专利名称：利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测土壤中抗生素残留的方法。
背景技术：
抗生素是世界上用量最大、使用最广泛的药物之一。我国每年有成千上万吨的抗 生素类药物被用于畜禽养殖业和人的医疗中。然而，大部分抗生素不能完全被机体吸收，有 高达85%以上抗生素以原形或代谢物形式经由病人和畜禽粪尿排入环境，经不同途径对环 境造成污染。土壤是抗生素重要的归属场所，虽然抗生素在环境中存在浓度极低，但其对环 境的影响不容忽视。抗生素及其代谢产物在土壤中能维持很长时间的活性，对土壤中的微 生物、植物、动物均产生不同程度的影响。因此，我们要对土壤中的抗生素残留进行监测。 然而，土壤样品非常复杂，里面抗生素的含量往往又很低，因此，在仪器检测之前，样品前处 理是极为重要的步骤。传统的检测土壤中抗生素残留的方法中样品前处理大多需要多次操 作，需要消耗大量有机溶剂，花费大量时间，而且选择性较低。分子印迹技术是从仿生角度，采用人工方法制备对特定分子具有特异性结合作用 和特定空间结构空穴的聚合物——分子印迹聚合物。近年来，材料科学和分离技术两大领 域的研究发展大大推动了分子印迹技术的发展。由于分子印迹聚合物具有构象预定性、特 异识别性、长期稳定性及实施简便性等优点，在分离提纯、免疫分析、以及生物模拟传感器 等许多方面显示出广泛的应用前景。基质固相分散是一种新的萃取净化技术，其优点在于依靠机械剪切力和分散剂 的去垢效应及巨大的表面积使样品结构破碎并且在填料表面均勻分散，简化了传统检测方 法中前处理的过程，避免了样品勻浆、转溶、乳化、浓缩等造成的待测物损失，提高了净化效 率。然而，常用的基质固相分散技术所用的分散剂为硅胶、氧化铝、C18、佛罗里硅等，缺乏选 择性。
发明内容
本发明要解决目前检测土壤中抗生素残留的方法中样品前处理过程复杂，费时， 选择性低的问题，提供利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法。本发明利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，按以下步骤进行 一、制备选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物；二、将土壤样品与步骤一制备的分子印迹 聚合物置于研钵中，研磨5 20min，混合均勻，土壤样品与分子印迹聚合物的质量比为 1 1 4;三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混 合物转入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用淋洗剂以1 2mL/min的流速淋洗，柱中土壤 样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为Ig 5 20mL;四、然后浙干，用洗 脱剂以1 2mL/min的流速洗脱，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体 积比为Ig 5 20mL，得到洗脱液；五、在30 50°C条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得 到残渣；六、用1. OmL的溶剂溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测；
4其中步骤三中的淋洗剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇、乙 醇或乙腈中的任意一种占淋洗剂总体积的10% 50% ；步骤四中的洗脱剂为甲醇、乙醇或 乙腈中的任意一种与醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的 5% ；步骤六中的溶剂 为甲醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇或乙腈中的任意一种占溶剂总体 积的20% 60%。本发明以选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物作为基质固相分散技术中的分散 剂，并将基质固相分散技术用于检测土壤中抗生素残留，简化了检测中前处理的步骤，节省 了时间，降低了有机溶剂的消耗，并且大大提高了检测分析方法的选择性。使用本发明的方 法，经检测抗生素在土壤中的加标回收率为70% 95%，精密度(RSD)小于15%，抗生素在 土壤中的检出限为2 IOng · g—1。
图1为青霉素V与具体实施方式
十一步骤一制备的分子印迹聚合物的结合等温 线图；图2为评价青霉素V与具体实施方式
十一步骤一制备的分子印迹聚合物结合性质的 Scatchard曲线图；图3为具体实施方式
十一得到的液相色谱串联质谱图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的 方法，按以下步骤进行一、制备选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物；二、将土壤样品与 步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨5 20min，混合均勻，土壤样品与分子印 迹聚合物的质量比为1 1 4;三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品 和分子印迹聚合物的混合物转入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用淋洗剂以1 2mL/ min的流速淋洗，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为Ig 5 20mL ；四、然后浙干，用洗脱剂以1 2mL/min的流速洗脱，柱中土壤样品和分子印迹聚合物 的总质量与洗脱剂的体积比为Ig 5 20mL，得到洗脱液；五、在30 50°C条件下用氮气 将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1. OmL的溶剂溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串 联质谱分析，即完成检测；其中步骤三中的淋洗剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与去离 子水的混合溶液，甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种占淋洗剂总体积的10% 50% ；步骤四 中的洗脱剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的
5% ；步骤六中的溶剂为甲醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇或乙 腈中的任意一种占溶剂总体积的20% 60%。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中制备选择性 吸附抗生素的分子印迹聚合物的具体步骤为a、将抗生素作为模板分子与溶剂以及功能单 体混合，搅拌30 120min，得到预组装溶液，抗生素与功能单体的摩尔比为1 4 10，抗 生素的质量与溶剂的体积比为Ig 10 80mL ;b、然后向预组装溶液中加入交联剂和引发 剂，混勻，预组装溶液中的抗生素与交联剂的摩尔比为1 10 30，引发剂的质量与预组 装溶液中溶剂的体积比为Ig 100 500mL ；c、然后超声处理5 20min，再冲入氮气除氧5 20min，然后密封，置于40 70°C环境下加热12 36h，得产物；d、然后将产物研磨，置 于索氏提取器中，用洗脱剂反复洗脱，至洗脱液经紫外光谱或色谱检测后无抗生素为止，然 后于60 90°C干燥至恒重，即得到选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物；其中步骤a中的 溶剂为去离子水、甲醇、乙醇或乙腈，步骤a中的功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、4-乙烯吡 啶或丙烯酰胺，步骤b中的交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯， 步骤b中的引发剂为偶氮二异丁腈，步骤d中的洗脱剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与 醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的20% 25%。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二中研磨 10 15min。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤二中土 壤样品与分子印迹聚合物的质量比为1 2 3。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤三中用 淋洗剂以lmL/min的流速淋洗。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤三中柱 中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为Ig 10 15mL。其它与具体 实施方式一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤四中用 洗脱剂以lmL/min的流速洗脱。其它与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤四中柱 中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体积比为Ig 10 15mL。其它与具体 实施方式一至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤五中在 40 V条件下用氮气将得到的洗脱液吹干。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方 法，按以下步骤进行一、制备选择性吸附金霉素的分子印迹聚合物将Immol金霉素作为 模板分子与IOmL乙醇以及IOmmol甲基丙烯酸混合，搅拌30min，得到预组装溶液；然后向 预组装溶液中加入26mmol 二甲基丙烯酸乙二醇酯和0. 06g偶氮二异丁腈，混勻；然后超声 处理15min，再冲入氮气除氧lOmin，然后密封，置于60°C环境下加热24h，得产物；然后将产 物研磨，置于索氏提取器中，用25% (体积)醋酸的甲醇溶液反复洗脱，至洗脱液经色谱检 测后无金霉素为止，然后于70°C干燥至恒重，即得到选择性吸附金霉素的分子印迹聚合物； 二、将0. 2g土壤样品与0. 5g步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨lOmin，混合均 勻；三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转 入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用8mL的20% (体积)的甲醇水溶液以lmL/min的流 速淋洗；四、然后浙干，用8mL的3% (体积)醋酸的甲醇溶液以lmL/min的流速洗脱，得到 洗脱液；五、在40°C条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1. OmL的25% (体 积)的甲醇水溶液溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测。本实施方式得到的金霉素在土壤中的加标回收率为82. 4% 91.9%，精密度 (RSD)小于10.4%，测定的线性范围为15 1500ng· 金霉素在土壤中的检出限为 4. Ing · g-1。
具体实施方式
十一本实施方式利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的 方法，按以下步骤进行一、制备选择性吸附青霉素V的分子印迹聚合物将Immol青霉素V 作为模板分子与8mL乙醇以及Smmol甲基丙烯酸混合，搅拌30min，得到预组装溶液；然后 向预组装溶液中加入20mmol 二甲基丙烯酸乙二醇酯和0. 05g偶氮二异丁腈，混勻；然后超 声处理lOmin，再冲入氮气除氧lOmin，然后密封，置于60°C环境下加热24h，得产物；然后将 产物研磨，置于索氏提取器中，用20% (体积)醋酸的甲醇溶液反复洗脱，至洗脱液经色谱 检测后无青霉素V为止，然后于60°C干燥至恒重，即得到选择性吸附青霉素V的分子印迹 聚合物；二、将0. 5g 土壤样品与Ig步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨lOmin， 混合均勻；三、在一个空萃取柱的底层置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混 合物转入柱内，在上面再加一块筛板，压实，用IOmL的10% (体积)的甲醇水溶液以ImL/ min的流速淋洗；四、然后浙干，用IOmL的5% (体积)醋酸的甲醇溶液以lmL/min的流速 洗脱，得到洗脱液；五、在40°C条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1. OmL 的20% (体积)的甲醇水溶液溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检 测。本实施方式得到的青霉素V在土壤中的加标回收率为79. 2% 89. 7%，精密度 (RSD)小于8. 2 %，测定的线性范围为20 2000ng · g—1，青霉素V在土壤中的检出限为 5. 5ng ^g10图1为青霉素V与本实施方式步骤一制备的分子印迹聚合物的结合等温线图，纵 坐标中Q为结合到分子印迹聚合物上的青霉素V的量。由图1可知，随着青霉素V初始浓 度的增加，所制备的分子印迹聚合物对青霉素V的吸附量也逐渐增大，说明分子印迹聚合 物对青霉素V具有很强的选择性吸附作用。图2为评价青霉素V(PENV)与本实施方式步骤一制备的选择性吸附青霉素V的分 子印迹聚合物结合性质的Scatchard曲线图。由图2中的Scatchard曲线可知，Q/[PENV] 对Q明显是非线性关系，表明该分子印迹聚合物对青霉素V的结合位点并不是等价的，但 是，在图的两端分别有较好的线性关系，这表明在所研究的青霉素V浓度范围内，所制备的 分子印迹聚合物主要存在两类不同的结合位点，即高亲和力结合点和低亲和力结合点。根 据公式(Q/[PENV]) = (Qmax-Q)/Kd (其中Q为结合到选择性吸附青霉素V的分子印迹聚合物 上的PENV的量，[PENV]为青霉素V在吸附溶液中的平衡浓度，Kd为结合位点的离解常数， Qmax 为最大表观结合量)，可以得到 Kdl = 461. Oymol- L-1，Qmaxl = 47. O μ mol · g-1 ；Kd2 = 2330 μ mol · L-1，Qmax2 = 125. 2 μ mol · g—1。由此结果可知，分子印迹聚合物对青霉素V的吸 附量很大。图3为本实施方式得到的液相色谱串联质谱图。由图3可知，在测定过程中，没有 产生任何干扰，说明本发明的检测方法抗干扰能力强。并且测定谱图的基线平稳，充分说明 了本发明的方法选择性很高。
权利要求
1.利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于利用基质固相分 散技术检测土壤中抗生素残留的方法，按以下步骤进行一、制备选择性吸附抗生素的分子 印迹聚合物；二、将土壤样品与步骤一制备的分子印迹聚合物置于研钵中，研磨5 20min， 混合均勻，土壤样品与分子印迹聚合物的质量比为1 1 4;三、在一个空萃取柱的底层 置一块筛板，然后把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转入柱内，在上面再加一块筛板， 压实，用淋洗剂以1 2mL/min的流速淋洗，柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与 淋洗剂的体积比为Ig 5 20mL;四、然后浙干，用洗脱剂以1 2mL/min的流速洗脱，柱 中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体积比为Ig 5 20mL，得到洗脱液； 五、在30 50°C条件下用氮气将得到的洗脱液吹干，得到残渣；六、用1. OmL的溶剂溶解残 渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测；其中步骤三中的淋洗剂为甲醇、乙 醇或乙腈中的任意一种与去离子水的混合溶液，甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种占淋洗剂 总体积的10% 50% ；步骤四中的洗脱剂为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与醋酸的混合 溶液，醋酸占洗脱剂总体积的 5% ；步骤六中的溶剂为甲醇或乙腈中的任意一种与去 离子水的混合溶液，甲醇或乙腈中的任意一种占溶剂总体积的20% 60%。
2.根据权利要求1所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其 特征在于步骤一中制备选择性吸附抗生素的分子印迹聚合物的具体步骤为a、将抗生素作 为模板分子与溶剂以及功能单体混合，搅拌30 120min，得到预组装溶液，抗生素与功能 单体的摩尔比为1 4 10，抗生素的质量与溶剂的体积比为Ig 10 80mL ;b、然后 向预组装溶液中加入交联剂和引发剂，混勻，预组装溶液中的抗生素与交联剂的摩尔比为 1 10 30，引发剂的质量与预组装溶液中溶剂的体积比为Ig 100 500mL ;c、然后超 声处理5 20min，再冲入氮气除氧5 20min，然后密封，置于40 70°C环境下加热12 36h，得产物；d、然后将产物研磨，置于索氏提取器中，用洗脱剂反复洗脱，至洗脱液经紫外 光谱或色谱检测后无抗生素为止，然后于60 90°C干燥至恒重，即得到选择性吸附抗生素 的分子印迹聚合物；其中步骤a中的溶剂为去离子水、甲醇、乙醇或乙腈，步骤a中的功能单 体为丙烯酸、甲基丙烯酸、4-乙烯吡啶或丙烯酰胺，步骤b中的交联剂为二甲基丙烯酸乙二 醇酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，步骤b中的引发剂为偶氮二异丁腈，步骤d中的洗脱剂为 甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种与醋酸的混合溶液，醋酸占洗脱剂总体积的20% 25%。
3.根据权利要求1或2所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法， 其特征在于步骤二中研磨10 15min。
4.根据权利要求3所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特 征在于步骤二中土壤样品与分子印迹聚合物的质量比为1 2 3。
5.根据权利要求4所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特 征在于步骤三中用淋洗剂以lmL/min的流速淋洗。
6.根据权利要求5所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特 征在于步骤三中柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与淋洗剂的体积比为Ig 10 15mL0
7.根据权利要求6所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特 征在于步骤四中用洗脱剂以lmL/min的流速洗脱。
8.根据权利要求7所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特征在于步骤四中柱中土壤样品和分子印迹聚合物的总质量与洗脱剂的体积比为Ig 10 15mL0
9.根据权利要求8所述的利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，其特 征在于步骤五中在40°C条件下用氮气将得到的洗脱液吹干。
全文摘要
利用基质固相分散技术检测土壤中抗生素残留的方法，涉及一种检测土壤中抗生素残留的方法。本发明要解决目前检测土壤中抗生素残留的方法中样品前处理过程复杂，费时，选择性低的问题。方法一、制备分子印迹聚合物；二、将土壤样品与分子印迹聚合物研磨，混合均匀；三、把土壤样品和分子印迹聚合物的混合物转入萃取柱内，用淋洗剂淋洗；四、沥干，洗脱，得到洗脱液；五、用氮气将洗脱液吹干，得到残渣；六、溶解残渣，过滤后进行色谱或色谱串联质谱分析，即完成检测。本发明简化了检测中前处理的步骤，节省了时间，降低了有机溶剂的消耗，并且大大提高了检测分析方法的选择性。应用于抗生素残留检测领域。
文档编号G01N30/02GK102135527SQ20101061766
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者佟佳, 王霆, 陈立钢 申请人:东北林业大学