专利名称：一种菲牛蛭药材指纹图谱的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种菲牛蛭药材指纹图谱的测定方法，属于药物分析技术领域。
背景技术：
菲牛蛭(Poecilobdella manillensis),俗称金边蚂幢,隶属于无吻蛭目、医蛭科、牛蛭属，主要分布于广西、广东、海南和福建等省区，并且可以进行人工养殖，其具有显著的抗凝血、抗血栓、溶栓、抗血小板聚集活性，主要化学成分为脂肪酸、氨基酸和蛋白质，其中以报道的活性成分为水蛭素P6、水蛭素P18、菲牛蛭素A和菲牛蛭素B，急性毒性试验表明菲牛蛭没有明显的毒副作用，因此其具有显著的药用价值，迄今为止药典和地方标准均无收载，也无任何关于指纹图谱的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种菲牛蛭指纹图谱的测定方法。本发明所述指纹图谱的测定方法是采用高效液相色谱法测定菲牛蛭的指纹图谱。本发明所述指纹图谱的测定方法供试液配制方法及色谱条件优选为
供试液配制方法菲牛蛭药材干品粉碎，过40目筛，取O. 40g,加5ml去离子水超声15min, 4500r*min^离心15min，用O. 45 μ m滤膜滤过，滤液作为高效液相色谱供试品溶液备用；
色谱条件色谱柱为C18柱，规格为250mmX4. 6mm, 5 μ m ;流动相A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱；洗脱程序为O — 5min, A为0%，5 — 23min, A为0% — 4%，23 — 24min, A为4% — 5%，24-66min，A 为 5% — 21. 4% ;流速 dml.rnirT1 ;柱温20°C ;检测波长为 254nm。为证实该方法准确可靠，重复性好，能够用于控制菲牛蛭药材的内在质量进行如下方法学验证
I仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(2695-2996，美国Waters公司)；电子天平(AG135，MettlerToledo) ;KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)；高速万能粉碎机(天津市太斯特仪器有限公司)；相似度计算软件中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版。乙腈为色谱纯(Fisherscientific);实验用水为超纯水。菲牛蛭由广西科康生物科技有限公司提供，批号为200901、200902、200903、201001、201002、201003、201104、201101、201102，201103。2方法与结果
2. I供试品溶液制备
供试液配制方法菲牛蛭药材干品粉碎，过40目筛，取O. 40g,加5ml去离子水超声15min, 4500r*min^离心15min，用O. 45 μ m滤膜滤过，滤液作为高效液相色谱供试品溶液备用；
2.2液相色谱条件色谱柱为C18柱，规格为250·ιΧ4·6πιπι，5μπι;流动相A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱；洗脱程序为 O — 5min, A 为 0%，5 — 23min, A 为 0% — 4%, 23 — 24min, A 为 4% — 5%,24-66min，A 为 5% — 21. 4% ;流速:1ml .mirT1 ;柱温20°C ;检测波长为 254nm。2. 3方法学考察
2.3. I精密度试验
取同一批号供试品溶液，连续进样5次，测得各共有峰相对保留时间和峰面积RSD均小于3%，表明进样的精密度良好。2. 3. 2稳定性试验
取同一批号供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样，测得各共有峰相对保留时间和峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液在24h内稳定。2. 3. 3重复性试验
取同一批号供试品，按2. 2项方法，分别制备5份供试品溶液，分别进样，测得各共有峰相对保留时间和峰面积RSD均小于3%，表明方法重复性较好。2. 3. 4菲牛蛭药材特征指纹图谱及溶剂的测定图谱，见图I和图2，由图可见，溶剂对样品测定无干扰。按上述方法检测10批样品指纹图谱，同时生成对照分峰，标示了指纹图谱中23个共有峰，其中6、7、8、13、14、16，17和21号的峰为强吸收峰。指纹图谱的建立及相似度分析
2.4. I指纹图谱的建立
取10批菲牛蛭药材样品，菲牛蛭药材指纹图谱共有模式确立利用中国药典“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，将1-10批次菲牛蛭药材图谱数据导入，经数据自动匹配，以中位数法生成对照指纹图谱，指纹图谱见图3。指纹图谱相似度分析
按照建立起来的指纹图谱对不同批次的菲牛蛭药材进行相似度分析，相似度数据见表1，结果表明其共有峰RSD > O. 9，具有很好的相似度。表I十批菲牛蛭药材指纹图谱与对照指纹图谱相似度
权利要求
1.一种菲牛蛭药材的指纹图谱测定方法，该方法采用高效液相色谱法测定其指纹图-i'TfeP曰。
2.根据权利要求I所述测定方法，其特征在于所述高效液相色谱法的供试液配制方法及色谱条件为 供试液配制方法菲牛蛭药材干品粉碎，过40目筛，取0.40g，加5ml去离子水超声15min，4500r · mirT1离心15min，用O. 45 μ m滤膜滤过，滤液作为高效液相色谱供试品溶液备用; 色谱条件色谱柱为C18柱，规格为250mmX4. 6mm, 5 μ m ;流动相A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱；洗脱程序为O — 5min, A为0%，5 — 23min, A为0% — 4%，23 — 24min, A为4% — 5%, 24-66min, A 为 5% — 21. 4% ;流速:1ml · mirT1 ;柱温20°C ;检测波长为 254nm。
全文摘要
本发明提供了一种菲牛蛭药材指纹图谱的测定方法。菲牛蛭(Poecilobdellamanillensis)，俗称金边蚂蝗，隶属于无吻蛭目、医蛭科、牛蛭属，具有显著的抗凝血、抗血栓、溶栓、抗血小板聚集活性，具有显著的药用价值，迄今为止药典和地方标准均无收载，也无任何关于指纹图谱的报道，本发明采用高效液相色谱法对菲牛蛭药材进行测定，建立了菲牛蛭药材的指纹图谱，为该药材的整体质量评价提供了方法，用于菲牛蛭药材原料质量控制。
文档编号G01N30/88GK102914612SQ20111022410
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月6日 优先权日2011年8月6日
发明者孟作环, 马振嗣, 乔莉, 李文烈, 贾继明, 宋剑 申请人:河北以岭医药研究院有限公司