专利名称：16个基因座快速复合pcr扩增荧光检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测人类基因组DNA中多个STR基因座的试剂盒，具体涉及一种 检测15个STR基因座和1个性别鉴定基因座的快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒，属于生 物检测技术领域。
背景技术：
短串联重复序列基因座(STR)是目前普遍应用的遗传标记。90年代初STR基因 座多态性的发现，特别是由于STR基因座的片段小、容易扩增，适宜于检验微量和降解检 材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等 优点。尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性，因此法医学 界以及一些大的公司均投入大量的资金对其进行了开发性的研究。90年代中后期以美国 ABI公司为代表的研发商建立起了荧光复合扩增体系。目前最具代表性的是ABI (Applied Biosystems, USA)公司的 Identifilerll^nPromega(USA)公司的 PowerPlex-16 荧光检测 试齐U盒。法医DNA分析就是利用DNA分型技术，确定现场法医物证的DNA基因型，并应用同 样技术确定犯罪嫌疑人的DNA基因型，通过两者的比对，从而认定犯罪事实或排除犯罪嫌 疑。随着法医DNA分型技术的发展，目前已经能对类似血痕、精斑、唾液斑、毛发、骨骼等进 行DNA分型，达到认定水平，成为刑事技术中科技含量最高、实用性最强的方法之一，检验 结果得到了司法机关特别是审判机关的普遍采信，DNA分型技术成为刑事侦查和法庭审判 的最重要依据之一。目前的STR分型技术，往往包括样本检材的DNA提取、PCR扩增和分型检测三项主 要操作步骤，获得一个样本的最终分型结果往往需要8个小时以上。缩短样本DNA检验时 间，在实际检案中将有利于快速锁定犯罪嫌疑人，或排除无辜人员，在案件侦破过程中具有 重要意义，已经成为科研攻关的一个新的重点，是法庭科学DNA分型技术发展的必然方向。
发明内容
本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够缩短获得样本 最终分型结果时间的16基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒。为了实现上述目，采取的技术方案一种16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测 试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的混合物，热启动快 速Taq酶，16对引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括用于基因分型的对应于15个STR基因座和Amelogenin性 别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标；所述的16 个基因座为Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、 D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21Sll、TP0X、TH01、CSFlP0、vWA、FGA。本发明提供了荧光标记复合扩增体系的基因座组合设计方案。本发明分别选用了蓝、绿、黄、红、橙5色荧 光组合方案。这种基因座组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这16个基因座在同一 反应中扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在400bp以内而实现高灵敏度。确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，自行设计出基因座组合 方式，以下为其中三种产品组合方式，第一种Amelogenin, D3S1358、D13S317、D7S820和 D16S539 一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM ；TPOX、THOl、D2S1338、CSFlPO 为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX ；vffA, D5S818、FGA、D6S1043为一组，采 用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色 荧光染料标记，荧光标记物为ROX ；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。第二种 Amelogenin、D3S1358、D13S 317、D7S820、D16S539 和 D6S1043 为一组，采用蓝色荧光染料标 记，荧光标记物为6-FAM ；TP0X、TH01、D2S1338和CSFlPO为一组，采用绿色荧光染料标记，荧 光标记物为HEX ；vWA、D5S818和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA ； D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为R0X。第三种 Amelogenin, D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539 和 CSFlPO —组，采用蓝色荧光染料标记， 荧光标记物为6-FAM ；TPOX、THOl、D2S1338和D6S1043为一组，采用绿色荧光染料标记，荧 光标记物为HEX ；vWA、D5S818和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA ； D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为R0X;内标选用橙 色荧光标记，荧光标记物为SIZ。进一步，使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件PCR扩增体系的PH值 为8. 0-9. 0，镁离子浓度为1. 5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300 μ M，牛血清蛋白在 所述PCR扩增体系中的终浓度为0. 1-lmg/ml,以及热启动快速Taq酶的用量为0. 1-0. 4U/ μ L，16对引物混合物中的单对引物终浓度为0. 2-2. 0μΜο进一步，使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体 系中同时扩增15个STR基因座和1个性别鉴定基因座。所述的16对引物为分别位于所述16个基因座两侧并用于扩增该基因座的引物， 其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。所述16个基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细 管电泳进行检测。进一步地，其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿 抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ；所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血液/ 口腔拭子样本、FTA卡血液/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、精斑、唾液斑、 毛发或骨骼检材。进一步地，使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR 仪上进行，扩增程序94-98 0C 30-120s ；26-32 个循环的 94-98 °C l_15s，55-65 °C 5_30s， 72°C 5-30s ；72°C l_5min，扩增约需时 40_50min。本发明实施例的有益效果是使用现常用商品化试剂盒进行PCR扩增常需要3h左 右的时间；而使用本发明的试剂盒，进行40-50min的PCR扩增，即可进一步进行遗传分析仪 检测，完成STR分型检测，大大缩短了获得样本最终分型结果的时间。
图1是本发明的试剂盒基因座排布1对血斑来源DNA扩增后的分型结果；图2是本发明的试剂盒基因座排布1对精斑来源DNA扩增后的分型结果；图3是本发明的试剂盒基因座排布1对唾液来源DNA扩增后的分型结果；图4是本发明的试剂盒基因座排布1对脱落细胞来源DNA扩增后的分型结果；图5是本发明的试剂盒基因座排布1对肌肉组织来源DNA扩增后的分型结果；图6是本发明的试剂盒基因座排布1对毛发来源DNA扩增后的分型结果；图7是对照-常规荧光标记STR复合扩增检测系统对血斑来源DNA扩增后的分型 结果；图8是对照-常规荧光标记STR复合扩增检测系统对精斑来源DNA扩增后的分型
结果；图9实施例3对肌肉来源DNA扩增后的分型结果；图10实施例4对毛发来源DNA扩增后的分型结果；图11实施例5亲子鉴定分型结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。实施例1 16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒检测提取纯化的DNA样本，基因座 排布按第一种排布。即排布方式为Amelogenin, D3S1358、D13S317、D7S820 和 D16S539 一 组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM ；TPOX、THOl、D2S1338和CSFlPO为一组， 采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX ；vWA、D5S818、FGA和D6S1043为一组，采用黄色 荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料 标记，荧光标记物为ROX ；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。1、各种检材样品由X X公安局提供。2、各种检材的基因组DNA提取各种检材基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》 进行。3、扩增和扩增产物的检测分析3. 116基因座快速PCR荧光检测试剂盒3. 1. IPCR 扩增体系:
权利要求
一种16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的混合物，热启动快速Taq酶，16对引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括用于基因分型的对应于15个STR基因座和1个性别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标；所述的16个基因座为Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、TPOX、TH01、CSF1PO、vWA、FGA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的16个基因座分为4组，并分别用 4中不同的颜色的荧光染料进行标记，分组方式为Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820 和D16S539 —组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM ；TPOX、THOU D2S1338和 CSFlPO为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX ；vWA、D5S818、FGA和D6S1043为 一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采 用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX ；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的16个基因座分为4组，并分 别用4中不同的颜色的荧光染料进行标记，分组方式为=AmeIogeniru D3S1358、D13S317、 D7S820、D16S539和D6S1043为一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM ；ΤΡ0Χ、 THOl、D2S1338和CSFlPO为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX ；vWA、D5S818 和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51为 一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX ；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为 SIZ。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的16个基因座分为4组，并分 别用4中不同的颜色的荧光染料进行标记，分组方式为=AmeIogeniru D3S1358、D13S317、 D7S820、D16S539和CSFlPO为一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM ；ΤΡ0Χ、 TH0UD2S1338和D6S1043为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX ；vWA、D5S818 和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA ；D8S1179、D21S11和D18S51为 一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX ；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为 SIZ。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于使用所述的试剂盒进行PCR 复合扩增反应的条件PCR扩增体系的pH值为8. 0-9. 0，镁离子浓度为1. 5-3. 5mM，4种dNTP 的终浓度各为200-300 μ Μ,牛血清蛋白在所述PCR扩增体系中的终浓度为0. 1-lmg/ml, 以及热启动快速Taq酶的用量为0. 1-0. 4U/ μ L，16对引物混合物中的单对引物终浓度为 0. 2-2. 0 μ Μ。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增 阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增15个STR基因座和Amelogenin性别鉴定基 因座。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的16对引物为分别位于所述16个 基因座两侧并用于扩增该基因座的引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述16个基因座的复合扩增采用聚合 酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
9.根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于其中所检测的人基因组DNA 为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ；所述的 来源样本为来源于人类的滤纸片血液/ 口腔拭子样本、FTA卡血液/ 口腔拭子样本、口腔 拭子样本、血液/痕、组织、精斑、唾液斑、毛发或骨骼检材。
10.根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于使用所述的试剂盒进行PCR 扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增时间40分钟至1小时。
全文摘要
本发明公开了一种检测人类基因组DNA 16个基因座的快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的反应混合物，热启动快速Taq酶，16对引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括用于基因分型的等位基因混合物和内标。本发明只需对人基因组DNA样本进行约40-50min的核酸扩增，即可进行STR分型检测，单管扩增检测可以同时获得15个STR基因座和1个性别鉴定基因座的分型结果，大大缩短了获得样本最终分型结果的时间。
文档编号G01N21/64GK101956008SQ20101028241
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者倪峥飞, 周怀谷, 夏子芳, 杜蔚安, 杨辉, 郑卫国, 陶莉 申请人:无锡中德美联生物技术有限公司;上海市公安局物证鉴定中心