专利名称：一次性同时定量测定多种抗生素的方法
技术领域：
本发明属于抗生素的检测领域，特别涉及一种一次性同时定量测定多种抗生素的方法。
背景技术：
自1拟8年发现青霉素以来，抗生素被大量用于人和动物的疾病治疗，同时以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中预防疾病和促进动物生长。目前被广泛使用的抗生素，按照化学结构可分为内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基葡糖苷类、大环内酯类、多肽类等；按照用途则主要包括麻醉剂、抗酸剂、驱虫剂、类固醇类、非固醇类、抗炎药、抗菌剂、杀菌剂、防腐剂、利尿药、乳化剂、催情剂、镇静剂和促生长素等。有研究表明，抗生素摄入后除少部分残留在体内，85%以上以原药和代谢产物的形式经由病人与动物的粪尿排出体外进入生态环境，经不同途径对土壤和水体造成污染。近年来，由抗生素的滥用导致的环境污染与生态毒害问题引起了广泛的关注。随着人们对于抗生素污染问题的重视度逐渐提高，已经有越来越多检测抗生素含量的方法被研究和报道。目前，测定抗生素的方法主要有微生物法、免疫分析法、薄层色谱法和仪器分析法。微生物法是选择对检测药物敏感的实验菌在一定的条件下，其抑菌圈的大小与药物浓度呈一定的线性关系。在实际检测中，微生物法的影响因素较多，菌种不易筛选，精确度和灵敏度较低。免疫分析法适用于复杂介质中痕量组分的分离和检测，它是以抗原、抗体的特异性结合和可逆性反应为基础的分析技术，具有较高的选择性和灵敏度。薄层色谱法由于操作比较简单而且快速，因此被用于药物的快速定性鉴定，但是方法的灵敏度和检测限相对于高效液相色谱法较差。仪器分析法包括气相色谱法、液相色谱法以及液相色谱-质谱联用法。高效液相色谱法因灵敏度高、特异性好而被广泛应用。目前，色谱-质谱联用法是对复杂样品进行定性、定量分析的最佳方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种一次性同时定量测定多种抗生素的方法， 该方法简便、省时、高效且定量准确，只需要一次实验，即可定量测定样品中所存在的多种抗生素；该方法灵敏度高，可用于微量检测。本发明的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，包括(1)样品处理将样品提取液以1滴/s的速度经过固相萃取柱，待上清液完全流出后，依次用 2-8mL水和2-8mL体积浓度为5%的甲醇水溶液淋洗，弃去全部流出液；然后将上述的固相萃取柱减压抽干2-8min，再用8_12mL体积浓度为10%的甲醇乙酸乙酯溶液洗脱，将洗脱液在35-45°C吹氮气，浓缩至干得残渣，用ImL标准溶解液溶解所述的残渣后过0. 45 μ m滤膜， 得样品滤液；(2)方法建立
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液相色谱条件为色谱柱hertsil 0DS-3，流速0. 4mL/min，检测波长265nm ；进样量10μ 1，流动相为乙腈和体积浓度为0. 2%甲酸水溶液，洗脱梯度见表1，得液相色谱图；表1色谱洗脱梯度
权利要求
1.一次性同时定量测定多种抗生素的方法，包括(1)将样品提取液以1滴/S的速度经过固相萃取柱，待上清液完全流出后，依次用 2-8mL水和2-8mL体积浓度为5%的甲醇水溶液淋洗，弃去全部流出液；然后将上述的固相萃取柱减压抽干2-8min，再用8_12mL体积浓度为10%的甲醇乙酸乙酯溶液洗脱，将洗脱液在35-45°C吹氮气，浓缩至干得残渣，用ImL标准溶解液溶解所述的残渣后过0. 45 μ m滤膜， 得样品滤液；(2)液相色谱条件为色谱柱hertsil0DS-3,流速0. 4mL/min,检测波长265nm ；进样量10 μ 1，流动相为乙腈和体积浓度为0. 2%甲酸水溶液，得液相色谱图；其中洗脱梯度为Omin时，乙腈的体积比为40%，其余为体积浓度为0. 2%的甲酸水溶液；Smin时，乙腈的体积比为60 %，其余为体积浓度为0. 2 %的甲酸水溶液；IOmin时，乙腈的体积比为60 %，其余为体积浓度为0. 2%的甲酸水溶液；25min时，乙腈的体积比为40 %，其余为体积浓度为 0. 2%的甲酸水溶液；30min时，乙腈的体积比为40%，其余为体积浓度为0. 2%的甲酸水溶液；质谱条件离子化方式为电喷雾电离源正源模式，离子源温度320°C，喷雾电压3000V， 氮气流量lOml/min，得质谱图；(3)用上述的液相色谱条件和质谱条件测定步骤(1)中制备的样品滤液，根据从质谱图中提取的单个抗生素离子流图，读出不同时间间隔内的出峰面积，根据标准曲线求出对应抗生素的浓度；然后通过液相色谱图中的出峰面积与标准品的出峰面积比照，确定抗生素的种类，最后对获得的数据进行处理，得出样品中各种抗生素的含量。
2.根据权利要求1所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于步骤 (1)中所述的样品提取液的制备方法为a粪便样品将Ig粪便样品冷冻干燥12-24h，然后粉碎至粒径0. 30mm后，加入到IOml PH值为4. 7的乙腈中，混勻后，25°C超声15min，4000r/min离心15min，再重复提取两次，收集上清液；将所得上清液通过纤维膜过滤得滤液，然后将所得滤液分别用IOmL正己烷萃取两次，将萃取液旋干后再用双蒸水稀释，最后用纤维膜过滤，即得粪便样品提取液；b 土壤样品将Ig 土壤样品冷冻干燥12-24h，然后粉碎至粒径0. 30mm后，加入20mL的 EDTA-McIlvaine缓冲溶液，振荡30min，取上层提取液，反复提取3次后，合并3次提取液， 最后将所得提取液用玻璃纤维膜过滤，即得土壤样品提取液；c水样用滤膜除去水样的悬浮物，然后按IL水样中加入0. 5mg Na2EDTA,再加入盐酸调节PH值至3. 0，即得水样提取液。
3.根据权利要求2所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于a中所述的PH值为4. 7的乙腈是经柠檬酸缓冲液酸化制得，其中柠檬酸缓冲液是将浓度为 0. ImoL/L的柠檬酸钠溶液和0. ImoL/L柠檬酸溶液按照体积比1. 4 18. 6混和制得。
4.根据权利要求2所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于a和b 所述的纤维膜均为玻璃纤维膜。
5.根据权利要求2所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于b中所述的EDTA-McIlvaine缓冲溶液的制备方法为将浓度为0. 2moL/L的柠檬酸溶液和浓度为 0. 2moL/L的Na2HPO4溶液按照体积比8 5混合，配制成McIIvaine溶液，然后取IL所述的 McIlvaine 溶液加入 37. 2g Na2EDTA,即得 0. ImoL/L EDTA-McIlvaine 缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于步骤 (1)中所述的固相萃取柱为PEP固相萃取柱，且预先经5mL甲醇和5mL水活化；所述的标准物质为四环素，氯霉素，土霉素，磺胺嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺甲噁唑。
7.根据权利要求1所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于步骤 (1)中所述的标准溶解液是由0. 4mL甲醇和0. 6mL去离子水混合制得的。
8.根据权利要求1所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于步骤 (3)中所述的标准曲线的绘制方法为配制单标溶液用乙腈和体积浓度为0. 2%甲酸水溶液的混和溶液配制标准物质浓度为1. Omg/ml的单标溶液，其中混合溶液中乙腈的体积分数为40% ；配制混标溶液移取所述的各单标溶液，用上述混和溶液配制成各标准物质浓度均为 10yg/ml的混标储备液，然后再配制成具有浓度梯度的混标溶液；用上述步骤O)中所述的液相色谱条件和质谱条件测定所制备的各单标溶液和混标溶液，得到液相色谱图和质谱图，根据各种抗生素的出峰时间及离子流图中的出峰面积，绘制抗生素浓度的标准曲线；标准曲线用Origirfro 7. 5软件绘制，其以浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标。
9.根据权利要求8所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于所述的浓度梯度的混标溶液的浓度依次为0. 05 μ g/ml、0· 08 μ g/ml、0· 1 μ g/ml、0· 2 μ g/ml、 0. 5 μ g/mlο
10.根据权利要求8所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于所述的测定的过程为用Iml的一次性针筒经0. 22 μ m的针筒过滤头过滤至进样瓶中进行测定。
全文摘要
本发明涉及一次性同时定量测定多种抗生素的方法，包括(1)制备样品滤液；(2)设定液相色谱条件和质谱条件；(3)用上述的液相色谱条件和质谱条件测定步骤(1)中制备的样品滤液，分析数据确定分析样品中抗生素的种类和含量。本发明可以用一次实验同时检测出多种抗生素并同时对所检出的抗生素进行定量，液相色谱-质谱联用既解决了液相色谱中出峰时间相近的波峰难分离的问题，又克服了质谱中低离子电流强度出峰不明显而带来的误差；本发明可以广泛应用于粪便、土壤、水体、食品等各种样品中抗生素的检测及定量分析。
文档编号G01N30/72GK102269747SQ20111011241
公开日2011年12月7日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者冀秀玲, 刘芳 申请人:东华大学