专利名称：一种外源基因的示踪体系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种外源基因的示踪体系及其应用。
背景技术：
在生物技术领域中，转基因技术是最为常用且必不可少的手段。但在进行外源基因的转染后，如何观察外源基因进入细胞的效率，以及外源基因在细胞内的存在或运动情况也是本领域需要关注的。通过PCR扩增以及电泳鉴定尽管能够鉴定外源基因是否转入，但是其转入后在细胞内的存在情况却没有办法得知，也即无法在活体的情况下根据需要动态地观察外源基因在不同阶段在细胞中所处的位置和运动情况通过同位素、荧光素或染料来进行细胞标记也已经被本领域人员使用。然而，目前用于进行标记的染料有许多种，有些染料对于细胞有一定的毒性。有些染料之间存在串色现象，在多于ー种染料同时应用时常常分辨率不高，观察效果并不理想。目前，对于非病毒基因输送体系的研发是分子治疗领域的热点。有效安全的基因输送载体将突破基因治疗的瓶颈给广大患者带来福音。在研究开发新型的非病毒基因载体的过程当中，确定非病毒基因载体及外源基因在细胞内的运动及表达、寻找其中的限速歩骤借以改进载体是ー个很重要的挑战。在外源基因最終表达之前，几个步骤最为关键①细胞内吞外源DNA在胞质内的运输；(DDNA入核外源基因表达，这就需要利用标记技术将外源基因进行标记，确定外源基因在细胞内的分布、运动及表达。但目前尚无同时分别标记外源基因、细胞膜、细胞核，利用共定位的方法研究外源DNA在细胞内的分布、运动并不踪外源基因表达的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外源基因的示踪体系及其应用。在本发明的第一方面，提供一种外源基因的细胞内示踪方法，所述方法包括(I)以Cy5荧光素标记外源基因(或携帯外源基因的质粒载体)，将经过标记的外源基因转入细胞内；(2)以染料Hochest标记细胞的细胞核；(3)以染料 Alexa Fluor 594 麦胚凝集素(Alexa Fluor 594 wheatgermagglutinin)标记细胞膜；和(4)以细胞中的灰色荧光标记的细胞核以及红色荧光标记的细胞膜为參照，观察蓝色荧光标记的外源基因在细胞内的分布或运动情况。在另ー优选例中，步骤⑵在步骤⑶之前；或步骤⑶在步骤⑵之前；或步骤
(2)和步骤(3)同时进行。在另ー优选例中，所述的外源基因存在于质粒载体中。在另ー优选例中，所述的以Cy5荧光素标记外源基因的方法是
将Cy5 突光素(较佳地为 Label IT TrackerTM Reagent IntracellularNucleicAcid Localization Kit-Cy 5)与外源基因共孵育后，加入NaCl和无水こ醇，静置、离心取沉淀，洗涤后收集沉淀，获得Cy5荧光素标记的外源基因。在另ー优选例中，所述的以染料Hochest标记细胞的细胞核的方法是在细胞中加入染料Hochest (较佳地为Hoechst 33342)标记溶液(较佳地
2.0±0. 5 μ g/ml)，共孵育(较佳地孵育2-15分钟，更佳地孵育8_10分钟)，收集细胞并洗涤(较佳地用HBSS清洗)，获得细胞核标记染料Hochest的细胞。
在另ー优选例中，所述的以染料Alexa Fluor 594麦胚凝集素标记细胞膜的方法是在细胞中加入Alexa Fluor 594麦胚凝集素标记溶液(较佳地4_13 μ g/ml ;更佳地5-11 μ g/ml ;更佳地5-10 μ g/ml),共孵育(较佳地孵育5_15分钟,更佳地孵育8_10分钟)，收集细胞并洗涤(较佳地用HBSS清洗)，获得细胞膜标记染料Alexa Fluor 594麦胚凝集素的细胞。在另ー优选例中，通过激光共聚焦显微镜观察或拍摄外源基因在细胞内的分布、运动或表达情況。在另ー优选例中，在标记后0-4小时内进行观察或拍摄；更优选地，进行活体实时跟足示拍摄。在另ー优选例中，当进行拍照时,采用Alexa Fluor 594麦胚凝集素标记溶液的浓度是5±1 μ g/ml ;当进行摄像或实时活体观察时,采用Alexa Fluor 594麦胚凝集素标记溶液的浓度是lOiSyg/ml。在另一优选例中，经过标记的细胞放在4 0C冰箱保存。在另ー优选例中，荧光素Cy5的激发光波长为649nm，发射光波长为670nm ；染料Hoechst的激发光波长为350nm，发射光波长为461nm ;或染料Alexa Fluor 594麦胚凝集素的激发光波长为591nm，发射光波长为618nm。在另ー优选例中，所述的外源基因是绿色荧光蛋白的编码基因；其表达后获得的蛋白显示绿色荧光。在另ー优选例中，绿色荧光蛋白的激发光波长为488nm，发射光波长为509nm。在另ー优选例中，通过观察细胞内的绿色荧光来分析蛋白的表达情況。在另ー优选例中，将经过标记的外源基因转入细胞内采用的转染试剂选自但不限于PEI-25kDa、Lipo2000 或 PEI_-CyD。在本发明的另一方面，提供ー种试剂盒，所述试剂盒用于对外源基因进行细胞内示踪，其中含有Cy5荧光素、染料Hochest和染料Alexa Fluor 594麦胚凝集素。在另ー优选例中，所述试剂盒中还含有选自以下的一种或多种试剂标记缓冲液，灭菌水，氯化钠，こ醇，洗涤剂或转染试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有使用说明书。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I、PEI_25KDa同pEGFP复合物转染Hela细胞系过程24小时动态观察。图2、PEI-25kDa同pEGFP复合物转染C5. 18细胞系过程24小时动态观察。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，优化了ー种DNA细胞内示踪的方法，选择到了多种显色标记来标记DNA、细胞核以及细胞膜，从而利用共定位的方法研究外源基因在细胞内的存在以及运动情況。如本文所用，所述的“外源基因”也称为“外源DNA”，其也广义地包括携帯有外源基因的构建物、质粒(载体)。如本文所用，所述的“非病毒基因载体”、“非病毒基因输送体系”、“非病毒载体”可互換使用，是指将外源基因引导入细胞内的试剂(如转染试剂，更具体地例如Lipo2000、PEI25-kD或PEI_-CyD)，且这种试剂并非病毒类的。但是，它们不同于“质粒”、“表达载体”或“质粒载体”。本发明人已经利用荧光素Cy5标记质粒，染料Hochest标记细胞内的细胞核，染料Alexa Fluor 594麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)标记细胞膜。通过本发明的方法构建的染色标记系统可在活体的情况下根据需要动态地观察外源基因在不同阶段在细胞中所处的位置和运动情况。借助本发明的方法构建的共转系统还可以对外源基因在转染过程中的限速步骤进行较为全面的分析，并对改进外源基因输送体系提供可靠依据。本发明的标记方法简单易行、稳定可靠。因此，本发明提供了一种外源基因的细胞内示踪方法，所述方法包括(I)以Cy5荧光素标记外源基因(或携帯外源基因的质粒载体)，将经过标记的外源基因转入细胞内；⑵以染料Hochest标记细胞的细胞核；(3)以染料Alexa Fluor594wheat germagglutitin标记细胞膜；和(4)以细胞中的灰色荧光标记的细胞核以及红色荧光标记的细胞膜为參照，观察蓝色荧光标记的外源基因在细胞内的分布或运动情況。其中，步骤(2)在步骤(3)之前；或步骤(3)在步骤(2)之前；或步骤(2)和步骤(3)同时进行。本发明选用的试剂均可以在活体情况下对细胞进行显微镜下的观察，对细胞没有任何损伤。如果配合连续荧光显微镜照相系统，可以观察整个DNA转染细胞过程中，外源基因如何进入细胞膜和细胞核的过程，这对研究分析外源基因在细胞内的运动情况以及限速步骤等具有十分重要的意义。由于需要同时标记三种不同的物质外源基因，细胞膜和细胞核。这就需要选择合适的、互不干扰的染料，以避免不同染料间发生“串色”现象而影响试验的可信度。本发明人经过合理的选择和反复地验证，发现三种染料Hochest, Alexa Fluor 594 wheat germagglutinin, Cy5之间并无“串色”现象。对于外源基因的标记方法有很多种，本人以前曾经尝试过用量子点对质粒进行标记，发现该种方法比较繁琐，而且需要后续的其它试验对标记的情况进行分析和确认之后，方可用于示踪分析。而本发明的方法对外源基因的标记采用的方法较为简便，无需多余的分析确认即可直接用于示踪分析，而且经过多次试验发现本发明的方法构建的系统相对稳定。对于细胞膜和细胞核的标记方法，同样也比较方便易行。作为本发明的优选方式，所述的以Cy5荧光素标记外源基因的方法是将LabelIT Tracker Reagent Intracellular Nucleic Acid Localization Kit_Cy 5 与夕卜源基因共孵育后，加入NaCl和无水こ醇，静置、离心取沉淀，洗涤后收集沉淀，获得Cy5荧光素标记的外源基因。作为本发明的优选方式，所述的以染料Hochest标记细胞的细胞核的方法是在细胞中加入Hoechst 33342标记溶液(较佳地2. O ±O. 5 μ g/ml)，共孵育(较佳地孵育2_15分钟，更佳地孵育8-10分钟)，收集细胞并洗涤，获得细胞核标记染料Hochest的细胞。作为本发明的优选方式，所述的以染料Alexa Fluor 5944麦胚凝集素标记细胞的细胞膜的方法是在细胞中加入Alexa Fluor 5944麦胚凝集素标记溶液，共孵育，收集细胞并洗涤，获得细胞膜标记染料Alexa Fluor 5944麦胚凝集素的细胞。本发明对不同操作条件下染料Alexa Fluor 5944麦胚凝集素的使用浓度进行了优化。作为本发明的优选方式，当进行拍照时，采用Alexa Fluor 594麦胚凝集素标记溶液的浓度是5± I μ g/ml ;当进 行摄像或实时活体观察时，由于需要长时间的激发染料，避免染料淬灭，故而提高了用量，此时采用的浓度为10±3μ g/ml。以上条件下可以较大地增强染色效果，有效地提高观察或拍摄的质量。基于各种细胞具有相同或类似等结构以及细胞器，本发明对于涉及的细胞没有特别的限制，包括但不限于原核细胞、真核细胞、高等生物细胞、哺乳动物细胞、酵母。作为本发明的一种实施方式，所述的细胞是真核细胞。将经过标记的外源基因转入细胞可以采用本领域人员已知的多种方法，当细胞为原核生物如大肠杆菌时，可以采用CaCl2法或处MgCl2法理，所用的步骤在本领域众所周知；如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体法等。作为本发明的优选方式，将经过标记的外源基因转入细胞内采用的转染试剂是PEI600-CyD> PEI_25kDa 或 Lipof ectamine 2000Reagent。任何可观察荧光标记和/或染色标记的仪器及方法都可应用于本发明，以观察外源基因在细胞内的存在以及运动情況。作为本发明的优选方式，通过激光共聚焦显微镜观察外源基因在细胞内的分布或运动情况。作为本发明的优选方式，所述的突光素Cy5的激发光波长为649nm,发射光波长为670nm ;染料Hoechst的激发光波长为350nm,发射光波长为461nm ;或染料Alexa Fluor594wheat germ agglutinin的激发光波长为591nm,发射光波长为618nm。本发明还提供了一种用于对外源基因进行细胞内示踪的试剂盒，所述试剂盒中含有Cy5 突光素、染料 Hochest 和染料 Alexa Fluor 594wheat germagglutinin。任何其它对于染色或转染有用的试剂都可包含在所述的试剂盒中，其它对于质粒的复制、细胞的培养有用的试剂或培养基也可包含在所述的试剂盒中。例如，所述的试剂盒中还含有选自以下的一种或多种试剂标记缓冲液，灭菌水，氯化钠，こ醇，洗涤剂或转染试齐 。作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有使用说明书。作为本发明的优选实施方式，本发明的方法可应用于非病毒基因输送体系中基因输送情况的分析。所述的非病毒基因输送体系例如是PEI25-kDa或PEI6tltl-CyD转染的体系。本发明的方法利用不同的荧光素或染料分别标记质粒、细胞膜和细胞核，从而很容易共定位外源基因在细胞中所处的位置，分析出外源基因转染的限速步骤，借以改进非病毒基因输送体系。该示踪分析系统操作简便，稳定性重复性好，可用于DNA给药的示踪分析。利用本发明的DNA药物细胞内示踪分析方法，本发明人分析了三种非病毒基因输送体系Lipo2000、PEI25-kDa和PEI6tltl-CyD的DNA转染效率，同时将裸DNA作为对照。本发明人利用Cy5标记质粒(为蓝色荧光)，Hochest标记细胞核(为灰色荧光)，Alexa Fluor594wheat germ标记细胞膜(为红色突光)。结果发现，通过本发明的方法可在活体的情况下根据需要动态地观察外源基因在不同阶段在细胞中所处的位置和运动情况，观测效果良好。本发明采用不同的荧光素分别标记外源DNA、细胞膜和细胞核，从而很容易共定位复合物在细胞中所处的位置及运动情况，观察外源基因表达蛋白的初始时间及状态，分析出外源基因转染的限速步骤，借以改进外源基因的输送体系(如非病毒载体)，提高外源基因在靶细胞中的表达。本发明的主要创新与优势在于I)本发明的方法可以对活细胞进行染色并在显微镜下观察，换而言之，如果配合连续荧光显微镜照相系统，可以观察一段时间内外源基因在细胞内的分布与运动过程，记录外源基因的表达，这对研究分析外源基因在细胞内的限速步骤具有十分重要的意义。2)本发明的方法选择的染料之间没有“串色”现象，不影响实验的可信度。3)该系统并不会影响外源基因在细胞内的表达，换而言之，当外源基因表达绿色荧光蛋白时，该系统可以直接发现外源基因在细胞内初始表达的时间，并且也不会发生“串色现象”。这为理解外源基因在细胞内的功能表达提供了更为详细的信息。4)该方法比较简便易行且结果稳定。5)本发明的方法可以用于建立新型非病毒载体开发的有效简易示踪体系，大大推进相关实验室、制药公司及生物试剂公司在此领域的研发进程。下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆实验室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按
重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I、绿色荧光蛋白质粒pEGFP的转化、扩增与提纯I、所需主要试剂与仪器设备(I)绿色突光蛋白质粒pEGFP-Nl (简称 pEGFP,购自 Invotrogen)；(2)感受态菌DH5 α (上海生エ)；(3)LB培养基IOg胰蛋白冻，5g酵母提取物，IOgNaCl,用IL超纯水配制，pH值调到7. 2-7. 4，高温灭菌后备用； ⑷LB琼脂培养基15g琼脂加入I升LB培养基，高温灭菌后待琼脂未冷凝之吋，加入抗生素并在超净台中将培养基倒入细菌培养平板中，冷却至凝固状态后放置在4°C冰禮备用;(5)抗生素氨苄抗生素(Sigma)；(6) QIAGEN 质粒大 抽试剂盒(QIAGEN，Plasmid Maxi Kits)；(7)水浴锅DK_8D型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；(8)立式摇床SCS_24 (上海市离心机械研究所)；(9)紫外分光光度仪Nanodrop2000 (Thermo)；(10)台式水平离心机58IOR (Eppendorf)。2、质粒pEGFP的转化将I μ I质粒(3_5ng/ μ I)加入100 μ I感受态菌DH5 α，混匀，静置在冰上30分钟，将感受态菌DH5 α放入42°C的水浴锅中，热激I. 5分钟后立刻将感受态菌DH5 α放入冰上进行冷却3-5分钟，最后将感受态菌涂于含有氨苄抗生素的琼脂培养板上，放置在摇床过夜(37°C，12-16 小时)。 3、质粒pEGFP的扩增从琼脂培养板中挑取克隆后，放入含有氨苄抗生素的LB培养基中(氨苄抗生素终浓度100 μ g/ml)，放入摇床(37°C，300rpm，12-16 小时)。4、质粒pEGFP的提纯收集菌液(4°C，6000g，15min)，打开QIAGEN大抽试剂盒，加入IOml Pl重悬菌液沉淀后，加入IOml P2，来回摇晃混匀4-6次后，室温(15°C -25°C )静置5min。加入IOml预冷的P3，立刻摇晃混匀4-6次，在冰上孵育20min。离心(4°C，20000g, 30min)后将上清吸到另外ー个抽提离心管，再离心(4°C，20000g，30min)取上清。利用IOmlQBT平衡QIAGEN_tip500质粒吸附柱，然后将上清加入到吸附柱过滤。过滤之后，弃去滤液，再用30mlQC对吸附柱过柱清洗2遍。弃去滤过的清洗液QC，加入15mlQF对质粒进行洗脱，收集洗脱液后,加入
10.5ml异丙醇,混勻离心(4で，15000g, 30min)。小心弃去上清，收集质粒沉淀后，再用5ml70 % (v/v)こ醇重悬质粒沉淀，室温离心(15000g, IOmin)。得到质粒沉淀后，室温风干5-10min，再用TE缓冲液溶解质粒沉淀，利用紫外分光光度仪测量浓度和纯度。纯度A260/A280应控制在I. 6-1. 8。放在_20°C冰箱保存。实施例2、质粒DNA的荧光素标记I、所需主要试剂与仪器设备(I)Label IT Tracker Reagent Intracellular Nucleic AcidLocalizationKit-Cy 5 (Mirus)；(2) NaCl (上海市化学试剂公司)；(3)无水こ醇(上海市化学试剂公司)(4)水浴锅DK_8D型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；(5)台式水平离心机58IOR (Eppendorf)；(6)超净台VCM_420 (BI0-HAZARD)。2、质粒DNA的荧光素标记向 10 μ I I μ g/ μ I 的 pEGFP-Nl 中加入 IOXLabeling Buffer A (Mirus) 1()μ1，再加入灭菌的超纯水7 μ1，最后加入Label IT Tracker Reagent (Mirus) 5 μ I,组成10()μ1反应体系，在37°C水浴锅中，避光孵育I小时进行反应。加入1/10体积的5M的NaCl和两倍体积的无水こ醇，在-20°C冰箱中放置30分钟后，12000rpm进行离心10分钟去除未參加反应的 Label IT Tracker Reagent,用 500 μ I 70% (v/v)的こ醇清洗沉淀，12000rpm 离心 10
分钟后重新收集沉淀，弃去上清。在超净台中吹干沉淀后，用超纯水溶解沉淀，放置在-20°C冰箱，避光保存。实施例3、质粒DNA与转染试剂的复合I、转染试剂 转染试剂采用纳米非病毒基因输送体系，具体使用的材料是PEI_25kDa，为ー种商品化的转染试剂，购自Sigma公司。2、被转染细胞Hela细胞系、C5. 18细胞系，购自ATCC。3、PEI-25kDa同质粒pEGFP的复合、转染转染液的配制先将PEI_25kDa用超纯水制备成4. 5μ g/μ I的储存液，将质粒稀释成 O. 05 μ g/μ I 备用。然后根据 4. 5 μ g/ μ I PEI_25kDa = IOOnmoI/ μ I 有效“N”，I μ g/μ I质粒=3nmol/y I有效“P”进行计算。然后将40μ 1,0. 05μ g/μ I的pEGFP同相应浓度(根据N/P算出的浓度)的40 μ I的PEI-25kDa进行等体积混合，缓慢滴加并且在震荡器上以最高速度震荡20秒，室温下静置30分钟，再加入Iml无血清培养基DMEM，混匀，静置5分钟后可用。对于Hela细胞系，PEI-25kDa N/P = 20 ;对于C5. 18细胞系，PEI_25kDa N/P = 10。将Hela细胞系以IXlO5/孔，每孔Iml种于12孔板。种板24小时之后，细胞密度接近90%以上，将培养基弃去，用PBS清洗一遍之后加入转染液，每孔1ml。将C5. 18细胞系以2X IO5/孔，每孔Iml种于12孔板。种板24小时之后，细胞密度接近90%以上，将培养基弃去，用PBS清洗一遍之后加入转染液，每孔1ml。实施例4、复合物中质粒DNA转染后在细胞内的示踪分析I、所需主要试剂与仪器设备(I)HBSS 缓冲液(Invitrogen)；(2) PEI-25kDa (Sigma)；(3)Hoechst 33342 labeling solution(Invitrogen)；(4)Alexa Fluor 594 wneat germ agglutinin (Invitrogen)；(5)细胞培养箱HerA cell 150 (Heraeus)；(6)超净台VCM-420 (BIO-HAZARD)；(7)激光共聚焦显微镜Tcs sp5(Leica)。2、复合物中质粒DNA转染后在细胞内的示踪PEI-25kDa 组 N/P = 10。转染 30min，2h，4h，8h，12h，16h，20h，24h 后，分别弃去上清，利用HBSS将细胞清洗两次，然后加入2. O μ g/ml Hoechst 33342和10 μ g/ml AlexaFluor 594wheat germ agglutinin的标记溶液，37°C孵育10分钟。弃去上清，并用HBSS缓冲液对细胞进行两次清洗，再加入4%多聚甲醛，37°C孵育15分钟后，弃去多聚甲醛，加入
I.5毫升HBSS。进行激光共聚焦显微镜的观察。荧光素Cy5的激发光波长为649nm，发射光波长为670nm。Hoechst33342的激发光波长为350nm,发射光波长为461nm。Alexa Fluor594wheat germagglutinin的激发光波长为591nm,发射光波长为618nm。绿色突光蛋白的激发光波长为488nm,发射光波长为509nm。利用上述体系，本发明人分析了非病毒基因载体PEI_25kDa在对于Hela细胞系和C5. 18细胞系转染过程中，外源基因在细胞内的分布、运动过程，并记录记录外源基因表达起始时间及表达情況。利用Cy5标记外源基因(此处为蓝色荧光，整个携带外源基因的质粒载体为蓝色荧光)，Hochest标记细胞核(此处为灰色荧光)，Alexa Fluor 594wheatgerm agglutitin标记细胞膜(此处为红色突光)，外源基因表达后为绿色突光。通过该系统可在活体的情况下根据需要动态地观察外源基因在不同阶段时期在细胞中所处的位置和运动情况，以及外源基因初始表达时间及表达情況。结果如图I与图2，可以发现当PEI_25kDa(N/P = 20)转染Hela细胞系时，在转染后4小时的时候就有细胞开始表达绿色荧光蛋白(图中，以箭头标示，而PEI-25kDa(N/P =20)转染C5. 18细胞系时，在转染后8小时的时候才有细胞开始表达绿色荧光蛋白。而且相 比较转染后4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时这6个时间点中，Hela细胞系中表达绿色荧光蛋白的阳性细胞百分比都要高于C5. 18细胞系中表达绿色荧光蛋白的阳性细胞百分比。转染48小时以后，PEI-25kDa(N/P = 20)对于Hela细胞系的转染效率可以达到50%，而PEI-25kDa(N/P = 20)对于C5. 18细胞系的转染效率却只有20%左右。这与本发明人之前通过细胞流式分析得到的PEI-25kDa对于Hela细胞系与C5. 18细胞系的转染效率定量分析结果相一致。类似的实验已重复3次以上，结果稳定可靠。利用本发明的外源基因细胞内运动表达分析技术，比较PEI_25kDa在不同细胞中的转染可以发现在转染Hela细胞系的过程中，在30min的时候就有质粒已经入核，而且基本上每ー个细胞的细胞质中都发现有质粒。这说明PEI-25kDa在转染Hela细胞系时，质粒的入核过程十分迅速。然而对于C5. 18细胞系而言，本发明人发现，虽然在30min的时候同样在每一个细胞的细胞质中都可以发现有质粒，但是入核的比例却较之Hela细胞系中少了很多。而且在2小时的时候，发现C5. 18细胞系中的质粒依然主要聚集在细胞膜内侧附近，而并没有向细胞核运输。这说明质粒在细胞内的运输很有可能是导致最终PEI-25kDa在C5. 18细胞系中转染效率低于Hela细胞系的限速步骤。但是如果需要进ー步研究细胞质内的限速原因，则需要结合其它手段进行分析和讨论。综上实施例，本发明的技术方案包含如下改进本发明所用的Cy5染料对质粒中的外源基因的表达是不会影响的，这一点是优于量子点标记的方法的。所以，用此标记方法，不仅可以观察到质粒的运动情况，还能够观察到质粒的表达情況。这一点尤为关键，因为如果想要找到ー种外源基因输送体系(如非病毒基因输送体系，或称为非病毒基因载体)进入细胞并最终表达的限速步骤，应该是ー个循序渐进的过程。首先需要先分清限速歩骤是发生在细胞外，细胞质还是细胞核，其次再结合其它方法来细分这三个区域中的可能限速步骤。例如，如果发现某种外源基因输送体系进入细胞质很快，但是进入细胞核很慢，那么就可以再结溶酶体染色的方法，来观察是否是在细胞质中的溶酶体对外源基因输送体系起到了限速步骤。整个研究的过程是需要分开的，独立的，但是应该是有ー个先后的顺序，即先发现限速区域(细胞膜，细胞质，细胞核)，再找到每个区域内的限速步骤。本发明所采用的试剂是比较低毒的，故可以在相当长的时间内进行活体实时跟踪拍摄。当然，由于激光的长时间激发，也会对细胞产生一定的毒性，以及对荧光染料会产生一定的淬灭。本发明人的实验结果发现，在4小时以内的细胞毒性是可控的。为了提高拍摄的效果，本发明人对染料的用量也进行了优化。如Alexa Fluor 594 wheat germagglutitin的量采用约10 μ g/ml的终浓度，在没有显著提高对细胞的毒性的前提下，可以较大地增强染色效果，有效地提高拍摄质量。对于样品的保存上本发明也进行了改进。一般情况下，技术人员往往会利用4 %多聚甲醛固定的方法来保存样品，本发明人发现利用这种方法来保存样品，会使得染膜的染料Alexa Fluor 594随着时间的延长逐渐进入细胞核,使得标记的效果大大降低(这个方法的保存时间一般在3-5天)。而如果不采用4%多聚甲醛固定的方法，而是将制备好的样品直接放在4°C下则可以大大延长保存的时间，保存时间是在10天以上。本发明的方法可以同时使用4种荧光对细胞进行标记，不影响外源基因的表达，并且可进行活体实时拍摄。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为參考，就如同每ー篇文献被単独引用作为參考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种外源基因的细胞内示踪方法，其特征在于，所述方法包括 (1)以Cy5荧光素标记外源基因，将经过标记的外源基因转入细胞内； (2)以染料Hochest标记细胞的细胞核； (3)以染料AlexaFluor 594麦胚凝集素标记细胞膜；和 (4)以细胞中的灰色荧光标记的细胞核以及红色荧光标记的细胞膜为參照，观察蓝色荧光标记的外源基因在细胞内的分布或运动情况。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的外源基因存在于质粒中。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的以Cy5荧光素标记外源基因的方法是 将Cy5荧光素与外源基因共孵育后，加入NaCl和无水こ醇，静置、离心取沉淀，洗涤后收集沉淀，获得Cy5荧光素标记的外源基因。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的以染料Hochest标记细胞的细胞核的方法是 在细胞中加入染料Hochest标记溶液，共孵育，收集细胞并洗涤，获得细胞核标记染料Hochest的细胞。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的以染料AlexaFluor 594麦胚凝集素标记细胞膜的方法是 在细胞中加入Alexa Fluor 594麦胚凝集素标记溶液，共孵育，收集细胞并洗涤，获得细胞膜标记染料Alexa Fluor 594麦胚凝集素的细胞。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，通过激光共聚焦显微镜观察或拍摄外源基因在细胞内的分布、运动或表达情况。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在干， 突光素Cy5的激发光波长为649nm,发射光波长为670nm ； 染料Hoechst的激发光波长为350nm，发射光波长为461nm ;或 染料Alexa Fluor 594麦胚凝集素的激发光波长为591nm,发射光波长为618nm。
8.如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的外源基因是绿色荧光蛋白的编码基因；其表达后获得的蛋白显示绿色荧光。
9.ー种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于对外源基因进行细胞内示踪，其中含有Cy5突光素、染料Hochest和染料Alexa Fluor 594麦胚凝集素。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，其中还含有选自以下的ー种或多种试剂 标记缓冲液，灭菌水，氯化钠，こ醇，洗涤剂或转染试剂。
全文摘要
本发明涉及一种外源基因的示踪体系及其应用。本发明优化了一种DNA细胞内示踪的方法，选择到了多种显色标记来标记DNA、细胞核以及细胞膜，从而利用共定位的方法研究外源基因在细胞内的存在以及运动情况，并优化了显色标记的用法用量。借助本发明构建的示踪系统可以对外源基因在转染过程中的运动情况、限速步骤进行较为全面的分析，方法简单易行、稳定可靠。
文档编号G01N21/64GK102643894SQ20111004028
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者张晓玲, 戴尅戎, 童海骏 申请人:中国科学院上海生命科学研究院