猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达及检测方法

专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达及检测方法
技术领域：
本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA抗体检测方法的建立 属于生物技术高科技领域，专用于检测猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染情况和猪群 中弱毒疫苗免疫后的抗体变化情况。
背景技术：
国内外有关PRRS血清抗体的诊断方法有免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接 荧光抗体试验(IFA)、血清中和试验(SN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集实验(LAT) 等[8’9]。其中以ELISA因具有高度的敏感性和特异性，适用于大规模的检测，方便易行，操作 过程及结果判定易于标准化应用等优点应用最为广泛。到目前为止，PRRSV抗体检测的ELISA方法均以综合处理的结构蛋白或全病毒作 为包被抗原。2009年，Elizabeth Brown等_试验以非结构蛋白作为包被抗原检测I型和 II型PRRSV抗体。研究发现NSP1、NSP2和NSP7具有较好的免疫原性，并研究了针对不同非 结构蛋白的抗体产生规律，建立了以重组非结构蛋白NSPl、NSP2、NSP4、NSP7和NSP8作为 包被抗原的间接ELISA检测方法。其中NSP7抗体在感染后14天可以检测到并持续至202 天以后，与IDEXX抗体消长曲线类似。I型和II型NSP7抗体检测结果与IDEXX HerdChek PRRS 2XR ELISA的符合率分别为98. 3%和99. 3%。从而证明PRRSV非结构蛋白NSP7在抗 体检测中也有较好的应用前景。

发明内容
技术问题本发明的目的是用原核表达系统对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白 进行表达，然后对表达蛋白进行纯化后建立ELISA检测方法。技术方案本发明的实施方案如下猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA检测方法的建立，其特征在 于，用原核系统表达的NSP7蛋白具有表达量高，经亲和层析纯化后纯度高，完全可以作为 包被抗原建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA方法。用表达蛋白建立的ELISA 方法与其他ELISA方法进行比较，具有高度的敏感性和特异性，具有发展为商品化试剂盒 的前景。猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA检测方法的建，是通过以下方 法构建而成的1. 1NSP7基因的扩增、克隆和鉴定设计两对引物，上游引物P 1 CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC,下游引物 P2 TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA ； 分别引入Not I和BamH I酶切位点，以PRRSV的cDNA产物为模板进行PCR扩 增，获得NSP7蛋白目的基因条带，将扩增的目的条带克隆如pET-28a载体，获得重组质粒pET-28a-NSP7 ；1. 2NSP7蛋白的表达和纯化将重组质粒pET-28a-NSP7转化入大肠杆菌BL21中，涂 布氨苄青霉素抗性培养皿，37 °C过夜培养；挑取单个菌落接种3毫升LB培养基，37°C过夜振 荡培养；第二天取1 %的过夜培养物接种新鲜LB培养基，当细菌浓度0D600达到0. 4 0. 6 时，按终浓度1. 5mmol/L IPTG和诱导4h诱导表达基因工程重组菌500ml，离心收集菌体，诱 导后的细菌按每IOOmL菌液加入5mL PBS重悬菌体沉淀，经超声裂解后，按按照Irwitrogen 公司M-NTA试剂盒说明书进行亲和层析纯化，收获蛋白。用所述NSP7蛋白建立的ELISA方法，包括1)用权利要求1所述的重组NSP7蛋白包被ELISA板，2% BSA封闭；2)对待检血清用PBS进行1 100稀释后，每孔加入稀释后的待检血清100微升， 37°C作用1小时，PBST洗涤5次；2)对酶标二抗用PBS进行1 20000稀释后，每孔加入100微升稀释的酶标二抗， 37°C作用0. 5小时，PBST洗涤5次；3)加入底物TMB进行显色，37°C显色作用10分钟，然后用50微升2M的硫酸终止；4)于450nm波长测定OD值，经统计学分析，得到0D450平均值X和标准差SD ；5)结果判定血清样品S/P彡X+3SD者判为阳性，S/P ( X+2SD者判为阴性，介于两 者判为可疑，S待检样品的OD值，P阳性对照的OD值。有益效果本发明在国内首次提出了用原核系统表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构蛋 白，对该非结构蛋白进行纯化后建立检测针对NSP7蛋白抗体。用该表达蛋白建立的检测方 法，可以区分猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗和野毒的感染。同时由于猪体内针对非结构蛋 白的抗体产生较早，因此可以用来进行猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的早期诊断。试验证明，本发明应用原核表达系统构建的ELISA试剂盒具有很好的敏感性和特 异性。该ELISA方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪伪狂犬(PRV)和猪2型圆环病毒阳 性血清反应呈阴性，说明此方法特异性良好。批内和批间试验结果变异系数均值分别为 5. 84%和6. 21%，表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对30份血清样品进 行检测，该方法检测结果与IDEXX和韩国JENO公司的VDPro试剂盒符合率分别为为93. 3% 和90%。表明本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性，适于大规模检测PRRSV血 清抗体的流行病学调查。
四

图1NSP7基因扩增结果泳道1 :DNA分子量标准D2000 ；泳道2 :NSP7基因的PCR扩增图2重组质粒pET-28a_NSP7的双酶切鉴定泳道1 :DNA 分子量标准 1Kb ladder ；泳道 2 :pET-28a_NSP7 的 NotI 和 BamHI 酶切图3表达产物的SDS-PAGE分析泳道1 :pET-28a_NSP7/BL21 的 IPTG 诱导结果泳道2 低分子量蛋白标准品图4纯化的重组蛋白SDS-PAGE分析
泳道1-6 洗脱缓冲液中纯化的重组蛋白的不同组分图 5 重组 NSP7 的 Westernblot 鉴定 A泳道1 含pET-28a_NSP7重组质粒的细菌；泳道2 含pET_28a空载体的细菌图 6 重组 NSP7 的 Western blot 鉴定 B泳道1 含pET-28a_NSP7重组质粒的细菌；泳道2 含pET_28a空载体的细菌 五具体实施例方式1. 2PRRSV NSP7全长基因的PCR扩增及pET_28a_NSP7质粒的构建1.2.1引物的设计根据GenBank 收录的 PRRSV SY0608 株 NSP7 基因序列(GenBank 登 录号EU144079)并参考文献报道，设计两对引物，引物序列如下上游引物Pl CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC,下游引物 P2 TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA,分别引 入Not I和BamHI酶切位点(下划线部分)。1.2.2目的基因的扩增以PRRSV cDNA产物作为PCR模板扩增PRRSV NSP7的全基因。PCR体系为模板 2. 0μ L,25mM Mg2+L 5 μ L, 2. 5mM dNTP 2 μ L, 10XPCR Buffer 2· 5 μ L，引物 P3 禾口 P4 (均为 IOpmol/ μ L)各1 μ L，Taq DNA聚合酶(5U/ μ L) 0· 2 μ L，最后用灭菌双蒸水补至25 μ L。PCR 反应条件为94°C预变性2min ；94°C 45s, 52°C 45s, 72°C 45s，共进行34个循环；最后72°C 延伸lOmin。PCR产物经凝胶电泳后切胶回收纯化。1. 2. 3PCR产物与原核表达载体的酶切处理酶切反应体系为20yL。PCR 回收产物 10μ L，10XH buffer 2μ L,0. 1 % BSA 2μ L,0. 1% Triton-x-1002 μ L, Not I 0. 5 μ L,补充无菌双蒸水至反应总体系 20 μ L, 37°C 水浴 3h。载体酶切体系为 pET-28a 10 μ L, 10ΧΗ buffer 2μ L,0. 1% BSA 2μ L,0. 1 % TritonX-1002 μ L，Not 10. 5 μ L，补充无菌双蒸水至总体积20 μ L。对PCR产物和载体进行 Not I酶切后经凝胶电泳后切胶回收，对回收的PCR产物和载体建立BamH I酶切体系，体系 如下酶切回收产物10 μ L，10XK buffer 2 μ L,BamH I 0. 5 μ L，用无菌双蒸水补充总体积 至20 μ L，37°C水浴3h。凝胶电泳后回收PCR产物和载体。1.2. 4酶切产物的回收与纯化取回收的PCR产物和载体建立连接反应体系，反应总体系10 μ L0反应体系如下 NSP7 基因 7. 5 μ L，pET-28a 1 μ L, T4DNA 连接 0. 5 μ L，10XT4DNA 连接酶 Bufferl μ L, 16°C 连接过夜。1. 2. 5转化感受态大肠杆菌DH5 α感受态大肠杆菌DH5 α (购自NEB公司)的制备以及连接产物的转化。连接产物 涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的抗性平板上，37°C温箱中培养16_24h。1.2.6碱裂解法提取质粒DNA接种于含50. 0 μ g/mL的卡那霉素的LB试管中过夜培养，应用常规的碱裂解法 提取质粒。取1. 5mL菌液，12000rpm离心30s，沉淀菌体；完全弃去上清后加入300. 0 μ L 4°C 预冷的溶液 I(50mmol/L 葡萄糖；25. 0mmol/L Tris-Cl, pH8. 0 ； 10. 0mmol/L EDTA)重 悬细菌；加入新配制的溶液II 300. 0 μ L(0. 2mol/LNa0H;1.0% SDS)，快速颠倒离心管5次，室温作用5min ；加入225. OyL用冰预冷的溶液III (5. Omol/L乙酸钾60. OmL,冰乙酸 11. 5mL,水28. 5mL)，盖紧管口，将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，置冰上5min ； 4°C 12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中；加入等体积的酚氯仿(1 1)，颠倒 混勻后置室温5min，12000rpm离心5min ；取上清到新的离心管，加入0. 8倍体积的异丙醇， 颠倒混勻，室温放置IOmin ； 12000rpm离心lOmin，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥， 加入 30μ L 的 TE (ρΗ8. 0)或双蒸水溶解；加入 1 μ LRNaseA (10mg/mL)，37 °C 作用 30min (此 步可在酚氯仿抽提之前完成)；的琼脂糖凝胶电泳分析。1. 2. 7重组质粒的酶切鉴定利用Not I/BamH I酶切位点将PRRSV NSP7基因片段插入到表达载体pET_28a中， 通过双酶切鉴定有无插入片段及插入片段大小。酶切反应体系如下Buffer3yL，疑似阳性 质粒4 μ L，BamH I IyL5Not I 1 μ L，用双蒸水补充总体积至20 μ L。酶切反应在0.5ml的 Eppendorf 管中进行，37°C水浴 3h，其中 Buffer 为 0. 1% BSA 和 IOXKBuffer 体积比 1 1 混合而成。酶切结束后琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并拍照记录。1. 2. 8PRRSV NSP7基因的序列测定经双酶切鉴定为阳性的重组质粒pET-28a_NSP7，将其转化新鲜制备的感受态大肠 杆菌DH5 α，涂布含有卡那霉素的LB抗性平板，37°C过夜培养至出现单菌落，挑取单菌落接 种含有卡那霉素的LB液体培养基，37°C过夜振摇培养后送交上海英骏有限公司进行测序。1. 3融合蛋白的表达，纯化及抗原性鉴定1. 3. 1大肠杆菌BL-21感受态细胞的制备和转化在LB平板上挑取BL-21的单个菌落接种于3. OmL LB液体培养基中，200rpm 过夜振荡培养；次日按2%的体积接种于新的LB培养基中，200rpm震荡培养3 4h至 0D600 0. 3 0. 5 ；将细菌转移至1. 5mL的灭菌离心管中，每管1. OmL，冰上孵育30min ； 40C 12000rpm离心30s ；完全弃去上清，用1. OmL 0. lmol/L冰冷的CaCl2重悬细菌，冰上孵 育IOmin ；4°C 12000rpm离心30s ；完全弃上清，用100 μ L 0. lmol/L冰冷的CaCl2重悬细菌， 放置4°C冰箱24h内备用。取阳性重组质粒LOyL加入到100. 0 μ L新鲜制备的大肠杆菌 感受态细胞中，轻轻混勻，冰上孵育30min ；然后置42°C水浴中热休克90s，迅速置冰中冷却 1 2min ；每管加入室温LB培养基800. 0μ L,37°C 200rpm震荡培养45min ； 12000rpm离心 30s沉淀细菌，弃去大部分上清，残留约100. 0 μ L上清重悬菌体，然后涂布于50. 0 μ g/mL氨 苄青霉素抗性平板上，37°C培养16 24h。1.3. 2重组蛋白表达条件的优化分别挑取含质粒pET-28a_NSP7和pET_28a的散在单菌落接种于含有卡那霉素的 LB液体培养基中，37°C过夜振摇培养。(1)取过夜培养的菌液10 μ L接种于3mL含有卡那霉素(50 μ g/ml)的LB液体 培养基中，37°C 200rpm振荡培养3h左右，使OD6c 达到0. 6 1. 0，取100 μ L样品于无菌 Eppendorf管中作为诱导前对照；(2)向上述菌液中加入终浓度为1. 5mmol/L的IPTG进行重组蛋白的诱导表达，并 在加入IPTG后第l、2、3、4、5h分别取样100 μ L ；(3) 40C 8000rpm离心5min收集诱导表达的细菌，PBS (pH 7. 2)重悬，如此反复洗 涤2次；
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(4)完全弃上清，用适量PBS重悬细菌沉淀；(5)将菌液反复冻融3次；(6)超声波裂解细菌功率选用200W，在冰盒上操作，超声裂解5s，停顿10s，直至 菌液变得清澈；(7) 40C SOOOrpm离心lOmin，分别收集上清与沉淀将沉淀用与上清等体积的PBS 重悬，上清与沉淀悬浮液各取100 μ L备用。1. 3. 3SDS-PAGE 电泳分析取沉淀和上清用等量2Χ上样缓冲液重悬每个沉淀，煮沸5min，然后进行 SDS-PAGE 电泳。1.3. 4重组蛋白的大量表达按终浓度1. 5mmol/L IPTG和诱导4h诱导表达基因工程重组菌500ml，离心收集菌 体，按每IOOmL菌液加入5mL PBS重悬菌体沉淀，-20°C保存备用。1. 3. 5重组蛋白的亲和层析纯化按照Invitrogen公司Ni-NTA试剂盒操作说明进行。1. 3. 6 重组蛋白的 Western blot 鉴定将SDS-PAGE胶上的蛋白质条带转印到NC膜上，然后进行Western-blot鉴定。半 干转印30min，取下NC膜，丽春红染色2min，10%脱脂乳封闭3_4h，多克隆血清作用2h，用 PBST洗涤三次，IOmin/次；羊抗鼠IgG-HRP 二抗作用lh，用PBST洗涤三次，IOmin/次，将显 色液A、B等体积混合，铺满印有蛋白的一面，用保鲜膜包好NC膜，蛋白面紧贴X光片，置暗 盒中曝光30s，取出后依次显影、洗涤、定影。最后用清水冲洗胶片，晾干保存。1. 4间接ELISA试验最佳条件的选择1. 4. 1重组pET28a_NSP7蛋白最佳包被浓度和抗体最佳稀释度的确定采用棋盘法测定，以pH9. 6的磷酸盐缓冲液将抗原纯化后的重组pET28a_NSP7 蛋白分别稀释至终浓度为0. 5，1.0，2.0，4.0，6. 0和8.0μβ/πι1，37τ作用2h包被。然后 用含 0.05% 吐温 80 的 0.05moL/LPBS (简称 PBST，pH 为 7.2)洗 5minX3 次。加入含 牛血清白蛋白(BSA)的PBST，200yL/孔，37°C 2h封闭，洗涤后加入1 100、1 200、 1 400、1 800稀释的PRRSV标准阳性血清和标准阳性血清，100 μ L/孔，37°C lh，洗涤后 加入1 20000稀释的酶标抗体HRP-SPA，100 μ L/孔，37°C Ih,洗涤后加入TMB底物溶液， 100 μ L/孔，370C IOmin0加入2M的H2S0450 μ L/孔终止反应，于酶标仪OD450读数，每个稀 释度重复一次，取其平均值。以阳性血清OD值达到并接近1. 0，Ρ/Ν值较大的所在孔的抗原 浓度和血清稀释度作为最佳抗原工作浓度和血清稀释度。1.4. 2封闭液的选择以最适抗原浓度37°C 2h包被酶标板，洗涤后，分别用含BSA、5%脱脂乳和2% 明胶的PBST 20(^17孔37°0封闭21!，阳性血清按1 100进行稀释，进行ELISA测定，比 较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的封闭液。1.4. 3封闭时间的选择以最适抗原浓度37°C 2h包被酶标板，洗涤后，用合适的封闭液200 μ L/孔，分成3 组，分别为37°C封闭lh，37°C 2h，37°C 3h。封闭后，阳性血清按本章1.4. 1确定稀释倍数， 进行ELISA测定，其它步骤同本章1. 4. 1。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的封闭时间。 1.4.4待检血清作用时间的选择酶标板按选择的条件包被、封闭后，加入待检血清，37°C分别作用0. 5、1、1. 5和 2h，进行ELISA测定，其它步骤同本章1. 4. 3。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选 择合适的血清作用时间。1.4.5酶标抗体工作浓度的选择待检血清按本章1.4. 4确定的时间作用后，将酶标抗体分1 5000、1 10000、 1 15000和1 20000稀释，100 μ L/孔，其它步骤同本章1.4. 4，进行ELISA测定，比较各 组阴、阳性血清的OD值和Ρ/Ν值，以选择合适的酶标抗体工作浓度。1.4.6酶标抗体作用时间的选择将酶标抗体按确定好的稀释倍数加入酶标板后，37°C分别作用0. 5，1和1. 5h，其 他步骤同本章1. 4. 5，进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适 的酶标抗体作用时间。1.4. 7底物最佳显色时间的选择酶标抗体按确定好的时间作用、洗涤、加入底物后，37°C分别作用5、10和15min， 用2M H2S0450 y L/孔终止后读数，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的底 物显色时间。1.4.8临界值确定取50份PRRSV阴性猪血清1 100稀释，加入到酶标条上，37°C作用1小时，PBST 洗涤5次；每孔加入100微升1 20000稀释的二抗，37°C作用0. 5小时，PBST洗涤5次； 加入100微升底物TMB进行显色，37°C显色作用10分钟，然后用2M的硫酸终止；450nm波 长测定OD值。这些血清数据经统计学分析，得到OD45tl平均值X和标准SD。根据统计学原 理，样品S/P值> X+3SD者判为阳性，S/P值< X+2SD者判为阴性，介于两者之间者判为可 疑。1.5特异性试验分别取猪瘟病毒(张长龙严宝英等，2009)、口蹄疫病毒(张长龙严宝英等，2009)、 圆环病毒(邓位喜、高洪等，2007)和脑心肌炎病毒(EMCV)(韩研妍、李玉峰等，2007)阳性 血清，按1 100稀释后应用NSP7建立的间接ELISA方法进行测定，同时设立标准阴、阳性 血清对照。1. 6与商品化ELISA试剂盒检测符合率取30份临床血清，应用本发明建立的ELISA方法检测，同时与商品化IDEXX试剂 盒和韩国JENO公司的VDPro试剂盒检测结果进行比较。分析比较三种检测结果的差异。猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7表达蛋白ELISA方法的建立。应用表达的NSP7蛋 白建立的ELISA方法具有很好的敏感性和特异性，该抗原与猪瘟病毒(张长龙严宝英等， 2009)、口蹄疫病毒(张长龙严宝英等，2009)、圆环病毒(邓位喜、高洪等，2007)和脑心肌炎 病毒(EMCV)(韩研妍、李玉峰等，2007)阳性血清反应呈阴性，说明此方法特异性良好。批 内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5. 84%和6. 21%，表明本方法具有较好的 特异性和重复性。应用本方法对30份血清样品进行检测，该方法检测结果与IDEXX和韩国 JENO公司的VDPro试剂盒符合率分别为为93. 3%和90%。
权利要求
猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7重组蛋白，是通过以下方法表达获得的1.1NSP7基因的扩增、克隆和鉴定设计两对引物，上游引物P1CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，下游引物P2TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；分别引入Not I和BamH I酶切位点，以PRRSV的cDNA产物为模板进行PCR扩增，获得NSP7蛋白目的基因条带，将扩增的目的条带克隆至pET 28a载体，获得重组质粒pET 28a NSP7；1.2NSP7蛋白的表达和纯化将重组质粒pET 28a NSP7转化入大肠杆菌BL21中，涂布氨苄青霉素抗性培养皿，37℃过夜培养；挑取单个菌落接种3毫升LB培养基，37℃过夜振荡培养；第二天取1％的过夜培养物接种新鲜LB培养基，当细菌浓度OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度1.5mmol/L IPTG，诱导4h诱导表达基因工程重组菌500ml，离心收集菌体，诱导后的细菌按每100mL菌液加入5mL PBS重悬菌体沉淀，经超声裂解后，按按照Invitrogen公司Ni NTA试剂盒说明书进行亲和层析纯化，收获NSP7重组蛋白。
2.用权利要求1所述NSP7蛋白建立的ELISA检测方法，包括1)用权利要求1所述的重组NSP7蛋白包被ELISA板，2%牛血清白蛋白(BSA)封闭；2)对待检血清用PBS进行1 100稀释后，每孔加入稀释后的待检血清100微升，37°C 作用1小时，PBST洗涤5次；2)对酶标二抗用PBS进行1 20000稀释后，每孔加入100微升稀释的酶标二抗，37°C 作用0. 5小时，PBST洗涤5次；3)加入底物TMB进行显色，37°C显色作用10分钟，然后用50微升2M的硫酸终止；4)于450nm波长测定OD值，经统计学分析，得到0D450平均值X和标准差SD；5)结果判定血清样品S/P^ X+3SD者判为阳性，S/P ( X+2SD者判为阴性，介于两者判 为可疑，S待检样品的OD值，P阳性对照的OD值。
全文摘要
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA抗体的检测方法，属于高新生物技术领域。以纯化的PRRSV重组NSP7蛋白作为包被抗原，通过一系列反应条件优化，建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。该抗原与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪伪狂犬(PRV)和猪2型圆环病毒阳性血清反应呈阴性，该方法特异性良好，具有较好的特异性和重复性。应用本方法对30份血清样品进行检测，检测结果与IDEXX和韩国JENO公司的VDPro试剂盒符合率分别为为93.3％和90％。表明本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性，适于大规模检测PRRSV血清抗体的流行病学调查。
文档编号G01N33/543GK101948515SQ201010278518
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者刘婷婷, 姜平, 李玉峰 申请人:南京农业大学