专利名称：小分子有机物的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法
技术领域：
本发明涉及小分子有机物(农药、药物、环境内分泌干扰物)的量子点标记抗体均相免疫分析技术。
背景技术：
环境和农畜产品中农药、药物、环境内分泌干扰物的残留超标，对环境和环境生物构成一定威胁，影响食品安全和人类健康。加强环境和食品安全监控，需要高效快速的分析技术。目前已报道的农药、药物、环境内分泌干扰物残留的检测方法主要有色谱法和色质联用法。采用这些方法需要昂贵的仪器设备、专业化的实验室和训练有素的专门人才， 样品前处理要求高、过程复杂、速度慢，检测成本高，特异性不强，难以适应大量样品和现场快速检测的要求。现有小分子有机物的免疫分析，通常采用聚苯乙烯微孔板作固相载体固定抗体或抗原，在固相和液相界面进行竞争性免疫反应，反应速度慢，需要通过洗涤方式将固、液两相分离。其中酶联免疫吸附分析需要加入酶的底物进行显色反应后检测，步骤较多且时间较长；放射性同位素标记免疫分析方法趋向于淘汰；以有机荧光分子作标记物的荧光免疫分析存在稳定性差、易发生光漂白等问题，与化学发光免疫分析类似，经典的荧光免疫分析容易受背景的干扰。
发明内容
本发明的目的是以高效水溶性量子点作为纳米荧光探针标记抗目标分析小分子有机物(农药、药物、环境内分泌干扰物)抗体，建立一种特异性强、灵敏度高、简便高效、用于目标分析小分子有机物快速检测的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析新技术。本发明的原理和技术方案是以激发波长宽、发射波长窄、荧光量子效率高、稳定性好的水溶性量子点作为纳米荧光探针，采用碳二亚胺法与抗目标分析农药、药物、环境内分泌干扰物抗体共价偶联制备量子点标记抗体；将适量量子点标记抗体用磷酸盐缓冲液稀释成适当浓度，加入含对应目标分析物的标样，与量子点标记抗体发生均相免疫反应，降低了量子点标记抗体的荧光强度(量子点标记抗体发生荧光淬灭)，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系；免疫反应平衡后，分别检测空白对照体系的荧光强度Ftl和含对应目标分析物体系的荧光强度F，依据空白对照体系的荧光强度Ftl与标样体系的荧光强度的比值FcZF的大小(即量子点标记抗体的荧光淬灭程度)与体系中对应目标分析物浓度在一定范围内成正比的规律，在条件优化的基础上建立免疫分析标准曲线；根据待测样品的FcZF和所述免疫分析标准曲线，计算待测样品中目标分析物的含量，建立高灵敏度快速检测目标分析小分子有机物(农药、药物、环境内分泌干扰物)的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法。本发明综合利用免疫分析特异性强、量子点荧光性能优异、均相免疫反应速度快、 平衡时间短、可直接进行荧光检测等优势。与常规免疫分析技术相比，本发明所建立的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法不仅特异性强、灵敏度高、重现性好，而且更加简便高效，不需要进行固液分和显色反应，检测时间约为常规免疫分析的1/4，是对现有小分子有机物免疫分析技术的发展和创新，迄今尚未见同类报道，在环境和食品中农药、药物、环境内分泌干扰物等小分子有机物快速检测方面具有很高的开发应用前景。
图1为不同浓度氯氰菊酯与量子点标记抗氯氰菊酯抗体荧光强度变化的关系曲线。图2为不同浓度氯霉素与量子点标记抗氯霉素抗体荧光强度变化的关系曲线。图3为不同浓度双酚A与量子点标记抗双酚A抗体荧光强度变化的关系曲线。
具体实施例方式一、量子点标记抗氯氰菊酯抗体非竞争均相免疫分析技术实施例
采用水溶性碳二亚胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，将表面修饰有活性羧基的核壳结构(CdSe/SiS)荧光发射波长为625nmd 的高效水溶性量子点与对氯氰菊酯具特异性亲和力的抗体共价偶联，制备量子点标记抗氯氰菊酯抗体，经透过分子量为5000的超滤离心管超滤纯化后用含0. 5g/L叠氮化钠和1M/L 甜菜碱、PH8. 3的硼酸盐缓冲液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存备用，临用前用0. 02mol/L、 pH7. 2 PBS 稀释 400 倍。用0. 02mol/L、pH7. 2 PBS稀释lmg/mL氯氰菊酯标样的甲醇溶液，配置l(TlO_Vg/ mL氯氰菊酯标样系列，分别与所述量子点标记抗氯氰菊酯抗体稀释液等体积混合，在室温下反应10 15min，同样条件下分别以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系。反应平衡后，在235nm的激发波长下分别检测空白对照体系在625nm附近的最大荧光强度(Ftl)和含氯氰菊酯的体系相同波长的荧光强度(F)。优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择量子点标记抗氯氰菊酯抗体与氯氰菊酯免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、 量子点标记抗体用量少、空白对照体系荧光强度(Ftl)与含氯氰菊酯体系的荧光强度(F)比值(Ftl/ F)高、背景干扰少的条件组合。在上述基础上，依据空白对照体系荧光强度(Ftl)与含氯氰菊酯体系的荧光强度 (F)的比值(量子点标记抗体的荧光淬灭程度)与体系中氯氰菊酯浓度在一定范围内成正比的规律，建立氯氰菊酯的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析标准曲线(见图1)。根据样品的Ftl/ F和标准曲线，计算样品中氯氰菊酯的含量，对待测样品中的氯氰菊酯进行定性定量快速检测，从而建立高灵敏度快速检测氯氰菊酯的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析技术。二、量子点标记抗氯霉素抗体非竞争均相免疫分析技术实施例
采用水溶性碳二亚胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，将表面修饰有活性羧基的核壳结构(CdSe/SiS)荧光发射波长为625nmd 的高效水溶性量子点与对氯霉素具特异性亲和力的抗体共价偶联，制备量子点标记抗氯霉素抗体，经透过分子量为5000的超滤离心管超滤纯化后用含0. 5g/L叠氮化钠和1M/L甜菜碱、PH8. 3的硼酸盐缓冲液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存备用，临用前用0. 02mol/L、pH6. 8 PBS稀释400倍。用0. 02mol/L、pH6. 8 PBS稀释lmg/mL氯霉素标样的甲醇溶液，配置广10_Vg/mL 氯霉素标样系列，分别与所述量子点标记抗氯霉素抗体稀释液等体积混合，在室温下反应 10 15min，同样条件下分别以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系；
反应平衡后，在235nm的激发波长下分别检测空白对照体系625nm附近的荧光强度 (F0)和含氯霉素的体系相同波长的荧光强度(F)。优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择量子点标记抗氯霉素抗体与氯霉素免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、量子点标记抗体用量少、空白对照体系荧光强度(Ftl)与含氯霉素体系的荧光强度(F)比值(Ftl/ F)高、背景干扰少的条件组合。在上述基础上，依据空白对照体系荧光强度(Ftl)与含氯霉素体系的荧光强度(F) 的比值(量子点标记抗体的荧光淬灭程度)与体系中氯霉素浓度在一定范围内成正比的规律，建立氯霉素的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析标准曲线(见图2)。根据样品的Ftl/ F和标准曲线，计算样品中氯霉素的含量，对待测样品中的氯霉素进行定性定量快速检测， 从而建立高灵敏度快速检测氯霉素的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析技术。三、量子点标记抗双酚A抗体非竞争免疫分析技术实施例
采用水溶性碳二亚胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，将表面修饰有活性羧基的核壳结构(CdSe/SiS)荧光发射波长为655nm 的高效水溶性量子点与对双酚A具特异性亲和力的抗体共价偶联，制备量子点标记抗双酚 A抗体，经透过分子量为5000的超滤离心管超滤纯化后用含0. 5g/L叠氮化钠和1M/L甜菜碱、PH8. 3的硼酸盐缓冲液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存备用，临用前用0. 02mol/L、pH7. 0 PBS稀释400倍。用0. 02mol/L、ρΗ7· 0 PBS稀释lmg/mL双酚A标样的甲醇溶液，配置1 IO-Vg/ mL双酚A标样系列，分别与所述量子点标记抗双酚A抗体稀释液等体积混合，在室温下反应10 15min，同样条件下分别以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系。反应平衡后，在235nm的激发波长下分别检测空白对照体系655nm附近的最大荧光强度(Ftl)和含双酚A的体系相同波长的荧光强度(F)。优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择量子点标记抗双酚A抗体与双酚A免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、量子点标记抗体用量少、空白对照体系荧光强度(Ftl)与含双酚A体系的荧光强度(F)比值(Ftl/ F) 高、背景干扰少的条件组合。在上述基础上，依据空白对照体系荧光强度(Ftl)与含双酚A体系的荧光强度(F) 的比值(量子点标记抗体的荧光淬灭程度)与体系中双酚A浓度在一定范围内成正比的规律，建立双酚A的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析标准曲线(见图3)。根据样品的Ftl/ F和标准曲线，计算样品中双酚A的含量，对待测样品中的双酚A进行定性定量快速检测，从而建立高灵敏度快速检测双酚A的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析技术。
权利要求
1.小分子有机物的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法，其特征在于采用混合酸酐法或碳二亚胺法，将激发波长宽、荧光发射波长窄、稳定性好、表面具有活性氨基的核壳结构高效水溶性量子点与抗目标分析小分子有机物抗体共价偶联制备量子点标记抗体； 将量子点标记抗体用磷酸盐缓冲液稀释成适当浓度，加入含对应目标分析物的标准样品混勻，进行均相免疫反应，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系；反应平衡后分别检测空白对照体系的荧光强度Ftl和含对应目标分析物体系的荧光强度F，依据空白对照体系的荧光强度Ftl与标样体系的荧光强度的比值FcZF的大小与体系中目标分析物浓度在一定范围内成正比的规律，在条件优化的基础上建立免疫分析标准曲线；根据待测样品的FcZF和所述免疫分析标准曲线，计算待测样品中目标分析物的含量，建立高灵敏度快速检测目标分析小分子有机物的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法。
全文摘要
小分子有机物的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法，涉及用于小分子有机物高灵敏度快速检测的纳米荧光探针标记抗体非竞争均相免疫分析技术。以高效水溶性量子点标记抗目标分析小分子有机物抗体，将量子点标记抗体用磷酸盐缓冲液稀释后加入含对应目标分析小分子有机物的标准样品进行均相免疫反应，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系；将反应平衡后的标样、样品及空白对照体系直接进行荧光检测，依据空白对照体系和标样体系荧光强度的比值大小与体系中对应目标分析物的浓度在一定范围内呈正比的原理和规律，建立高灵敏度快速检测目标分析小分子有机物的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析技术。
文档编号G01N21/64GK102495210SQ20111039938
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者冯大和, 刘曙照, 刘腾飞 申请人:扬州大学