专利名称：小分子有机物的量子点标记半抗原多组分直接竞争免疫分析方法
技术领域：
本发明涉及不同小分子有机物(农药、药物、环境内分泌干扰物)的纳米荧光探针标记多组分直接竞争免疫分析新技术。
背景技术：
环境和农畜产品中农药、药物、环境内分泌干扰物多残留超标，对环境和环境生物构成一定威胁，影响食品安全和人类健康。加强环境和食品中多种残留物的监控，需要高效快速的多组分分析技术。
目前已报道的农药、药物、环境内分泌干扰物多残留检测方法主要有色谱法和色质联用法，采用这些方法需要昂贵的仪器设备、专业化的实验室和训练有素的专门人才，样品前处理要求高、过程复杂、速度慢，检测成本高，特异性不强，难以适应大量样品和现场快速检测的要求。现有小分子有机物多组分免疫分析，通常采用在聚苯乙烯微孔板的不同部位固定不同抗体或抗原，通过空间分辨进行不同免疫反应，反应在固相和液相界面进行，反应后通过洗涤方式实现固液分离，操作复杂；或采用不同标记物，如酶、荧光素等标记不同抗体或抗原，反应条件和检测手段难以兼容。因此，真正意义上的小分子有机物多组分免疫分析技术尚待建立。发明内容
本发明的目的是以不同荧光发射波长的高效水溶性量子点作为纳米荧光探针标记不同目标分析物半抗原，建立一种特异性强、灵敏度高、简便高效、可同时快速检测多种小分子目标分析物(农药、药物、环境内分泌干扰物)的直接竞争免疫分析技术。
本发明的技术方案是采用混合酸酐法或碳二亚胺法，将激发波长宽、荧光光谱窄、稳定性好、荧光发射波长不同的高效水溶性量子点分别与含活性羧基末端的不同目标分析小分子有机物半抗原共价偶联制备具有特征荧光发射波长的不同量子点标记半抗原。
将抗不同目标分析物的抗体分别固定于水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，封闭微球表面未结合抗体的位点。
取适量固定有抗不同目标分析物抗体的聚苯乙烯磁性微球、对应目标分析物标样及对应的不同量子点标记半抗原，共同分散于磷酸盐缓冲液中，在室温下同时进行竞争性免疫反应，在同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系。反应平衡后的体系在磁性微球分离器上使聚苯乙烯磁性微球与液相快速分离，在同一波长紫外光激发下对液相进行荧光扫描或多波长检测，测定标样和样品体系中各量子点标记半抗原的特征荧光强度(Fs)与目标分析物空白对照的特征荧光强度(Ftl)之比(Fs/ F0)。
依据FsZ^Fci与体系中对应目标分析物浓度在一定范围内成正比(聚苯乙烯磁性微球上结合的量子点标记半抗原的量与对应目标分析物浓度在一定范围内成反比)的规律，在条件优化的基础上建立各目标分析小分子有机物(农药、药物、环境内分泌干扰物)的量子点标记直接竞争免疫分析方法；根据待测样品中各目标分析物的Fs/^计算样品中对应目标分析物的含量，从而建立高灵敏度快速检测多种目标分析小分子有机物的量子点标记多组分直接竞争免疫分析技术。
本发明综合利用免疫分析特异性强、量子点荧光量子效率高而稳定、不同量子点可在同一激发波长下发射互不干扰的荧光、聚苯乙烯磁性微球可在水相中分散且可在磁场中与液相快速分离等优势。与常规免疫分析相比，本发明所建立的量子点标记半抗原多组分直接竞争免疫分析在同一水分散相中进行，平衡时间短；固相和液相可在磁场中快速分离，在同一激发波长下同时检测液相中不同量子点标记物的特征荧光强度，实现对多种目标分析小分子有机物的同时定性定量检测，省去了洗涤和显色反应步骤，操作简便快速，显著提高了检测效率和检测灵敏度，重现性好，是对现有小分子有机物多组分免疫分析技术的突破与创新，国内外尚未见报道。
图1为量子点标记3种农药半抗原直接竞争多组分免疫分析荧光光谱图。
图2为量子点标记3种药物、环境内分泌干扰物半抗原直接竞争多组分免疫分析荧光光谱图。
具体实施方式
一、量子点标记农药半抗原多组分直接竞争免疫分析技术实施例采用经典的混合酸酐法或碳二亚胺法将氰戊菊酯半抗原0,0^^^^4 40-丁酸JX 夂·和克百威半抗原tiOoLp^(n=l-5)分别与表面修饰有活性氨基、荧光发射波长为655nm、585nm、525nm的核壳结构 (CdSe/ZnS)高效水溶性量子点共价偶联，制备特征荧光发射波长约为655nm的量子点标记氰戊菊酯半抗原、特征荧光发射波长约为585nm的量子点标记2，4D_ 丁酸和特征荧光发射波长约为525nm的量子点标记克百威半抗原。用截留分子量为5000道尔顿的超滤离心管离心去除游离的小分子化合物，量子点标记半抗原分别用PH8. 3、含0. 5g/L叠氮化钠和 lmol/L甜菜碱的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液定容，使量子点浓度为lMfflol/L，4°C储存，临用前分别将量子点标记氰戊菊酯半抗原、量子点标记2，4D- 丁酸和量子点标记克百威半抗原用 0. 02mol/L、ρΗ7· 2 PB稀释200倍、100倍和50倍后等体积混合。
用0. 02mol/L、ρΗ7. 2的PB分别配置浓度为lOPg/mL的抗氰戊菊酯抗体、抗 2，4D- 丁酸抗体和抗克百威抗体溶液，然后在各抗体溶液中加入等体积的10mg/mL的聚苯乙烯磁性微球水分散液，4°C吸附8 12小时，用磁性微球分离器将包被有抗体的聚苯乙烯磁性微球与液相快速分离，固相加原体积2倍的0. 02mol/L、pH7. 2 PB分散后，再用磁性微球分离器进行固液分离，如此重复2次，最后在固相中加入含NaN3 0. 5g/L、浓度为5g/L的明胶溶液混勻，使聚苯乙烯磁性微球的含量为:3mg/mL，室温下静置2小时，封闭微球表面未吸附抗体的位点，4°C储存备用。使用前将固定有不同抗体的所述3种聚苯乙烯磁性微球储备液摇勻，等体积混合。
先用甲醇配置含氰戊菊酯、克百威和2，4D_ 丁酸标样各lmg/mL的母液，再用 0. 02mol/L、pH7. 2 PB稀释成分别含氰戊菊酯、克百威和2，4D- 丁酸标样10 lO—Vg/mL的混合标样系列，以0. 02mol/L、pH7. 2的PB作空白对照。
在IOOPL标样、待测样品和空白对照溶液中分别加入固定有抗对应3种目标分析物抗体的聚苯乙烯磁性微球混合液50μ 和对应3种量子点标记半抗原混合液50μ ，在室温下混合反应约20min。反应平衡后用磁性微球分离器进行固液分离，分别取液相150μ 加入荧光微孔板的不同孔内，在226nm激发波长下扫描(见图1所示)或分别检测655nm、585nm 和525nm附近的最大特征荧光强度。
优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择抗体与对应目标分析物免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、固定有抗体的聚苯乙烯磁性微球和量子点标记半抗原用量少、含目标分析物反应体系的荧光强度(Fs)与空白对照荧光强度(Ftl)比值高、背景干扰少的条件组合；在此基础上，依据FsZiFtl与对应目标分析物浓度在一定范围内成正比(聚苯乙烯磁性微球上结合的量子点标记半抗原的量与对应目标分析物浓度在一定范围内成反比)的规律以及各样品的FsAV计算样品中对应目标分析物的含量，对待测样品中的对应目标分析物进行定性定量快速检测，从而建立对应目标分析小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争多组分免疫分析技术。
二、量子点标记药物、环境内分泌干扰物半抗原多组分直接竞争免疫分析技术实施例采用混合酸酐法或碳二亚胺法将己烯雌酚半抗原
权利要求
1.一种小分子有机物的量子点标记半抗原多组分直接竞争免疫分析方法，其特征在于以不同荧光发射波长、表面具有活性氨基的核壳结构高效水溶性量子点作为纳米荧光探针，采用混合酸酐法或碳二亚胺法标记不同目标分析小分子有机物半抗原；将抗不同目标分析物的抗体分别固定于水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，封闭微球表面未结合抗体的位点；分别取固定有不同抗体的聚苯乙烯磁性微球、对应目标分析物标样和对应量子点标记半抗原，共同分散于磷酸盐缓冲液中，室温下进行竞争性免疫反应至平衡，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系；将反应平衡的体系在磁场中使聚苯乙烯磁性微球与液相分离，在同一激发波长下对液相进行荧光扫描或多波长检测；依据标样体系中不同量子点标记半抗原的特征荧光强度Fs与对应空白对照的荧光强度Ftl之比值FsZiFtl与对应目标分析物的浓度在一定范围内呈正比的规律以及待测样品中各目标分析物的FsAV计算待测样品中各目标分析物的含量，建立高灵敏度快速检测多种目标分析小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争多组分免疫分析方法。
2.根据权利要求1所述小分子有机物的量子点标记半抗原多组分直接竞争免疫分析方法，其特征在于所述不同荧光发射波长、表面具有活性氨基的核壳结构的高效水溶性量子点在200 350nm范围内用同一波长紫外光激发，发射半峰宽小于30nm、互不干扰的特征荧光，不同量子点的最大发射波长的间隔>50nm，荧光量子效率高于60%。
全文摘要
小分子有机物的量子点标记半抗原多组分直接竞争免疫分析方法，涉及多组分直接竞争免疫分析技术，以不同荧光发射波长的高效水溶性量子点标记不同目标分析物半抗原，取固定有不同抗体的聚苯乙烯磁性微球、对应目标分析物标样及对应量子点标记半抗原共同分散于磷酸盐缓冲液中进行竞争性免疫反应；将反应平衡的体系在磁场中使聚苯乙烯磁性微球和液相快速分离，在同一波长紫外光激发下对液相进行荧光扫描或多波长检测，依据标样体系中不同量子点标记半抗原的特征荧光强度与对应空白对照的荧光强度之比值与对应目标分析物的浓度呈正比的规律，建立快速检测多种目标分析小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争多组分免疫分析方法。
文档编号G01N33/542GK102520152SQ20111039940
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者冯大和, 刘曙照, 徐科 申请人:扬州大学