专利名称：检测原发性肝癌特异性γ-谷氨酰转移酶用试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种用于原发性肝癌检测的试剂盒，特别涉及一种检测原发性肝癌特异性Y-谷氨酰转移酶用试剂盒。
背景技术：
目前在原发性肝癌(PHC)的实验室诊断方面多以甲胎蛋白(AFP)为特异性指标。 目前，临床较为公认的用AFP诊断PHC的标准为AFP > 400ng/ml，影像学发现肝脏有实质性占位性病灶且能排除肝炎活动、生殖胚胎性肿瘤等。但在临床上，部分PHC患者血清AFP 阴性或轻度升高，仅靠AFP诊断PHC的灵敏度不足70%，因此，对于AFP阴性或轻度升高的 PHC的诊断仍是临床上亟待解决的问题。作为PHC的辅助诊断指标，Y -谷氨酰转移酶(GGT)虽在大多数PHC中显著升高， 但是临床应用的特异性不高。GGT同工酶诊断PHC虽具有较高的特异性，但是操作繁琐、费时，极大的限制了其在临床中的应用。所以除AFP外，目前仍需探索在诊断PHC方面特异性好、灵敏度高且操作方便的方法。
发明内容为了探索现有技术存在的诊断PHC的特异性不够好、操作繁琐的缺点，本实用新型公开了一种检测原发性肝癌特异性Y -谷氨酰转移酶用试剂盒，具有较好的特异性和灵敏度，操作简便。本实用新型的技术方案为一种检测原发性肝癌特异性Y-谷氨酰转移酶用试剂盒，所述试剂盒由盒体和盒盖组成，盒体内设有9瓶试剂，分别为DSA-GGT标准品1瓶、 1 100生物素标记的DSA-GGT单抗1瓶、1 100链霉亲和素-辣根过氧化物酶1瓶、标准品和标本用稀释液1瓶、生物素化抗体稀释液1瓶、酶结合物稀释液1瓶、浓缩洗涤液1 瓶、TMB显色剂1瓶、终止剂1瓶，另外还有封口膜、若干包被板条和一个包被板条支架，包被板条活动设于包被板条支架上。所述包被板条为矩形板，板上设有12个盛液孔。检测原理Y-谷氨酰转移酶广泛存在于人体的肾、胰、肝、脾和小肠组织中，以肾的含量最为丰富，而血清中的GGT主要来自于肝脏。当患者为PHC患者时，患者的GGT会出现大幅的升高，这一现象主要是有肝癌细胞返祖产生胚胎性GGT所致。胚胎性GGT分子与正常人的肝细胞所产生的GGT的差别并不在蛋白质一级的结构上，而是在该酶的糖链分子结构上。所以通过先从肝癌组织中分离纯化GGT，用欧曼陀罗凝集素(DSA)-kphar0Se4B进行亲和层析分离纯化，获得与该凝集素强结合的GGT (DSA-GGT)，然后应用单克隆技术制备单克隆抗体(McAb)，建立其生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附(ELISA)检测方法，本实用新型的试剂盒就是基于此基础上制备得到。有益效果[0010]1. PHC患者的DSA-GGT诊断的灵敏度可以达到65. 5 %，特异度达到91. 1 %。 DSA-GGT为诊断PHC较为敏感的实验室指标。2.操作简便。
图1为本实用新型试剂盒打开状态下的俯视图。图2为本实用新型的包被板条支架和包被板条俯视图。
具体实施方式
一种检测原发性肝癌特异性Y -谷氨酰转移酶用试剂盒，所述试剂盒由盒体1和盒盖组成，盒体1内设有9瓶试剂5，分别为DSA-GGT标准品1瓶、1 100生物素标记的 DSA-GGT单抗1瓶、1 100链霉亲和素-辣根过氧化物酶1瓶、标准品和标本用稀释液1 瓶、生物素化抗体稀释液1瓶、酶结合物稀释液1瓶、浓缩洗涤液1瓶、TMB显色剂1瓶、终止剂1瓶，另外还有封口膜3、若干包被板条4和一个包被板条支架2，包被板条4活动设于包被板条支架2。所述包被板条4为矩形板，板上设有12个盛液孔。包被板条4和包被板条支架2均为PP或是PE制成，包被板条支架2的形状与包被板条4的形状相适应，包被板条4活动设于包被板条支架2上。试剂盒中的各个试剂瓶的瓶盖颜色可以设置的不同，以示区分。具体使用方法为将标本或是DSA-GGT标准品以标准品和标本用稀释液稀释到合适浓度，洗涤液以浓缩洗涤液按要求配制，1 100生物素标记的DSA-GGT单抗以生物素化抗体稀释液稀释到合适浓度，1 100链霉亲和素-辣根过氧化物酶以酶结合物稀释液稀释到合适浓度得到酶结合物工作液。从试剂盒中取出包被板条，将稀释好的标本或是DSA-GGT标准品按100 μ 1/孔加入到相应的包被板孔中，空白孔除外。用封口膜封孔，37°C 60min后用洗涤液洗涤包被板条 4次。再加入稀释好的生物素化抗体同样是100 μ 1/孔。用封口膜封孔，37°C30min后用洗涤液洗涤包被板条4次。加入酶结合物工作液100 μ 1/孔，用封口膜封孔，370C 30min后用洗涤液洗涤包被板条4次。然后各孔加100 μ 1显色剂，37°C避光15min。每孔再加终止液 100 μ 1，充分混合后再450nm波长处测量吸光度(A)值。下面结合具体实施情况进行进一步的说明研究对象对照组为45例正常健康体检者，其中男沈例，女19例，年龄23 45 岁。研究病例均为南京市第二医院2004年1月至2007年6月诊断明确的住院患者。PHC 患者58例，男36例，女22例，年龄37 64岁，依据2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会制订的诊断标准，其中31例经组织病理学诊断为肝细胞癌(HCC)。肝良性病变患者167例， 均符合2000年(西安)病毒性肝炎防治方案的诊断标准，其中急性肝炎患者47例，男观例，女19例，年龄23 62岁；慢性肝炎患者69例，男50例，女19例，年龄23 65岁；肝硬化患者51例，男36例，女15例，年龄47 69岁，其中胰腺癌9例，肺癌8例，肠癌肝转移7例，胃癌8例，食道癌4例。AFP测定按常规方法测定诊断标准PHC患者以AFP > 400ng/ml或DSA-GGT > 3ng/ml为真阳性；肝良性病变和其他肿瘤患者如果存在AFP > 400ng/ml或DSA-GGT > 3ng/ml为假阳性；PHC患者以AFP ^ 400ng/ml或DSA-GGT ^ 3ng/ml为假阴性，肝良性病变和其他肿瘤患者如果存在AFP ( 400ng/ml或DSA-GGT ( 3ng/ml为真阴性。灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)X 100% ；特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)X 100% ；阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)X 100 % ；阴性预测值=真阴性/ (真阴性+假阴性)X 100 % ；诊断准确度= (真阳性+真阴性)/ (真阳性+假阳性+真阴性+假阴性)X 100%。统计学方法采用SPSS11. 5统计学软件进行统计分析。率的比较采用X2检验；
计量资料以s表示，采用t检验。以P < 0. 05为差异有统计学意义。结果1.正常参考水平45例正常对照者的血清DSA-GGT水平为0 2. 6ng/ml (Z±2S), 如果以> 3. Ong/ml (1+3”为诊断结果的阳性判定标准，则正常对照者的血清DSA-GGT均为阴性。45例正常对照血清AFP水平为O 20ng/ml 士3 ，正常对照血清AFP全部为阴性。2.生物素-链霉亲和素ELISA法检测DSA-GGT的临床应用结果58例PHC患者中， DSA-GGT阳性38例，诊断的阳性率为65. 5%，明显高于其他疾病(P <0.01) ； 167例肝良性病变患者中，DSA-GGT阳性12例；36例其他肿瘤患者中，DSA-GGT阳性6例(表1)。生物素-链霉亲和素ELISA法检测DSA-GGT诊断PHC的特异度为91.1%，阳性预测值为67. 9%， 阴性预测值为90. 2%，诊断准确度为85. 4%。另外，用两份阳性样品进行精密度实验，计算出批内及批间变异分别为8. 9%和11. 5%，提示此方法重复性良好。表1 261例患者血清DSA-GGT的检测结果
权利要求1.一种检测原发性肝癌特异性Y-谷氨酰转移酶用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由盒体和盒盖组成，盒体内设有9瓶试剂，分别为DSA-GGT标准品1瓶、1 100生物素标记的DSA-GGT单抗1瓶、1 100链霉亲和素-辣根过氧化物酶1瓶、标准品和标本用稀释液 1瓶、生物素化抗体稀释液1瓶、酶结合物稀释液1瓶、浓缩洗涤液1瓶、TMB显色剂1瓶、终止剂1瓶，另外还有封口膜、若干包被板条和一个包被板条支架，包被板条活动设于包被板条支架上。
2.根据权利要求1所述检测原发性肝癌特异性Y-谷氨酰转移酶用试剂盒，其特征在于，所述包被板条为矩形板，板上设有12个盛液孔。
专利摘要本实用新型公开了一种检测原发性肝癌特异性γ-谷氨酰转移酶用试剂盒，所述试剂盒由盒体和盒盖组成，盒体内设有9瓶试剂，分别为DSA-GGT标准品1瓶、1∶100生物素标记的DSA-GGT单抗1瓶、1∶100链霉亲和素-辣根过氧化物酶1瓶、标准品和标本用稀释液1瓶、生物素化抗体稀释液1瓶、酶结合物稀释液1瓶、浓缩洗涤液1瓶、TMB显色剂1瓶、终止剂1瓶，另外还有封口膜、若干包被板条和一个包被板条支架，包被板条活动设于包被板条支架上。具有操作简便，灵敏度高，特异性好的优点。
文档编号G01N33/573GK202025007SQ20112009056
公开日2011年11月2日 申请日期2011年3月23日 优先权日2011年3月23日
发明者王念跃 申请人:南京市第二医院