专利名称：一种在同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体的方法
技术领域：
本发明涉及体外检测技术领域，具体地涉及一种在免疫检测样本时在同一反应体系中测定样本中针对某种抗原的IgM抗体和IgG抗体的方法和相应的试剂盒。
背景技术：
在临床实验室诊断中，有很多是通过检测机体产生的针对某种细菌或病毒IgM抗体和IgG抗体来确认其感染或曾经感染，比如弓形虫，巨细胞病毒(CMV)等。目前检测人体针对某种病原体的IgM抗体和IgG抗体，是通过两个试剂盒来实现的，这样在临床使用过程中，试剂的消耗量，所需病人的样本量及检测工作量都较大。因此，本领域的这项在同一反应体系中测定样本中IgM抗体和IgG抗体的方法，能大大降低目前的人力物力财力。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能在同一反应体系中测定样本中针对某种抗原的IgM 抗体和IgG抗体的方法，从而节省临床检测更为简便的、更为省时，也更为经济。在本发明的第一方面，提供了一种在同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体的方法， 包括以下步骤(a)将待测样品与第一抗原溶液混合，其中所述的第一抗原溶液含有1-50种不同的抗原，所述的每一种抗原偶联于不同的微球而形成式I所示的第一抗原-微球的二元复合物，Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示抗原与微球之间的共价键；从而使待测样品中的抗体与所述抗原形成“抗体_抗原_微球”三元复合物，其中所述的“抗体_抗原_微球”三元复合物包括“ IgM抗体-抗原-微球”三元复合物”和“ IgG 抗体_抗原_微球”三元复合物；(b)将步骤(a)形成的溶液与第二抗体溶液混合，其中所述的第二抗体溶液含有 1-50种不同的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别是针对该抗原的 IgM抗体的抗体，从而形成“第二抗体-IgM抗体-抗原-微球”的IgM抗体四元复合物；(c)检测IgM抗体四元复合物中不同微球的可检测信号，从而确定待检测样品中各IgM抗体的存在与否，附加条件是待测样品与第一抗原溶液和第二抗体溶液的混合，可依次进行，也可同时进行；(d)将步骤(C)检测后的形成的溶液与第三抗体溶液混合，其中所述的第三抗体溶液含有1-50种不同的带有可检测信号的第三抗体，所述的每一种第三抗体分别是针对该抗原的IgG抗体的抗体，从而形成“第三抗体-IgG抗体-抗原-微球”的IgG抗体四元复合物；
(e)检测IgG抗体四元复合物中不同微球的可检测信号，从而确定待检测样品中各IgG抗体的存在与否。在另一优选例中，所述的第二抗体带有的可检测信号和第三抗体带有的可检测信号是相同的或不同的。在另一优选例中，所述的可检测信号是荧光信号。在另一优选例中，所述的微球是平均粒径为2-10 μ m、且染上不同荧光的聚苯烯微球。在另一优选例中，所述的抗原包括病毒抗原、肿瘤抗原、细菌抗原、寄生虫抗原等。在另一优选例中，所述的抗原包括弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、 甲肝病毒抗原、乙肝病毒抗原、丙肝病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原。在另一优选例中，所述的第一抗原溶液含有2-30种不同的抗原，更佳地含有3-20 种不同的抗原。在另一优选例中，在所述的第二抗体溶液和第三抗体溶液中，各第二抗体和第三抗体的浓度为0. l-200ug/ml。在另一优选例中，步骤(c)和(e)中用Luminex xMAP法进行检测。在另一优选例中，在步骤(c)和(e)中包括将测定的可检测信号与质控或标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中抗体的存在与否，和/或数量。在另一优选例中，所述的第二抗体带有的可检测信号和第三抗体带有的可检测信号是相同的，并且在步骤(e)中包括步骤将步骤(e)中测得的可检测信号的读数减去步骤 (c)中测得的可检测信号的读数，作为判断IgG抗体存在与否，和/或数量的依据。在本发明的第二方面，提供了一种用于在同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体的试剂盒，它包括以下组分(a’)第一容器以及装于该容器中的第一抗原溶液，其中所述的第一抗原溶液含有 1-50种不同的抗原，所述的每一种抗原偶联于不同的微球而形成式I所示的第一抗原_微球的二元复合物，Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示抗原与微球之间的共价键；(b’)第二容器以及装于该容器中的第二抗体溶液，其中所述的第二抗体溶液含有 1-50种不同的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别是针对该抗原的 IgM抗体的抗体，从而形成“第二抗体-IgM抗体-抗原-微球”的IgM抗体四元复合物；(c’)第三容器以及装于该容器中的第三抗体溶液，其中所述的第三抗体溶液含有 1-50种不同的带有可检测信号的第三抗体，所述的每一种第三抗体分别是针对该抗原的 IgG抗体的抗体，从而形成“第三抗体-IgG抗体-抗原-微球”的IgG抗体四元复合物。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括(d’ )用作质控的标准液、或质控液。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
--累述。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次在同一反应体系中通过两种带可检测信号的抗体抗IgM抗体的抗体和抗IgG抗体的抗体，并且通过两次采集可检测信号，实现了在同一反应体系中测定样本中针对某种抗原的IgM抗体和IgG抗体。本发明方法可以大大降低目前的人力物力财力，并且操作简单，适应面广。本发明方法也适用于同时针对多个抗原的IgM抗体和IgG抗体。如本文所用，术语“抗IgM抗体的抗体”，指可特异性结合于IgM抗体的一种抗体。如本文所用，术语“抗IgG抗体的抗体”，指可特异性结合于IgG抗体的一种抗体。如本文所用，术语“抗原”指具有免疫原性的物质，例如蛋白质、多肽。代表性的抗原例子包括(但并不限于)病毒抗原、肿瘤抗原、细菌抗原、寄生虫抗原等。例如，弓形虫抗原(如弓形虫外壳蛋白)、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原(巨细胞病毒的外壳蛋白)、甲肝病毒抗原、乙肝病毒抗原、丙肝病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原。基本原理(a)免疫夹心法的原理免疫夹心法的原理是本领域技术人员所熟知的。在检测针对某种抗原的IgM抗体和IgG抗体时，通常分为两个试剂盒。检测针对某种抗原的IgM抗体时，常规的做法是将抗原固定于固相载体，然后加入待测样本，待测样本中的IgM抗体会与固定于固相载体上的抗原结合，洗涤后再与标有酶的抗IgM抗体的抗体反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。检测针对某种抗原的IgG抗体时，常规的做法是将抗原固定于固相载体，然后加入待测样本，待测样本中的IgG抗体会与固定于固相载体上的抗原结合，洗涤后再与标有酶的抗IgG抗体的抗体反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。(b) Luminex xMAP 法的原理Luminex xMAP是一个非常灵活的多功能技术平台。其原理是把微小的乳胶颗粒 (Beads，简称为“微球”)分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白(如抗原抗体)以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物(被测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等)。在悬液中的微球与被检测物特异性地结合，并加上荧光标记。然后，微球成单列通过两束激光，一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)，所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。在一个优选例中，充分利用了抗原固定在不同流动微球(Beads)的特点，同时优化藻红蛋白(PE)标记的抗IgM抗体的抗体或抗IgG抗体的抗体的浓度，将交联了抗原的微球溶液与血清样本或标准质控品液、PE标记的抗IgM抗体的抗体抗IgG抗体的抗体溶液依次或同时一并加入反应容器中，从而发生以下反应①微球上的抗原与血清或标准质控品液中针对该抗原的IgM抗体和IgG抗体结合，形成“ IgM抗体-抗原-微球”复合物或“ IgG抗体-抗原-微球”复合物；②PE标记的抗IgM抗体的抗体或抗IgG抗体的抗体与血清或标准质控品液中相应的IgM抗体或IgG抗体结合，最终形成“PE标记的抗IgM抗体的抗体-IgM抗体-抗原-微球”复合物或“ΡΕ标记的抗IgG抗体的抗体-IgG抗体-抗原-微球”复合物。在液相中即可通过Luminex χΜΑΡ检测复合物的荧光，进行定性或定量分析。在Lumin ex检测仪上，这些微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定被测IgM抗体或IgG抗体是针对何种抗原的；另一束测定微球上PE的荧光强度，经数据处理得出被测IgM抗体或IgG抗体的含量。关于Luminex χΜΑΡ的技术平台详细资料，请参见相关文献(1) Journal ofImmunological Methods, 227 :41_52 ； (2)www. luminexcorp. com。(c)同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体方法的原理在本发明方法中，首先在1种荧光编码的微球(称为1号球)上以共价键方式交联某种抗原；加入血清样本或标准质控品液后，1号微球上的抗原与血清或标准质控品液中相应的IgM抗体和IgG抗体结合。这时，再加入PE标记的抗IgM抗体的抗体，此时1号微球上的抗原与IgM抗体结合部分形成“ 1号荧光编码微球_抗原_血清相应IgM抗体-PE标记的抗IgM抗体的抗体” 四元复合物。在Luminex检测仪上，荧光编码的微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定被测IgM抗体是针对哪种抗原的；另一束测定微球上 PE的荧光强度，经数据处理得出被测IgM抗体的含量。随后，再在反应体系中加入PE标记的抗IgG抗体的抗体，此时1号微球上的抗原与IgG抗体结合部分形成“ 1号荧光编码微球_抗原_血清相应IgG抗体-PE标记的抗IgG 抗体的抗体”四元复合物。在Luminex检测仪上，荧光编码的微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定被测抗体是针对哪种抗原的；另一束测定微球上PE的荧光强度。该荧光强度减去前次测IgM抗体时的荧光强度，即为IgG抗体的荧光强度。经数据处理得出被测IgG抗体的含量。值得注意的是，以上给出的是第二抗体(抗IgM抗体)和第三抗体(抗IgG抗体) 带有的相同的可检测信号(即PE标记)的情况。显然，当第二抗体(抗IgM抗体)和第三抗体(抗IgG抗体)带有的不同的可检测信号时，可以直接根据第三抗体的可检测信号的读数来判断抗IgG抗体的存在与否和/或数量。以下，以检测风疹病毒抗体为例，进一步说明本发明的相关操作细节。抗原-微球复合物在本发明中，抗原_微球复合物具有式(I)结构Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的共价键；抗原与微球的偶连不同抗原与微球共价交联的详细操作程序可用常规方法，例如按照Luminex公司的产品说明书或网站=WWW. luminexcorp. com中所述的方法进行偶连，从而得到不同微球与相应抗原形成偶连物Ag-Bead。取一定量的Ag-Beads，稀释至一定浓度就可得到抗原-微球悬液(简称为A液)。抗IgM抗体的抗体和抗IgG抗体的抗体的标记(二抗的标记)
虽然在这里所用的抗IgM抗体的抗体和抗IgG抗体的抗体可用各种本领域已知的可检测信号进行标记。然而，优选的是用荧光信号进行标记，尤其是通过生物素-亲和素连接方式标记PE。在一优选例中，抗体的生物素(Biotin)标记方法如下取抗IgM抗体的抗体 (antilgM)透析纯化后加入生物素二甲基亚砜(DMSO)溶液，避光反应，透析去除未反应的生物素，保存备用。抗IgG抗体的抗体(anti IgG)也用以上方法标记。然后取一定量的生物素标记的抗IgM抗体的抗体或抗IgG抗体的抗体，加入亲和素(Str印tavidin)标记的PE，使生物素与Sti^ptavidin结合，生成带荧光素标记的抗体 (即PE-antilgM或PE-antilgG，其中PE表示藻红蛋白)，得到抗体溶液(简称为C液)。质控或标准为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控。比如在检测风疹IgM抗体和风疹IgG抗体的试剂盒中，用风疹IgM抗体和风疹IgG抗体的标准品配制一定浓度范围内的溶液。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个风疹IgM抗体和风疹IgG抗体的标准品。例如，风疹IgM抗体和风疹IgG抗体标准(STDn，n = 0 5)和质控品(质控1、质控2)溶液的配制可按下表配制表1 风疹IgM抗体和风疹IgG抗体标准质控品溶液配制表
权利要求
1.一种在同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将待测样品与第一抗原溶液混合，其中所述的第一抗原溶液含有1-50种不同的抗原，所述的每一种抗原偶联于不同的微球而形成式I所示的第一抗原-微球的二元复合物，Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示抗原与微球之间的共价键；从而使待测样品中的抗体与所述抗原形成“抗体-抗原-微球”三元复合物，其中所述的“抗体_抗原_微球”三元复合物包括“ IgM抗体-抗原-微球”三元复合物”和“ IgG抗体-抗原-微球”三元复合物；(b)将步骤(a)形成的溶液与第二抗体溶液混合，其中所述的第二抗体溶液含有1-50 种不同的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别是针对该抗原的IgM抗体的抗体，从而形成“第二抗体-IgM抗体-抗原-微球”的IgM抗体四元复合物；(c)检测IgM抗体四元复合物中不同微球的可检测信号，从而确定待检测样品中各IgM 抗体的存在与否，附加条件是待测样品与第一抗原溶液和第二抗体溶液的混合，可依次进行，也可同时进行；(d)将步骤(c)检测后的形成的溶液与第三抗体溶液混合，其中所述的第三抗体溶液含有1-50种不同的带有可检测信号的第三抗体，所述的每一种第三抗体分别是针对该抗原的IgG抗体的抗体，从而形成“第三抗体-IgG抗体-抗原-微球”的IgG抗体四元复合物；(e)检测IgG抗体四元复合物中不同微球的可检测信号，从而确定待检测样品中各IgG 抗体的存在与否。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二抗体带有的可检测信号和第三抗体带有的可检测信号是相同的或不同的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测信号是荧光信号。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微球是平均粒径为2-10μ m、且染上不同荧光的聚苯烯微球。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗原包括病毒抗原、肿瘤抗原、细菌抗原、寄生虫抗原等。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的第二抗体溶液和第三抗体溶液中， 各第二抗体和第三抗体的浓度为0. l-200ug/mL·
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)和(e)中用LuminexxMAP法进行检测。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)和(e)中包括将测定的可检测信号与质控或标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中抗体的存在与否，和/或数量。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二抗体带有的可检测信号和第三抗体带有的可检测信号是相同的，并且在步骤(e)中包括步骤将步骤(e)中测得的可检测信号的读数减去步骤(c)中测得的可检测信号的读数，作为判断IgG抗体存在与否，和/或数量的依据。
10.一种用于在同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体的试剂盒，其特征在于，它包括以下组分(a’ )第一容器以及装于该容 器中的第一抗原溶液，其中所述的第一抗原溶液含有 1-50种不同的抗原，所述的每一种抗原偶联于不同的微球而形成式I所示的第一抗原_微球的二元复合物， Ag-bead (I)式中，Ag表示抗原，bead表示微球，-表示抗原与微球之间的共价键； (b’ )第二容器以及装于该容器中的第二抗体溶液，其中所述的第二抗体溶液含有 1-50种不同的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别是针对该抗原的 IgM抗体的抗体，从而形成“第二抗体-IgM抗体-抗原-微球”的IgM抗体四元复合物；(C’ )第三容器以及装于该容器中的第三抗体溶液，其中所述的第三抗体溶液含有 1-50种不同的带有可检测信号的第三抗体，所述的每一种第三抗体分别是针对该抗原的 IgG抗体的抗体，从而形成“第三抗体-IgG抗体-抗原-微球”的IgG抗体四元复合物。
全文摘要
本发明公开了一种在同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体的方法。具体地，本发明方法包括步骤(a)将待测样品与第一抗原溶液混合，形成“抗体-抗原-微球”三元复合物；(b)将步骤(a)形成的溶液与第二抗体溶液混合，形成“第二抗体-IgM抗体-抗原-微球”的IgM抗体四元复合物；(c)检测并确定待检测样品中各IgM抗体的存在与否；(d)将步骤(c)检测后的形成的溶液与第三抗体溶液混合，形成“第三抗体-IgG抗体-抗原-微球”的IgG抗体四元复合物；(e)检测并确定待检测样品中各IgG抗体的存在与否。本发明方法可简便、快速、准确地同时定性和定量检测同一样品中针对某抗原的IgM抗体和IgG抗体。
文档编号G01N33/53GK102375052SQ20101025483
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者乔健, 朱冬青, 梁敏锐, 邹和建, 陈向军, 顾悦华 申请人:复旦大学附属华山医院