专利名称：一种绿色荧光蛋白标记的微生物高效降解环境中多种有机污染物的方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一种利用基因同源重组技术构建一株绿色荧光蛋白标记的睾丸酮丛毛单胞菌C. Τ17β -GFP，应用这株突变株高效降解环境中多种有机污染物并进行荧光追踪。
背景技术：
睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni，C. Τ)是丛毛单胞菌属中的一种，能够以睾丸酮等固醇类物质作为唯一碳源和能源，还能降解非固醇类的异型生物质、药物、杀虫剂等，通过包含许多酶的氧化留核的复杂代谢途径，完全消化这类底物。绿色荧光蛋白(GFP)是由伍兹霍尔海洋生物学研究所的下村修等人在1962年在水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。该发现获得了 2008年的诺贝尔化学奖。近年绿色荧光蛋被广泛应用于生物学标记等领域。随着科学技术发展，多环芳烃和农药残留造成的环境污染日益严重，给人类生活健康带来了巨大危害。治理这两类物质的污染已经成为国内外关注热点。目前对多环芳烃污染和农药残留污染的治理方法主要有物理法，化学法和生物法。物理方法使污染物发生形态和地点变化，不能彻底解决污染问题。化学方法由于成本较高，严重阻碍了化学法治理有机污染物污染技术的发展。与物理和化学修复技术相比，生物修复技术具有成本低、效率高、无二次污染、不破坏生长所需的土壤环境等特点。生物修复技术主要是利用植物、微生物或原生动物等的吸收、转化、清除或降解水、土壤中的有机污染物。包括植物修复、微生物修复、动物修复等。植物修复相对降解效率低，不能完全分解有机污染物；动物修复虽然降解充分，但这种方法对环境要求高，难以实现高降解率。微生物修复是利用微生物的代谢活动把有机污染物转化为易降解的物质甚至矿化，能够把有害物质转化成为无毒无害的代谢产物，具有操作简便、易于就地处理等优点。因而，微生物修复技术是一种极具有广阔应用前景的治理方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种绿色荧光蛋白标记的微生物高效降解环境中多种有机污染物的方法，它可对多环芳烃污染和农药残留污染进行高效降解，在降解的同时可以针对绿色荧光蛋白的发光强度进行跟踪指示。本发明的方法是1、通过对质粒pGEM-GFP和载体pK18的双酶切后连接得到载体质粒pK_GFP_2，转化入大肠杆菌扩增后提取质粒，酶切得到GFP片段，立即将回收的GFP片段扩增产物与酶切 PT0P017 β -HSD-600-3连接，得到了重组的质粒，命名为ρΤ0Ρ017 β -600-GFP,通过电转化进C. T感受态细胞中，通过双抗性筛选得到改造株C. T17 β -GFP,具有以下特征(1)基因组DNA中具有GFP基因，其序列为序列表中SEQ ID NO=I中所示的序列；
(2)基因组DNA中具有质粒PK18基因，其序列为序列表中SEQ ID NO 2中所示的序列；(3)基因组DNA的GFP基因位于C. T关键酶17 β -羟基类固醇脱氢酶/羰基还原酶(17i3-HSD)基因下游，其序列为序列表中SEQ ID NO 3中所示的序列；(4)具有卡那霉素(karmmycin)和氨苄青霉素(ampicillin)双抗性。上述pGEM-GFP和pK18均为商品化质粒，为市场购得，ρΤ0Ρ017 β -600-3质粒是载有包含17 β -HSD启动子在内的600碱基对的载体，为本实验室构建。2、将C. Τ17β-GFP菌培养至最佳生长状态，按照1 50比例将其转接到含有 0. 05-1. OmM浓度有机污染物的低营养培养基中，持续27°C恒温振荡培养，使得有机污染物得到有效地分解。该技术方案主要包括如下步骤(1)(.117 0-6 菌的培养按1 50接种于液体LB培养基中，27°C恒温条件下， 180-200转每秒振荡培养12h ；( 将培养好的C.T17i3_GFP菌按1 50接种于含有各种有机污染物的低营养培养基中，20-27°C恒温条件下，180-200转每秒振荡培养；(3)分别于对11，4811，7211，9611，12011取样；31111，采用分光光度计测00595值；(4)将(3)中的样品3000-5000转每秒离心5_10分钟，取上清液用高效液相色谱法(HPLC)测定其有机污染物的残余量。步骤O)中的有机污染物包括苯，二甲苯，萘，农药DDV，S-氰戊菊酯，降解浓度范围为0. 05-1. OmM。高效液相色谱检测结果表明，本方法对苯，二甲苯，萘的降解率均高于60%，对 DDV, S-氰戊菊酯等农药类物质的降解率均高于40%。本发明的有益效果是本发明利用一种睾丸酮丛毛单胞菌改造株C. T17 β-GFP同时对农药等多种有机污染物进行降解实验，实验结果表明本方法对苯，二甲苯，萘的降解率均高于60%，对DDV，S-氰戊菊酯等农药类物质的降解率均高于40%。同时，各根据GFP的荧光作用，本发明在降解污染物的过程中进行了荧光追踪，为降解过程的监测打下基础。本方法可以降解环境中多种有机污染物，并且效率较高，成本较低，无二次污染、不破坏生长所需的土壤环境，同时可以对降解过程进行实时荧光跟踪指示，是降解环境中有机污染物的较好方法。
图 1 是 ρΤ0Ρ017 β -600-GFP 构建过程。图2是有机物浓度为最佳时，反应开始至15h，136h检测到的荧光值。图3是有机物浓度为最佳时，反应开始至13 高效液相色谱法检测到的样品残留量。
具体实施例方式实施例1 C. T17 β -GFP菌对低浓度有机污染物的降解实验(一 )质粒pGEM-GFP和载体pK18的双酶切
反应体系如下成分体积EcoR I /Bamh I各 1P 1pGEM-GFP/pK1825 u 110*酶切缓冲液3 U 1_37°C,5h获得GFP片段，进行琼脂糖凝胶电泳(1% )鉴定，回收目的片段。(ニ)目的片段GFP与载体pK18的连接将回收的GFP片段双酶切PCR扩增产物立即与双酶切pK18的连接，反应体系如 下成分体积双酶切pK184 U 1GFP 片段1 U 1T4 连接酶Iiil10*T4 酶缓冲液1 P 1ATP (5mM)1 U 1ddH202 U 1_16°C,20h得到质粒pK-GFP-2，转化入大肠杆菌扩增。(三)质粒 pKGFP 和 pTOPOl7 ^ -600-3 的酶切将大肠杆菌扩增得到的pKGFP和pTOPO 17 0 _600_3分別进行酶切，反应体系如 下pKGFP 酶切成分体积BamH I /Pst II各 1P 1pKGFP25 U 110*酶切缓冲液3 U 1_37°C,5hpT0P017 ^ -600-3 酶切成分体积BamH I /Pst I /Hind III各 1P 1pT0P017 3 -600-325 U 110*酶切缓冲液3 ill_37°C,5h(四)目的片段GFP与质粒pT0P017^ -600-3的连接
将回收的GFP片段扩增产物立即与酶切PT0P017 β -600-3连接，反应体系如下成分体积酶切ρΤ0Ρ017 β -600-34 μ 1GFP 片段1 μ 1Τ4 连接酶1 μ 110*Τ4 酶缓冲液1 μ 1ATP (5mM)1 μ 1ddH202 μ 1_16°C，20h得到质粒PT0P017 β -600-GFP,它具有卡那霉素抗性，能在大肠杆菌中复制，而不能在C. T菌中复制，将质粒PT0P017 β -600-GFP通过电转化转化进C. T感受态细胞中，通过双抗性筛选(kannmycin+ampicillin)得到突变菌株C. T17 β -GFP。(五)、C.Τ17 β -GFP菌对低浓度有机污染物的降解实验(1)(.117 3-6 菌的培养按1 50接种于液体LB培养基中，27°C恒温条件下， 180-200转每秒振荡培养过夜；(2)将培养好的C. T17 β-GFP菌按1 50接种于浓度为0. 05mM的苯，二甲苯，萘， DDV, S-氰戊菊酯等物质的低营养培养基中，27°C恒温条件下，180-200转每秒振荡培养；(3)分别于 24h,48h,72h,96h, 120h, 136h 取样 3ml，采用分光光度计测 0D595 值；(4)将(3)中的样品3000-5000转每秒离心5_10分钟，取上清液用高效液相色谱法(HPLC)测定其有机污染物的残余量。高效液相色谱检测结果如下表表1. C. T17 β -GFP对低浓度有机污染物的降解
物质初始浓度降解率(m mol/L)(t=136h)苯0. 05mM58%二甲苯0. 05mM70%萘0. 05mM66%DDV0. 05mM55%S-氰戊菊酯0. 05mM40%实施例2 C. Τ17 β -GFP菌对偏高浓度有机污染物的降解实验( 一 )质粒pGEM-GFP和载体pK18的双酶切反应体系如下成分体积EcoR I /Bamh I各 1 μ 1pGEM-GFP/pK1825 μ 110*酶切缓冲液3 μ 1
_37°C，5h获得GFP片段，进行琼脂糖凝胶电泳(1% )鉴定，回收目的片段。(ニ)目的片段GFP与载体pK18的连接将回收的GFP片段双酶切PCR扩增产物立即与双酶切pK18的连接，反应体系如 下成分体积双酶切pK184 U 1GFP 片段1 U 1T4 连接酶1 P 110*T4 酶缓冲液IiilATP (5mM)IiilddH202 ill_16°C，20h得到质粒pK-GFP-2，转化入大肠杆菌扩増。(三)质粒 pKGFP 和 pTOPOl7 ^ -600-3 的酶切将大肠杆菌扩增得到的pKGFP和pT0P017 ^ -600-3分別进行酶切，反应体系如 下pKGFP 酶切成分体积BamH I /Pst II各 1P 1pKGFP25 U 110*酶切缓冲液3 ill_37°C，5hpT0P017 3 -600-3 酶切成分体积BamH I /Pst I /Hind III各 1 P 1pT0P017 3-600-325 u 110*酶切缓冲液3 ill_37°C，5h(四)目的片段GFP与质粒pT0P017^ -600-3的连接将回收的GFP片段扩增产物立即与酶切pT0P017 ^ -600-3连接，反应体系如下成分体积酶切pT0P017 ^ -600-34 U 1GFP 片段IiilT4 连接酶IiU
10*T4 酶缓冲液Ιμ ATP (5mM)1 μ 1ddH202 μ 1_16°C，20h得到质粒ρΤ0Ρ017 β _600_GFP，它具有卡那霉素抗性，能在大肠杆菌中复制，而不能在C. T菌中复制，将质粒PT0P017 β -600-GFP通过电转化转化进C. T感受态细胞中，通过双抗性筛选(kannmycin+ampicillin)得到突变菌株C. T17 β -GFP。(五)、C.Τ17 β -GFP菌对DDV，S-氰戊菊酯等农药类物质的降解实验(1)(.117 3-6 菌的培养按1 50接种于液体LB培养基中，27°C恒温条件下， 180-200转每秒振荡培养过夜；(2)将培养好的C. Τ17β -GFP菌按1 50接种于浓度为0. ImM的苯，二甲苯，萘， DDV, S-氰戊菊酯等物质的低营养培养基中，27°C恒温条件下，180-200转每秒振荡培养；(3)分别于 24h,48h,72h,96h, 120h, 136h 取样 3ml，采用分光光度计测 0D595 值；(4)将(3)中的样品3000-5000转每秒离心5_10分钟，取上清液用高效液相色谱法(HPLC)测定其有机污染物的残余量。高效液相色谱检测结果见下表表2. C. T17 β -GFP菌对偏高浓度有机污染物的降解
权利要求
1.一种绿色荧光蛋白标记的微生物高效降解环境中多种有机污染物的方法，其方法是A、通过对质粒pGEM-GFP和载体pK18的双酶切后连接得到载体质粒pK_GFP_2，转化入大肠杆菌扩增后提取质粒，酶切得到GFP片段，立即将回收的GFP片段扩增产物与酶切 PT0P017 β -HSD-600-3连接，得到了重组的质粒，命名为ρΤ0Ρ017 β -600-GFP,通过电转化进C. T感受态细胞中，通过双抗性筛选得到改造株C. T17 β -GFP ；a基因组DNA中具有GFP基因，其序列为序列表中SEQ ID NO 1中所示的序列； b基因组DNA中具有质粒pK18基因，其序列为序列表中SEQ ID NO 2中所示的序列； c基因组DNA的GFP基因位于C. T关键酶17 β -羟基类固醇脱氢酶/羰基还原酶 17 β-HSD基因下游，其序列为序列表中SEQ ID NO 3中所示的序列； d具有卡那霉素和氨苄青霉素双抗性；B、将C.T17i3-GFP菌培养至最佳生长状态，按照1 50比例将其转接到含有 0. 05-1. OmM浓度有机污染物的低营养培养基中，持续27°C恒温振荡培养，使得有机污染物得到有效地分解。
2.根据权利要求1所述的一种绿色荧光蛋白标记的微生物高效降解环境中多种有机污染物的方法，其方法是A、C.T17i3-GFP菌的培养按1 50接种于液体LB培养基中，27 °C恒温条件下， 180-200转每秒振荡培养12h ；B、将培养好的C.T17 β-GFP菌按1 50接种于含有各种有机污染物的低营养培养基中，20-27°C恒温条件下，180-200转每秒振荡培养；C、分别于Mh，48h，72h，96h，120h取样:3ml，采用分光光度计测0D595值；D、将步骤C中的样品3000-5000转每秒离心5-10分钟，取上清液用高效液相色谱法测定其有机污染物的残余量。
全文摘要
一种绿色荧光蛋白标记的微生物高效降解环境中多种有机污染物的方法，属于微生物技术领域，其方法是通过对质粒pGEM-GFP和载体pK18的双酶切后连接得到载体质粒pK-GFP-2，转化入大肠杆菌扩增后提取质粒，酶切得到GFP片段，将回收的GFP片段扩增产物与酶切pTOPO17β-HSD-600-3连接，得到了重组的质粒，通过电转化进C.T感受态细胞中，通过筛选得到改造株C.T17β-GFP；将C.T17β-GFP菌培养至最佳生长状态，按照1∶50比例将其转接到含有0.05-1.0mM浓度有机污染物的低营养培养基中，持续27℃恒温振荡培养，使得有机污染物得到有效地分解。有益效果是利用一种睾丸酮丛毛单胞菌改造株同时对农药等多种有机污染物进行降解实验，同时，各根据GFP的荧光作用，本发明在降解污染物的过程中进行了荧光追踪。
文档编号G01N30/02GK102371042SQ201010251279
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月12日 优先权日2010年8月12日
发明者于化东, 于源华, 刘振宇, 姚健, 宋禹, 崔微, 张昊, 李金海, 杨佳新 申请人:长春理工大学