryonic stem cells, ESCs)诱导分化为能分泌胰岛素的细胞团。Assady等[2]证 实人ESCs可诱导分化成胰岛分泌细胞。干细胞诱导分化为β细胞的基本原理是借助生物 因子启动干细胞中PDX-I基因的表达，改变细胞原有形态，表达胰岛特异性标记，胰岛素、 胰高血糖素和胰多肽等。生物诱导因子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生 长因子(HGF)、尼克酰胺及适当浓度的葡萄糖。
发明内容
本申请的发明目的在于提供一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞 的方法。为了完成本发明目的，本发明采用以下技术方案本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，它包括(1)在无 菌条件下，从一个胎盘中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；(2)清洗上述人羊膜组织；(3)消化清洗后的人羊膜组织；(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间 充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为IX IO6个/ml-2 X IOw个/ml ；其中
(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中用含有20% FBS的α -MEM的培养基调整到 人羊膜间充质细胞的个数为1 X IO5个/ml，然后将其接种到24孔板中，待8_12小时细胞贴 壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM预先诱导24小时后，诱导为中间丝蛋白 阳性细胞，再用无血清的高糖DMEM诱导10小时后，得到胰岛分泌细胞；(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞，用RT-PCR方法或免疫细胞化学方法检 测上述细胞是否为胰岛分泌细胞；本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其中所述的步骤 ⑵为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4°C的含有100IU/ml青霉素和1000ug/ml链霉 素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍后， 在温度为20 25°C的无菌间，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml链霉素的D-hank，s冲 洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml链霉素D-hank’ s液 中浸泡2小时；2小时后用D-hank' s液清洗3-5遍；本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其中所述的步骤
(3)是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0.25%胰蛋白酶的消化液，放入37°C水浴锅中 分两次共消化45分钟后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10% FBS和的DMEM/F12液终止消 化，将消化后的羊膜组织用D-hank’ s液清洗直至清洗液澄清为止；本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其中所述分两次 共消化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C 水浴锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0.25%胰蛋白酶消化 液，放入37°C水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃动一次，使 人羊膜组织被充分地消化；本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其中所述的步骤
(4)中的将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞是采取以下步骤(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0. 2% 胶原蛋白酶V，然后放入温度为37°C的水浴锅中消化20 30分钟；(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细 胞悬浊液；(III)用无血清DMEM/F12按1 1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室 温下将其放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒 掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均勻后，再将其放入离心机内以1500r/min转 速离心5分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入含10% FBS的DMEM/F12培养 液后，用吸管将细胞吹打均勻后，使人羊膜间充质细胞个数为IX IO6个/ml-2 X IO6个/ml ；本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其中所述的步骤
(5)是将步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和含10%FBS的DMEM/F12培养液放置在培养瓶 中，培养瓶在温度为36. 5-37. 5 °C、饱和湿度、体积分数为4. 5%的CO2培养箱中培养，每2_3 天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85%以上时， 去掉培养液，用D-hank’ s液清洗两遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消化液进行消化，在 消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70%的细胞变化成圆形时，立即加入2ml DMEM/F12和10% FBS培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉 上清液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1 X IO6个/ml-2X IO6个/ml的密度 重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量；本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其中所述的步骤 (7)的用RT-PCR方法是检测上述细胞相关基因表达，若上述细胞包括胰岛素、葡萄糖转运 2(GLUT2)、葡萄糖激酶、中间丝蛋白阳性细胞和胰腺和十二指肠同源盒(PDX-I)细胞，说明 从步骤(6)得到的细胞为胰岛分泌细胞，否则，说明从步骤(6)得到的细胞不是胰岛分泌细 胞；本发明将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其中所述的步骤 (7)的用免疫细胞化学方法是检测上述细胞是否包括胰岛素和C肽的表达，若上述细胞包 括胰岛素和C肽的表达，说明从步骤(6)得到的细胞为胰岛分泌细胞，否则，说明从步骤 (6)得到的细胞不是胰岛分泌细胞。在成年机体中，间充质细胞存在于多种组织中，如骨髓、脂肪组织，但提取相当困 难。目前间充质细胞的主要来源为成人骨髓，但成人骨髓间充质细胞(bone marrow-MCs, BM-MCs)细胞数量极少，Pittenger等发现仅0. 001% 0. 01 %的经过密度梯度分离的单核 细胞产生可塑性的贴壁细胞克隆，并且增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较 高，供者间充质细胞的采集须行骨髓穿刺术，使来源受到限制。而人类羊膜作为胚胎发育的 早期产物，无论从解剖结构还是在发育行为上，都包含有较为幼稚的胚胎干细胞及趋于成 熟的成体干细胞成分；羊膜组织在胎儿娩出后即完成使命，对其研究不会涉及伦理道德问 题；由于羊膜MCs是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，间充质细胞表面人类 白细胞抗原I(human leucocyte antigen，HLA)-A、B、C不表达，人类白细胞抗原HLA-DR低 表达，从羊膜分离出间充质细胞样细胞，经体外扩增后成功植入新生大鼠和猪体内。上述优 势使人羊膜间充质细胞有望成为人类组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。利用上述方法得到的胰岛分泌细胞可以用于修复人体内的胰岛组织。
图1为用本发明方法所得到的胰岛分泌细胞，即用体外人羊膜间充质细胞表达胰 岛素的免疫化学形态图；图2为用本发明方法所得到的胰岛分泌细胞，即用体外人羊膜间充质细胞表达胰 高血糖的免疫化学形态图；图3为体外培养人羊膜间充质细胞合成酶联免疫分析图。
具体实施例方式本发明一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，它包括(1)在无菌条件下，从一个从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的 人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；(2)倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4°C的含有100IU/ml青霉素和1000ug/ml 链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂质和血渍 后，在温度为20 25°C的无菌间，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml链霉素的D-hank，s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml链霉素D-hank’ s 液中浸泡2小时；2小时后用D-hank’ s液清洗3_5遍；(3)将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C水浴 锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新0. 25%胰蛋白酶消化液，放 入37°C水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每隔5分钟晃动一次，使人羊膜 组织被充分地消化，加入3ml的含10% FBS的DMEM/F12终止消化，将消化后的羊膜组织用 D-hank' s液清洗直至清洗液澄清为止；(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；其中采用以下步骤(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0. 2% 胶原蛋白酶V，然后放入温度为37°C的水浴锅中消化20 30分钟；(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细 胞悬浊液；(III)用无血清DMEM/F12按1 1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室 温下将其放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒 掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均勻后，再将其放入离心机内以1500r/min转 速离心5分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入10% FBS和DMEM/F12培养液 后，用吸管将细胞吹打均勻后，使人羊膜间充质细胞个数为IX IO6个/ml-2 X IO6个/ml ；(5)将得到人羊膜间充质细胞和含10% FBS的DMEM/F12培养液放置培养瓶中，培 养瓶在温度为36. 5-37. 5°C、饱和湿度、体积分数为4. 5%的CO2培养箱中培养，每2_3天更 换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85%以上时，去掉培 养液，用D-hank’ s液清洗两遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过 程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70%的细胞变化成圆形时，立即加入2ml含10% FBS的DMEM/F12培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回 收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清 液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1 X IO6个/ml-2X IO6个/ml的密度重复 上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量；(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中用含有20% FBS的α -MEM的培养基调整到 人羊膜间充质细胞的个数为1 X IO5个/ml，然后将其接种到24孔板中，待8_12小时细胞贴 壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM预先诱导24小时后，诱导为中间丝蛋白 阳性细胞，再用无血清的高糖DMEM诱导10小时后，得到胰岛分泌细胞；(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞用RT-PCR方法或免疫细胞化学方法检测 上述细胞，检测得到的细胞是否为胰岛分泌细胞。其中所述的用RT-PCR方法是检测上述细 胞相关基因表达，若上述细胞包括胰岛素、葡萄糖转运2(GLUT2)、葡萄糖激酶、中间丝蛋 白阳性细胞和胰腺盒十二指肠同源盒(PDX-I)细胞，说明从步骤(6)得到的细胞为胰岛分 泌细胞，否则，说明从步骤(6)得到的细胞不是胰岛分泌细胞；所述的用免疫细胞化学方法 是检测上述细胞是否包括胰岛素和C肽的表达，若上述细胞包括胰岛素和C肽的表达， 说明从步骤(6)得到的细胞为胰岛分泌细胞，否则，说明从步骤(6)得到的细胞不是胰岛分 泌细胞。可以分别进行用RT-PCR方法或免疫细胞化学方法检测，也可以即进行既用RT-PCR方法鉴定又免疫细胞化学方法进行检测。图1为用本发明方法所得到的胰岛分泌细胞在细胞免疫荧光化学的结果，从图3 中可以看出第一组对照组(control)为正常血清中胰岛素的含量；第二组为人羊膜间充 质的胞浆(cytoplasm)中胰岛素的含量；第三组为人羊膜间充质的上清液(supernatant) 中胰岛素的含量，即用本发明的方法得到的胰岛分泌细胞中胰岛素的含量。以上方法只是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权 利要求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改。
权利要求
一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，它包括(1)在无菌条件下，从一个胎盘中分离出人羊膜组织，放入生理盐水中浸泡；(2)清洗上述人羊膜组织；(3)消化清洗后的人羊膜组织；(4)将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；(5)将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×106个/ml 2×106个/ml；其特征在于(6)将上述人羊膜间充质细胞悬液中用含有20％FBS的α MEM的培养基调整到人羊膜间充质细胞的个数为1×105个/ml，然后将其接种到24孔板中，待8 12小时细胞贴壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM预先诱导24小时后，诱导为中间丝蛋白阳性细胞，再用无血清的高糖DMEM诱导10小时后，得到胰岛分泌细胞；(7)取出一部分从步骤(6)中得到的细胞，用RT PCR方法或免疫细胞化学方法检测上述细胞是否为胰岛分泌细胞。
2.如权利要求1所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其特征 在于所述的步骤(1)是从正常足月剖腹产胎儿的胎盘的脐带面，钝性分离出的人羊膜组织。
3.如权利要求2所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其特征 在于所述的步骤(2)为倒掉步骤(1)的生理盐水，用温度为4°C的含有100IU/ml青霉素和 100ug/ml链霉素混合液的生理盐水对上述人羊膜组织进行清洗，直至人羊膜组织无任何杂 质和血渍后，在温度为20 25°C的无菌间，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml链霉素的 D-hank' s冲洗上述人羊膜组织3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml链霉素 D-hank’ s液中浸泡2小时；2小时后用D_hank’ s液清洗3_5遍。
4.如权利要求3所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其特征 在于所述的步骤(3)是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0. 25%胰蛋白酶的消化液， 放入37°C水浴锅中分两次共消化45分钟后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10% FBS的 DMEM/F12液终止消化，将消化后的羊膜组织用D-hank’ s液清洗直至清洗液澄清为止。
5.如权利要求4所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其特 征在于所述分两次共消化45分钟是将清洗后的人羊膜组织加入等体积的0. 25%胰蛋 白酶消化液，放入37°C水浴锅中消化15分钟后，倒掉上述消化液，然后再加入等体积的新 0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C水浴锅中消化30分钟后，倒掉上述消化液，在消化时每 隔5分钟晃动一次，使人羊膜组织被充分地消化。
6.如权利要求5所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其特征 在于所述的步骤(4)中的将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞是采取以下步 骤(I)将消化后的人羊膜组织用剪刀剪成浆状后放入烧杯中，加入等体积的0.2%胶原 蛋白酶V，然后放入温度为37°C的水浴锅中消化20 30分钟；(II)将消化后的羊膜浆状液分别用60目细胞筛和200目细胞筛进行过滤，得到细胞悬 浊液；(III)用无血清DMEM/F12按1 1的比例稀释上述过滤后细胞悬浊液，然后在室温下 将其放入离心机内以2500r/min转速离心10分钟，10分钟后将上述溶液中的上清液倒掉， 然后再加入DMEM/F12，用吸管将细胞吹打均勻后，再将其放入离心机内以1500r/min转速 离心5分钟，5分钟后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入10% FBS和DMEM/F12培养液后， 用吸管将细胞吹打均勻后，使人羊膜间充质细胞个数为1 X IO6个/ml-2X IO6个/ml。
7.如权利要求6所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其特征 在于所述的步骤(5)是将步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和含10% FBS的DMEM/F12培 养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36. 5-37. 5°C、饱和湿度、体积分数为4. 5%的CO2培 养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合 达到85%以上时，去掉培养液，用D-hank’ s液清洗两遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消 化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当70%的细胞变化成圆形 时，立即加入2ml含10% FBS的DMEM/F12培养液终止消化，然后用力吹打培养瓶的壁，将 贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分 钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；将上述回收的间充质细胞1 X IO6个/ ml-2X IO6个/ml的密度重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量。
8.如权利要求7所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其特征 在于所述的步骤(7)的用RT-PCR方法是检测上述细胞相关基因表达，若上述细胞包括 胰岛素、葡萄糖转运2、葡萄糖激酶、中间丝蛋白阳性细胞和胰腺和十二指肠同源盒细胞，说 明从步骤(6)得到的细胞为胰岛分泌细胞，否则，说明从步骤(6)得到的细胞不是胰岛分泌 细胞。
9.如权利要求7所述的将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，其特征 在于所述的步骤(7)的用免疫细胞化学方法是检测上述细胞是否包括胰岛素和C肽的 表达，若上述细胞包括胰岛素和C肽的表达，说明从步骤(6)得到的细胞为胰岛分泌细胞， 否则，说明从步骤(6)得到的细胞不是胰岛分泌细胞。
全文摘要
本发明涉及一种将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法，它包括从胎盘中分离出人羊膜组织；清洗上述人羊膜组织；消化清洗后的人羊膜组织；将上述人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；将人羊膜间充质细胞扩增到所需的数目后，用含有20％FBS的α-MEM的培养基调整到人羊膜间充质细胞的个数为1×105个/ml，然后将其接种到24孔板中，待8-12小时细胞贴壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM预先诱导24小时后，诱导为中间丝蛋白阳性细胞，再用无血清的高糖DMEM诱导10小时后，得到胰岛分泌细胞，利用上述方法得到的胰岛分泌细胞可以用于修复人体内的胰岛组织。
文档编号G01N33/53GK101914488SQ201010244938
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者刘艳军, 刘颖, 吴亦芳, 张向利, 张红霞, 曹克富, 李荣旗, 王月, 王瑞兰, 肖静, 范育红, 郭丽丽, 郭敏 申请人:李荣旗