专利名称：诊断传染病病原体及其药物敏感性的方法
技术领域：
本发明尤其涉及检测、诊断和/或鉴定病原体例如传染病病原体和确定其对已知或潜在治疗的敏感性的方法。
背景技术：
分子诊断学的发展在除传染病之外的大多数医学学科中彻底改革了护理，在传染病中它们未能起到普遍的变革作用。对慢速培养法的依赖在抗生素抗性的当前危机中尤其无效，因为快速诊断刺激病原体及其抗药谱的分子工具的开发将改变细菌感染、真菌感染、病毒感染和寄生虫感染的管理，在试图降低死亡率、控制卫生保健费用和改进对病原体中逐步上升的抗药性的公共卫生控制方面，导向快速、知情的药物治疗。仅在美国医院，每年有170万人获得医院细菌感染且死亡99，000人，这些感染的70%因细菌对至少一种药物的抗性所致，估计每年花费450亿美元(Klevens等，2002. Public HealthR印· 2007 ；122(2)160-6 ;Klevens 等，Clin Infect Dis. 2008 ；47(7) :927-30 ;Scott, The Direct MedicalCosts of Healthcare-Associated Infection in U. S. Hospitalsand the Benefits ofPrevention.载于Division of Healthcare Quality PromotionNCfP，Detection andControl of Infectious Diseases，编辑 Atlanta :CDC，2009)。然而，所述问题不限于美国，目前微生物抗药性在全球影响大多数普通细菌感染。抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(S. aureus) (MRSA)、多药耐药性结核病(MDR-TB)和渐增的抗药性革兰氏阴性生物的全球传播，促使制定聚焦于监督、预防和控制、研究及产品开发的行动计划(US action planto combat antimicrobial resistance.1nfect Control Hosp Epidemiol. 2001 ;22(3)183-4)。然而，在任何这些前沿获得了极微的进展。及时给予适当抗生素已反复地显示使患有严重细菌感染的患者中的死亡率降到最低，不论是在带有诸如屎肠球菌(E. foecium)、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(A. baumanii)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和肠杆菌(Enterobacter)物种等医院病原体的医院环境内，或是在带有诸如结核病(TB)等病原体的资源贫乏环境中(Harbarth 等，Am J Med. 2003 ；115 (7) :529-35 ;Harries 等，Lancet. 2001 ;357 (9267) : 1519-23 ;Lawn 等，Int JTuberc Lung Dis. 1997; I (5) :485-6)。然而，由于涉及生物的培养和传代培养的当前诊断方法可花费数天或更多天来正确地鉴定所述生物及其药物敏感性模式二者，因此医师依靠增加使用经验的广谱抗生素，增加对抗药性的选择压力并增加相关的卫生保健费用。快速(例如少于I小时)检测病原体及其抗药谱的护理诊断要点为迫切需要的并且可引人注目地改变医学实践。针对设计基于DNA的检验或基于PCR的检验的一些努力已产生能够以低检出限快速鉴定病原体的工具。然而，这些工具的全球使用目前因费用和对实验室基础设施的要求而受限，以及因基于PCR的方法在粗制样品的环境下的固有不灵敏性而受限，所述粗制样品不易遵循所需酶学。确定抗药性的分子方法甚至更有限，可以非常有限的方式用于一些生物(例如MRSA、TB)，这基于相对于已知的赋予抗药性的突变来确定感染细菌的基因型。然而此方法需要相当广泛地鉴定用于检验的所有抗药性赋予单核苷酸多态性(SNP)，以具有高灵敏性(Cairoll等，MolDiagn Ther. 2008 ; 12 (I) :15-24)。发明概述 本发明至少在某种程度上基于诊断疾病、鉴定病原体和优化治疗的新方法的发现，所述新方法基于在例如粗制的非纯化样品中检测mRNA。本文所述方法提供对样品例如临床样品中病原体的快速和准确鉴定，并且允许基于药物敏感性测定选择最佳治疗。在一方面，本发明特征在于确定病原体(例如致病生物，如细菌、真菌、病毒或寄生虫)的药物敏感性的方法。所述方法包括提供包含病原体的样品并且使所述样品与一种或多种试验化合物接触例如少于4小时，以提供试样。可在将mRNA自病原体释放进入试样的条件下处理所述试样，并将所述试样暴露给包含多个探针子集的多种核酸探针，其中各子集包含与靶mRNA特异性结合的一种或多种探针，与抗药性生物相比，所述靶mRNA在对试验化合物敏感的生物中差异表达，其中所述暴露在使探针和靶mRNA之间的结合可发生的时间内和条件下进行。所述方法包括确定探针与靶mRNA之间的结合水平，从而确定靶mRNA水平；以及将存在试验化合物时的靶mRNA水平与参考水平(例如不存在试验化合物时的靶mRNA水平)进行比较，其中在所述靶mRNA水平相对于靶mRNA参考水平的差异表明所述病原体对试验化合物是敏感的还是抗性的。在一个实施方案中，病原体为已知的，例如经鉴定的病原体。在一些实施方案中，所述方法确定未知病原体(例如，仍待鉴定的病原体)的药物敏感性。在一些实施方案中，使包含病原体的样品例如同时地或在相同样品中与两种或更多种试验化合物接触，例如与已知或潜在的治疗化合物接触，所述化合物例如抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂和抗寄生虫药。许多这些化合物为本领域已知的，例如异烟肼、利福平、批嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、紫霉素、恩维霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、环丝氨酸、对氨水杨酸、利福布丁、克拉霉素、利奈唑胺、氨硫脲、硫利达嗪、精氨酸、维生素D、R207910、氧氟沙星、新生霉素、四环素、merepenem、庆大霉素、新霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素、巴龙霉素、格尔德霉素、除赛霉素、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢吡普、替考拉宁、万古霉素、阿奇霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、大观霉素、氨曲南、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、依诺沙星、加替沙星、洛美沙星、诺氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、磺胺米隆、偶氮磺胺、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺(sulfaniIimide)、柳氮
磺吡啶、磺胺异嗯唑、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲嗯唑(复方新诺明)、地美环素、多西
环素、米诺环素、土霉素、胂凡纳明、氯霉素、氯林肯霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、梭链孢酸、呋喃唑酮、甲硝基羟乙唑、莫匹罗星、呋喃妥因、平板霉素、奎奴普丁 /达福普汀、利福平、甲砜霉素、磺甲硝咪唑、头孢菌素、替考拉宁(teicoplatin)、力百汀、头孢氨苄、利福霉素、利福昔明、头孢羟唑、酮康唑、拉氧头孢或头孢甲肟。在一些实施方案中，使样品与化合物接触少于4小时，例如少于3小时、少于2小时、少于I小时、少于30分钟、少于20分钟、少 于10分钟、少于5分钟、少于2分钟、少于I分钟。在另一方面，本发明特征在于鉴定传染病病原体(例如细菌、真菌、病毒或寄生虫,如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))的方法,例如检测样品例如临床样品中病原体的存在情况的方法。所述方法包括提供来自疑似被病原体感染的受试者的试样；在释放信使核糖核酸(mRNA)的条件下处理所述试样；将所述试样暴露给包含多个探针子集的多种核酸探针，其中各子集包含与靶mRNA特异性结合的一种或多种探针，所述靶mRNA唯一地鉴定病原体，其中所述暴露在使探针和靶mRNA之间的结合可发生的时间内和条件下进行；和确定探针与靶mRNA之间的结合水平，从而确定靶mRNA水平。试样相对于参考样品在祀mRNA方面的增加表明试样中病原体的身份(identity)。在一些实施方案中，所述方法在样品中或自样品中鉴定传染病病原体，所述样品为或包括痰、血、尿、粪便、关节液、脑脊液和子宫颈/阴道拭子。这类样品可含有多种其它生物(例如一种或多种非致病细菌、真菌、病毒或寄生虫)或病原体。在一些实施方案中，所述样品为临床样品，例如来自正在经受或可能经受卫生保健提供者的医学治疗的患者或人的样品。在本发明的一些实施方案中，所述一种或多种核酸探针选自表2。在一些实施方案中，所述mRNA在与探针接触之前为粗制的(例如未纯化的)和/或不包括扩增所述mRNA，例如以产生cDNA。在一些实施方案中，所述方法包括以酶法、化学法和/或机械法裂解细胞。在一些实施方案中，所述方法包括微流体装置的使用。在一些实施方案中，所述方法用来监测病原体感染(例如发生率、患病率)以用于病原体爆发(例如在特定地区内病原体数量的突然上升)的公共卫生监测。本文所述方法在病原体在来自受试者的样品中时有效,所述受试者包括人和动物，例如实验动物，如小鼠、大鼠、兔或猴，或者驯养动物和农场动物，如猫、狗、山羊、绵羊、猪、母牛、马和鸟类，如鸡。在一些实施方案中，所述方法另外的特征在于基于如本文所述的测定结果，确定和/或选择用于受试者的治疗以及任选给予受试者所述治疗。在另一个总的方面，本发明特征在于选择用于受试者的治疗的方法。所述方法包括任选例如利用本文所述方法鉴定传染病病原体(例如检测样品中具体病原体的存在情况和/或身份)；利用本文所述方法确定病原体的药物敏感性；和选择所述病原体对其敏感的药物用于治疗受试者。在又另一个方面，本发明提供在受试者中监测病原体感染的方法。所述方法包括在第一时间获得包含病原体的第一样品；利用本文所述方法确定第一样品中病原体的药物敏感性；任选选择所述病原体对其敏感的治疗并给予受试者所选治疗；
在第二时间获得包含病原体的第二样品；利用本文所述方法确定第二样品中病原体的药物敏感性；和将第一样品和第二样品中病原体的药物敏感性进行比较，从而在受试者中监测感染。在本文所述方法的一些实施方案中，所述受试者为免疫缺损的。在本文所述方法的一些实施方案中，所述方法包括选择病原体对其敏感的治疗并给予受试者所选治疗，在病原体的药物敏感性上的改变表明所述病原体对所述治疗有抗性或变为对所述治疗有抗性，例如所述方法包括确定病原体对待给予治疗的药物敏感性。在一些实施方案中，在病原体的药物敏感性上的改变表明所述病原体对治疗有抗性或变为对治疗有抗性，所述方法进一步包括给予受试者不同的治疗。在又另一方面，本发明特征在于在受试者群体中监测病原体感染的方法。所述方法包括在第一时间获得来自群体中受试者的第一多种样品；利用本文所述方法确定第一多种样品中病原体的药物敏感性，以及任选利用本文所述方法鉴定第一多种样品中的传染病病原体；任选给予受试者治疗；在第二时间获得来自群体中受试者的第二多种样品；利用本文所述方法确定第二多种样品中病原体的药物敏感性，以及任选利用本文所述方法鉴定第一多种样品中的传染病病原体；将第一多种样品和第二多种样品中病原体的药物敏感性以及任选所述病原体的身份进行比较，从而在受试者群体中监测感染。在又另一方面，提供与固相支持体结合的多种多核苷酸。所述多种多核苷酸的每种多核苷酸选择性地与来自表2的一个或多个基因杂交。在一些实施方案中，所述多种多核苷酸包括SEQ ID NO :1-227及其任何组合。“传染病”也称为可传染的疾病或可传播的疾病，包括因受试者感染、存在和生长致病生物剂而引起的临床上明显的疾病(即疾病的特征性医学体征和/或症状)(Ryan和Ray (编辑)(2004) · Sherris Medical Microbiology (第 4 版)· McGraw Hill)。医师可通过例如诊断性试验(例如血试验法)、病历回顾和临床病史回顾来确证传染病的诊断。在某些情况下，传染病在其部分或全部病程中可为无症状的。传染性病原体可包括病毒、细菌、真菌、原生动物、多细胞寄生虫和朊病毒。本领域技术人员应认识到，病原体的传播可通过不同途径进行，无例外地包括物理接触、污染的食物、体液、物体、空气传播性吸入，以及通过病媒生物进行。特别具传染性的传染病有时称为接触传染性的并且可通过与病人或其分泌物接触而传播。本文所用术语“基因”是指染色体中编码产物(RNA或其翻译产物多肽)的DNA序列。基因包含编码区并包括编码区前后的区(分别称为“前导”和“尾部”)。编码区由多个编码区段(“外显子”)和各个编码区段之间的间插序列(“内含子”)组成。本文所用术语“探针”是指与靶mRNA特异性结合的寡核苷酸。探针在与靶标杂交时可为单链的。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域已知的其它合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅为说明性的且不意图其成为限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用以其整体结合。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。本发明的其它特征和优点将从下列详述和附图以及从权利要求中显而易见。附图描述
图1A-1D为说明利用NanoStringTM(使用颜色编码探针直接多路测定基因表达)技术定量样品中的mRNA分子的示例性方法的流程图。1A.向粗制样品裂解物中加入对应于每个目的mRNA的两种分子探针。捕获探针由50bp寡聚物组成，所述寡聚物与给定mRNA分子互补，所述探针与生物素缀合。报告探针由不同的50bp寡聚物组成，所述寡聚物与上述mRNA分子的不同部分互补，所述探针与荧光标记缀合。每个标记唯一地鉴别给定的mRNA分子。捕获探针和报告探针在裂解物内与其对应的mRNA分子杂交。1B.通过与每个聚合物上的柄(handle)杂交的珠粒纯化来去除过量的报道分子，仅留下杂交的mRNA复合体。1C.将mRNA复合体固定并对齐在表面上。通过生物素缀合的捕获探针将mRNA复合体捕获至链霉抗生物素(strepavidin)包被的表面。施加电场使复合体全部以相同的方向对齐在表面上。1D.将表面成像并对编码进行计数。将mRNA复合体显微成像并且可计数对齐的报告标记，从而提供mRNA分子的定量测定。(图片获自nanostring, com)。图2A-2F为显示抗药性基因表达特征(signature)的诊断的一组图片。2A.来自患者的样品，例如痰。2B.诱导表达程序以区分药物敏感株和抗药株。将样品分开并暴露给不同的药物以诱导表达程序，所述表达程序取决于所述菌株是抗药的还是药物敏感的。2C.条形码探针与mRNA分子杂交。裂解细胞并向粗制样品中加入探针。2D.捕获mRNA复合体并使其对齐。2E.将复合体成像并计数。2F.特征分析。将测定的mRNA水平标准化并与无药物对照以及药物敏感性标准品和抗药性标准品进行比较，以确定跨越所有药物的抗药谱。图3为显示大肠杆菌(E. coli)临床隔离群的阳性鉴定的直方图。使用针对6个大肠杆菌基因(ftsQ、murC、opgG、putP、secA和uup)设计的探针,将4个临床隔离群阳性鉴定为大肠杆菌。每个值代表4-6次重复的平均值和标准差。图4为显示铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)临床隔离群的阳性鉴定的直方图。使用针对5个铜绿假单胞菌基因(proA、SltBl、nadD、dacC和IipB)设计的探针，将2个临床隔离群阳性鉴定为铜绿假单胞菌。图5为显示肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)临床隔离群的阳性鉴定的直方图。使用针对5个肺炎克雷伯氏菌基因(lrp、yCbK、ClpS、ihfB、mraW)设计的探针，阳性鉴定出I个临床隔离群。图6为显示金黄色葡萄球菌临床隔离群的阳性鉴定的直方图。使用针对3个金黄色葡萄球菌基因(proC、rpoB和fabD)设计的探针，阳性鉴定出4个临床隔离群。图7为一组显示使用病原体特异性探针鉴定病原体的三个直方图。图8为一组显不病原体鉴定灵敏性的三个直方图。图9A和9B为几组显示自模拟的临床样品中鉴定病原体的三个直方图。图10为一组显示铜绿假单胞菌的2个临床隔离群鉴定的两个直方图。图11为显示在大肠杆菌中鉴定氟喹诺酮抗性的直方图。图12为显示在大肠杆菌中鉴定氨基糖苷抗性的直方图。图13为显示在金黄色葡萄球菌中鉴定甲氧西林抗性的直方图。图14为显示在肠球菌(Enterococcus)中鉴定万古霉素抗性的直方图。图15为一组显示药物敏感性结核分枝杆菌(M. tuberculosis)中的药物特异性基因诱导的四个直方图。图16为一组比较异烟肼敏感性TB菌株和抗异烟肼TB菌株的三个散点图。每个点代表24种基因探针之一。轴报告如通过数字基因表达技术(NanoString )所测定的转录物数量。左——无药物处理的情况下异烟肼抗性株和异烟肼敏感株中表达的比较。中——经药物处理与未经药物处理的异烟肼敏感株中表达的比较。右——经药物处理与未经药物处理的异烟肼抗性株中表达的比较。图17为一组利用NanoString 比较药物敏感性和抗药性结核分枝杆菌的转录反应的四个直方图。(A)如本文所述用INH(0.4yg/ml)处理菌株A50 (INH-R)。(B)用2 μ g/ml链霉素处理SM-R克隆SlO。图18为显示敏感性TB菌株与抗药性TB菌株中的差异基因诱导的直方图。将每个基因在经INH处理的INH敏感(野生型)细胞/未处理细胞中的表达比率除以每个基因在经INH处理的抗INH细胞/未处理细胞中的表达。图19为显示结核分枝杆菌中INH诱导基因的诱导时程的线图。将异烟肼敏感性H37Rv暴露给O. 4 μ g/ml INH(5X MIC)，在1、2和5小时自IOml培养物中制备RNA。然后使用qRT-PCR定量针对kasA、kasB和sigA的转录物的丰度，将水平对sigA标准化并与t =O比较。图20为用于检测表达特征的示例性工作流程。由于杆菌在痰中的实际生理状态为未知的，因此在过程开发中模拟复制和非复制细菌二者。以纯性培养(在富含7H9/0ADC/SDS的培养基中培养或在7H9/四丁酚醛中饥饿培养)生长的H37Rv代表这些试验中在痰中的杆菌。在暴露给丰富培养基的情况下使杆菌脉冲若干时间^以刺激自休眠状态的复苏并激活转录。最佳以实验确定。然后在暴露给药物的情况下使杆菌脉冲若干时间t2以引起转录反应。最佳t2以实验确定。最后，将全部样品加工并通过表达概况分析进行分析以及通过定量RT-PCR确证。图21为比较基因的表达比率以区分药物敏感性杆菌和抗药性杆菌的示例性方法。利用定量RT-PCR，对于候选包含在表达特征中的基因测定mRNA水平。在存在药物时(诱导的-药物)和不存在药物时(未诱导的-无药物)，在称为“实验的(exp)”的样品(即临床隔离群)中测定关注基因的mRNA水平。亦在存在(持家-药物)和不存在(持家-无药物)药物时测定标准持家基因的mRNA水平。关注基因和持家基因的水平比率允许对存在药物(A)和不存在药物(B)时的表达进行标准化。预期的是，对于一些药物敏感株，A > B ;而对于抗药株，A = B。最后，对于已知其为药物敏感的和抗药的对照菌株(C和D)产生相同的对应比率。这些对照值充当用于比较获自未知菌株的实验比率的标准。图22为一组显示直接自培养物或患者标本中阳性鉴定细菌种类的直方图和散点图。使用针对检测种特异性转录物设计的NanoString 探针分析细菌样品。Y轴转录物原始计数；X轴基因名称。对大肠杆菌(黑色)、肺炎克雷伯氏菌(白色)、铜绿假单胞菌(灰色)特异的探针。误差棒反映两个生物学重复的标准差。(A)来自革兰氏阴性菌培养物的检测。(B)混合培养物(斯氏普罗威登·斯菌(Providencia stuartu)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganu)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、弗氏朽1 樣酸杆菌(Citrobacter freundii))内的检测。(C)培养物中分枝杆菌的属特异性和种特异性检测。结核分枝杆菌(Mtb)、鸟分枝杆菌胞内亚种(M. avium subsp.1ntracellulare (MAI))、副结核分枝杆菌(M. paratuberculosis (Mpara))和海分枝杆菌(M. marinum(Mimar))。属广泛性探针(灰色)，结核分枝杆菌特异性探针(黑色)。(D)对直接来自临床尿标本的大肠杆菌的检测。(E)大肠杆菌样品与非大肠杆菌样品相比身份的统计学测定。对每个探针的计数取平均值、对数转换并求和。(F)mecA mRNA(其在葡萄球菌(Staphylococci)中赋予对甲氧西林的抗药性)和vanA mRNA(其在肠球菌中赋予对万古霉素的抗药性)的检测。每个点代表不同的临床隔离群。图23为一组显示在抗生素暴露时区分敏感菌和抗药菌的RNA表达特征的七个直方图。使敏感菌株或抗药菌株生长至对数期，短暂暴露给抗生素、裂解，并使用针对定量转录物设计的NanoString 探针集分析，所述转录物因响应抗生素暴露而变化。将原始计数对样品的所有探针的平均值标准化，并通过将经药物暴露的样品与未经药物暴露的样品比较来确定倍数诱导。Y轴倍数变化3轴基因名称。在暴露给(A)大肠杆菌环丙沙星(CIP)、氨苄西林(AMP)或庆大霉素(GM)，(B)铜绿假单胞菌环丙沙星，和(C)结核分枝杆菌异烟肼(INH)、链霉素(SM)或环丙沙星(CIP)时敏感株(黑色；上图)或抗药株(灰色；下图)的特征。每个菌株以一式两份进行试验；误差棒代表一个典型菌株的两个生物学重复的标准差。关于试验菌株的完整列表参见表6。图24为一组显示使用表达特征的诱导水平的均方距离的抗生素抗性菌株和敏感菌株的统计学分离的三个散点图。将均方距离(MSD)表示为Z分数，其显示每个试验菌株自暴露给抗生素的敏感株的平均信号的偏差。敏感株空心菱形；抗药株实心菱形。虚线Z=3. 09 (p = O. 001) (A)大肠杆菌临床隔离群。每个点代表一个菌株的2-4个生物学重复。(B和C)响应抗生素暴露的表达特征不依赖抗药机制。(B)大肠杆菌。将亲株J53及衍生物暴露给环丙沙星然后如上分析，所述衍生物包含赋予染色体氟喹诺酮抗性的gyrA中的突变或者质粒介导的喹诺酮抗性决定簇(aac (6' )_Ib、qnrB或oqxAB)。误差棒代表四个生物学重复的标准差。(C)结核分枝杆菌。将异烟肼敏感株和高水平抗性株或低水平抗性株暴露给异烟肼。在I μ g/mL，低水平抗INH inhA显示敏感性特征，但在O. 2 μ g/mL，其显示抗药性特征。
图25为一组描述病毒和寄生虫检测的五个直方图。依照标准NanoString 方案将细胞裂解、合并、加入探针集并使样品杂交。(A)自纯性培养物中检测的白假丝酵母(Candida albicans)。(B)HIV_1。使用针对HlV-lgag和rev设计的探针自PBMC裂解物中进行检测。(C)A型流感。使用针对基质蛋白I和2设计的探针在293T细胞裂解物中检测PR8流感病毒。(D)HSV-1和HSV-2。使用针对HSV-2糖蛋白G设计的探针在Hela细胞裂解物中检测HSV-2菌株186Syn+。甚至在高MOI时也几乎没有HSV-2特异性探针与HSV-1的交叉杂交。(E)恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)。自在指定的寄生虫血症水平下采集的红细胞中检测恶性疟原虫(P. falciparum)菌株3D7。针对恶性疟原虫的指定血阶段设计探针。图26为一组显示临床隔离群的生物鉴定的三个散点图。将细菌培养物裂解并通过标准NanoString 方案将针对检测种特异性转录物设计的探针加入、杂交并检测。将合并的探针集用于A和B，所述探针集包含鉴定大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌或铜绿假单胞菌的探针。在C中，用于结核分枝杆菌的种特异性探针在针对微生物病原体的更大探针集中。左Y轴显示来自每个生物的1-5个独立转录物的对数转换计数的总和，X轴显示试验物种。虚线描述了 P值为O. 001，其基于给定样品的分数远离对照(“无生物”)样品的平均值的 标准差数量。“无生物”样品是指包含其他细菌生物但已知其中不存在限定生物的试样。对于(C),无生物样品不含结核分枝杆菌,包括胞内分枝杆菌(M.1ntracellulare)、副结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌(M. abscessus)、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌(M. gordonae)和偶发分枝杆菌(M. fortuitum)。试验的菌株和临床隔离群的数量在表4中显示,用于病原体鉴定的基因(对其设计50nt探针)列于表5中。图27描述庆大霉素(左图)或氨苄西林(左(left)图)敏感性和抗性大肠杆菌菌株的均方距离(MSD)比较。Y轴显示每个样品的MSD相对于已知敏感株的响应形心的Z分数。虚线表示Z = 3. 09，其对应于P值0.001。图28为显示环丙沙星敏感性和抗性铜绿假单胞菌菌株的均方距离比较的散点图。Y轴显示每个样品的MSD相对于已知敏感株的响应形心的Z分数。图29为一组显示链霉素(SM)或环丙沙星(CIP)敏感性和抗性结核分枝杆菌菌株的均方距离比较的两个散点图。Y轴显示每个样品的MSD相对于已知敏感株的响应形心的Z分数。图30为显示金黄色葡萄球菌隔离群的阳性鉴定的直方图。使用针对5个金黄色葡萄球菌基因(ileS、ppnK、pyrB、rocD和uvrC)设计的探针，阳性鉴定出3个金黄色葡萄球菌隔离群。图31为显示嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)隔离群的阳性鉴定的直方图。使用针对6个嗜麦芽糖寡养单胞菌(S. maltophilia)基因(clpP、dnaK、purC、purF、sdhA和secD)设计的探针,将3个隔离群阳性鉴定为嗜麦芽糖寡养单胞菌。发明详述本文描述了基于转录表达谱特征，鉴定病原体(例如细菌、真菌、病毒和寄生虫)及其抗药性模式二者的快速、高灵敏性、基于表型的方法。敏感性和抗药性病原体对药物暴露的反应非常不同，最早最迅速的反应之一反映在其各自表达谱上的改变。带有分子条形码的数字基因表达可用来检测对药物暴露的这些早期转录反应，以不需要酶学或分子生物学的快速方式来区分药物敏感性和抗药性病原体。本发明适用于多种临床样品中广泛范围的微生物病原体并且可与当前诊断工具联用或独立使用。所述方法将主要描述用于结核病(“TB” ；结核分枝杆菌)，但技术从业人员要理解的是，它们可适用于其他病原体及其伴随的临床综合征(例如，如表I所列举的)。关于TB的抗药性诊断和鉴定特别具挑战性，这是因为即使使用更快速的“显微镜观察药物敏感性”(MODS)培养法、噬菌体递送报道分子或比色指示剂，培养试验所需的TB仍极其缓慢地生长。确定抗药性的备选方法基于相对于已知抗药性赋予突变来确定传染病原体的基因型，然而此方法需要相当广泛地鉴定所有抗药性赋予单核苷酸多态性(SNP)，以使试验具有闻灵敏性。·可基于病原体的表达谱特征，将本文所述方法用于例如鉴定样品例如临床样品中的病原体以及确定病原体的药物敏感性。可用于区分药物敏感性和抗药性病原体的最早最快的反应之一为在暴露给关注药物时它们各自的转录谱。病原体对于药物暴露的反应非常不同，这取决于它们对所述具体药物为敏感的还是抗性的。例如，在某些情况下，药物敏感菌或抗药菌将在数分钟至数小时内通过增量调节和减量调节基因来响应药物暴露，或许试图克服所述药物以及跟随的更多非特异性应力，而抗药菌没有这类反应。此快速反应与化合物杀死病原体或抑制病原体生长所需的较长时间不同。以有效的方式自临床样品中检测病原体的死亡或生长抑制代表甚至更大的挑战。可使用例如带有分子条形码的数字基因表达来检测对药物暴露的这些早期转录反应，以不需要酶学或分子生物学的快速方式来区分药物敏感性和抗药性病原体，并因此所述数字基因表达可直接在收集自患者的粗制临床样品上进行。此读出为表型的并因此不需要广泛地确定解释例如TB抗药性的SNP。本文描述了一组基因，其将给病原体例如TB杆菌以及区分敏感性和抗药性病原体提供高特异性。基于构成区分敏感性和抗药性病原体的表达特征的基因的选择，通过选择大量诱导并因此不会仅仅受临床样品内病原体数量的限制的转录物，来优化检出限的灵敏性。确定该组基因的大小以使所需基因的数量减到最少。因此，可将本发明用作诊断带有其伴随抗药性模式的病原体的高度灵敏的表型试验，其为快速的(例如几个小时)、灵敏的和特异性的。此试验可改变病原体感染患者的护理，并且是用于例如全球TB流行区的成本效益的护理点诊断。本发明方法允许以高度的灵敏性和特异性直接自粗制细胞样品中检测核酸特征、特别是RNA水平。此技术可用于通过测定不同的表达特征以高度的灵敏性且快速的简单加工直接从临床样品(例如痰、尿、血或粪便)鉴定TB并确定药物敏感性模式；所述技术亦适用于诸如淋巴结等其他组织。高灵敏性可通过检测mRNA而非DNA(因为单个细胞可携带比单基因组DNA拷贝(其通常需要扩增以用于检测)更多的mRNA拷贝/细胞(> IO3))和通过所述技术的固有高灵敏性(检测< 2000拷贝mRNA)来获得。所述快速简单样品加工为可能的，这是因为缺少检测mRNA分子所需的酶学和分子生物学；反而在一些实施方案中，所述方法利用条形码探针与粗制裂解物中的mRNA分子的杂交，接着直接显现(例如，如图1所述)。由于在这些实施方案中使用杂交，可直接检测mRNA，而无需自粗制细胞裂解物、固定的组织样品以及含有异硫氰酸胍、聚丙烯酰胺和丁rizolu的样品的任何纯化步骤。粗制mRNA样品可获自生物流体或固体，例如痰、血、尿、粪便、关节液、脑脊液、子宫颈/阴道拭子、胆汁液、胸膜液、腹膜液或心包液；或者亦可使用例如来自骨活检、肝活检、肺活检、脑活检、淋巴结活检、食管活检、结肠活检、胃活检、小肠活检、心肌活检、皮肤活检和窦活检的组织活检样品。RNA 提取通过用酶法、化学法或机械法处理样品以裂解样品中的细胞并释放mRNA，可自样品中的细胞例如病原体细胞或临床样品中提取RNA。技术从业人员要理解的是，可在所述过程中使用其他破碎方法。酶法去除细胞壁的使用已在本领域良好地建立。所述酶通常可市购以及在大多数情况下最初分离自生物来源。常用的酶包括溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶和甘露糖。
化学品例如去污剂通过干扰脂质-脂质、脂质-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用来破坏环绕细胞的脂质屏障。用于细胞裂解的理想去污剂取决于细胞类型和来源。细菌和酵母因其细胞壁的性质所致对最佳裂解有不同的需求。一般而言，非离子型去污剂和两性离子去污剂更温和。Triton X系列非离子型去污剂和两性离子去污剂3-[ (3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)常用于这些目的。相比之下，离子型去污剂为强增溶剂并且趋于使蛋白质变性，从而破坏蛋白质活性和功能。在本领域广泛使用SDS(与蛋白质结合并使其变性的离子型去污剂)来破碎细胞。细胞的物理破碎可能需要超声处理、弗式压碎器、电穿孔，或者可使用包含装配结构的微流体装置来机械破碎细胞。这些方法为本领域已知的。带有分子条形码的数字基因表达在图1中显示了基于其基因表达谱来鉴定病原体的示例性过程的流程图。通过BLAST软件将来自关注病原体的编码序列与其他生物中的全部基因序列进行比对，来选择鉴定各关注病原体的寡核苷酸探针。仅选择与关注病原体完全匹配但与任何其他生物(50%匹配的约50个核苷酸(例如80个核苷酸、70个核苷酸、60个核苷酸、40个核苷酸、30个核苷酸和20个核苷酸)的探针。选择对应于每个关注mRNA且在彼此的100个碱基对之内的两种探针。向含有mRNA分子的粗制样品裂解物中加入两种分子探针。捕获探针包含与给定的mRNA分子互补的50个核苷酸并且可与生物素缀合。报告探针包含与相同mRNA分子的不同部分互补的不同的50个核苷酸并且可与报道分子(例如荧光标记或量子点)缀合。每个报道分子唯一地鉴别给定的mRNA分子。所述捕获探针和报告探针在裂解物内与其对应的mRNA分子杂交。通过与每个聚合物上的柄杂交的珠粒纯化来去除过量报道分子，仅留下杂交的mRNA复合体。可将mRNA复合体捕获并固定在表面例如链霉抗生物素包被的表面上。可施加电场使复合体全部以相同的方向对齐在表面上，然后将所述表面显微成像。可计数报道分子以提供mRNA分子的定量测定。可在所述过程中使用可市购的 nCounter Analysis System (NanoString, Seattle, WA)。然而，技术从业人员要理解的是，在所述过程中亦可使用其他系统。例如，可使用量子点而不用条形码来标记探针；参见例如 Sapsford 等，“Biosensing with luminescentsemiconductor quantumdots. ”Sensors6 (8) :925-953(2006) ;Stavis 等，“Singlemolecule studies of quantumdot conjugates in a submicrometer f luidic channel.，’Lab on a Chip5 (3)337-343(2005);和Liang等,“An oligonucleotide microarrayfor microRNA expressionanalysis based on labeling RNA with quantum dot andnanogold probe. ，’NucleicAcids Research33 (2) :el7(2005)。在一些实施方案中，可在本方法中使用微流体(例如“芯片实验室”)装置来检测和定量样品中的mRNA。这类装置已成功用于微流体流式细胞术、连续的基于尺寸的分离和色谱分离。具体而言，这类装置可用于检测如本文所述粗制样品中的特定靶mRNA。可使用多种方法来检测在特定mRNA水平上的变化。因此，可在用于本文所述方法的诊断和预后装置中使用这类微流体芯片技术。例如，参见例如Stavis等，Lab on a Chip5(3) :337-343(2005) ；Hong 等，Nat. Biotechnol. 22(4) :435-439(2004)；Wang 等，Biosensors andBioelectronics 22(5) :582-588 (2006) ；Carlo 等，Lab on aChip3(4) :287-291 (2003) ；Lion 等，Electrophoresis24213533-3562 (2003) ；Fortier等，Anal. Chem. ,77(6) :1631-1640(2005);美国专利公布号 2009/0082552 ;和美国专利号7，611，834。本申请还包括包含结合部分的微流体装置，所述结合部分例如与本文所述病原体特异性结合的抗体或其抗原结合片段。 这些微流体装置可并入标记的量子点和其他报道分子的激光激发。这些装置亦可通过多种检测机制(包括可见光)和多种数字成像传感器方法(包括基于照相机的电荷耦合装置)，并入所得发射的检测。这些装置还可并入图像处理及分析能力以将所得原始信号和数据翻译成诊断信息的。利用表达特征快速表型诊断病原体身份和病原体抗药性此技术可用于获得病原体身份或抗药性的快速测定。可基于独特基因的检测在样品中鉴定病原体。因此，例如可自具有以下症状的受试者中获得痰样，所述症状与诸如肺炎或支气管炎等呼吸系统疾病相关，并进行测定以确定存在何种疾病以及何种病原体为所述疾病的原因(参见例如表I)。可获得尿样以诊断膀胱炎、肾盂肾炎或前列腺炎(参见例如表I)。技术从业人员要理解的是，可根据患者表现出症状的性质及其鉴别诊断来获得和分析具体形式的样品。用于鉴定各种生物的特定基因可通过本文所述方法鉴定；表2包含了用于鉴定某些病原体的示例性基因。用于大大加速抗药性试验的原理基于检测在暴露给特定关注药物时，在病原体的药物敏感株和抗药株之间存在的转录反应上的差别。这些转录谱是可测定的对药物暴露的最早表型反应，并且可在药物暴露时，早在杆菌死亡之前将其测定。此基于转录的方法亦相对于基于基因型的方法具有明显的优势，这是因为其测定病原体对药物暴露的直接反应而非测定替代物SNP。在一些实施方案中，可如图2所述进行所述试验。将样品(例如来自患有TB患者的痰样)分成数个较小的子样品。将不同的子样品不暴露给药物或暴露给不同的已知或潜在药物(例如，在TB样品的情况下为异烟肼、利福平、乙胺丁醇、莫西沙星、链霉素)达限定的时间(例如少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于I小时、少于30分钟、少于20分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于2分钟、少于I分钟),期间在药物敏感株中诱导使其与抗药株区分的表达谱。然后将子样品中的TB杆菌裂解、加入条形码分子探针用于杂交以及在固定和成像之后分析所述子样品。然后基于TB的药物敏感株和抗药株的表达反应，分析转录数据集以确定对一组药物的抗药性。因此，可确定唯一鉴别TB的表达特征及其对单个抗生素的反应，建立用于数字基因表达应用的探针集以及优化样品处理和收集方法。
在确定表达特征和优化转录信号上应考虑的两个问题为1.痰中杆菌当前未确定的代谢状态，因为细胞可能处于复制或非复制状态，和2.收集痰中的TB杆菌已预暴露给抗生素的可能性(即所述患者已用抗生素经验地治疗)。在一些实施方案中，鉴定病原体的方法和确定药物敏感性的方法同时进行，例如用相同的微阵列装置或微流体装置在相同的样品上进行，或者先后进行，例如一旦确定了病原体的身份，便选择和进行用于药物敏感性的适当测定。在随附提交的表2中提供了可用于本文所述方法的示例性基因和探针集。治疗方法本文所述方法包括但不限于用于治疗病症(例如表I所列病症)的方法。通常，所述方法包括使用本文所述方法鉴定来自受试者的样品中的病原体或者鉴定受试者中的病原体对其敏感的一种或多种药物，以及给予需要这类治疗或已确定需要这类 治疗的受试者治疗上有效量的治疗化合物，所述治疗化合物中和病原体。在本文中所用的“治疗”意指改善病症的至少一个症状，所述病症与表I所列病症之一有关。例如，所述方法包括治疗TB，TB常常导致咳嗽、胸痛、发烧、疲劳、无意识的体重减轻、食欲缺乏、寒冷和盗汗，因此治疗可导致这些症状的减轻。其他疾病的临床症状为本领域众所周知的。“有效量”为足以产生有益结果或所需结果的量。例如，治疗量为达到所需疗效的量。所述量可与预防上有效量相同或不同，所述预防上有效量为预防疾病或疾病症状的发作所需的量。可以一次或多次给予、施用或给药来给予有效量。组合物的治疗上有效量取决于所选的组合物。可从一次或多次/天至一次或多次/周(包括每隔一天一次)给予所述组合物。亦可从一次或多次/月至一次或多次/年给予所述组合物。技术人员将理解的是，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重性、先前治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，使用治疗上有效量的本文所述组合物治疗受试者可包括单一治疗或一系列治疗。诊断方法本文包括用于鉴定病原体和/或确定其药物敏感性的方法。所述方法包括自受试者获取样品并评价样品中病原体的存在情况和/或药物敏感性，以及将所述存在情况和/或药物敏感性与一个或多个参照(例如在未受影响的受试者中的水平或野生型病原体)进行比较。可利用本文所述和本领域已知的方法(例如利用定量免疫测定法)评价mRNA的存在情况和/或水平。在一些实施方案中，可利用高通量法例如本领域已知的基因芯片(参见例如第 12 章，Genomics, Griffiths 等，编辑 Modern Genetic Analysis, 1999，ff. H. Freeman andCompany ；Ekins 和 Chu, Trends in Biotechnology,1999,17 :217-218 ；MacBeath 和 Schreiher, Science 2000,289 (5485) :1760-1763 Simpson, ProteinsandProteomicsA Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；2002 ；Hardiman, Microarrays Methods and Applications Nuts & Bolts, DNA Press,2003)，来检测mRNA的存在情况和/或水平。在一些实施方案中，样品包括生物流体或固体，例如痰、血、尿、粪便、关节液、脑脊液、子宫颈/阴道拭子、胆汁液、胸膜液、腹膜液或心包液；或者例如来自骨活检、肝活检、肺活检、脑活检、淋巴结活检、食管活检、结肠活检、胃活检、小肠活检、心肌活检、皮肤活检和窦活检的组织活检样品。在一些实施方案中，一旦已确定某人具有病原体(例如表I所列病原体)或具有抗药性病原体，即可给予例如本领域已知或如本文所述的治疗。试剂盒包含探针的试剂盒亦在本发明的范围内，所述探针与如本文所述的基因的区杂交并且可用来检测本文所述的病原体。所述试剂盒可包含一种或多种其他组件，包括使用说明书；以及其他试剂，例如标记或用于使标记与探针连接的试剂。使用说明书可包括关于用于在本文所述方法中预测对治疗的反应的探针的诊断应用的说明。其他说明可包括对于将标记与探针连接的说明、对于用所述探针进行分析的说明和/或对于从受试者获取待分析样品的说明。如上所论述，所述试剂盒可包含标记，例如荧光团、生物素、地高辛配基(digoxygenin)和放射性同位素,例如32p和3H。在一些实施方案中，所述试剂盒包含与如文本所述的基因的区杂交的标记探针，例如如本文所述的标记探针。所述试剂盒亦可包含一种或多种附加的探针，所述探针与相同基因或同病原体相关的另一基因或其部分杂交。包含附加探针的试剂盒可进一步包含标记，例如用于探针的 一种或多种相同或不同的标记。在其他实施方案中，提供给试剂盒的一种或多种附加探针可以是一种或多种标记的探针。当试剂盒进一步包含一种或多种附加的探针时，所述试剂盒可进一步提供用于使用所述附加探针的说明书。亦可提供用于自我测试的试剂盒。例如，这类测试试剂盒可包含装置和说明书，受试者无需卫生保健提供者的帮助便可使用所述装置和说明书来获取例如痰、口颊细胞或血等样品。例如，可利用口腔拭子或刷子或者使用漱口水获取口颊细胞。本文提供的试剂盒亦可包含邮寄物(mailer)，例如邮费已付的信封或邮包，其可用于将样品返回例如实验室以进行分析。所述试剂盒可包含一个或多个用于样品的容器，或者样品可处于标准采血瓶中。所述试剂盒还可包含一份或多份知情同意书、测试申请单以及如何在本文所述方法中使用试剂盒的说明书。本文亦包含使用这类试剂盒的方法。可例如使用条形码编码一份或多份所述表格(例如测试申请单)和一个或多个装样品的容器，以辨别提供样品的受试者。在一些实施方案中，所述试剂盒可包含用于处理样品的一种或多种试剂。例如，试剂盒可包含用于自样品中分离mRNA的试剂。所述试剂盒亦可任选包含用于可检测地标记mRNA或mRNA扩增子的一种或多种试剂，所述试剂可包括例如酶(例如DNA聚合酶的Klenow片段、T4多核苷酸激酶)、一种或多种可检测标记的dNTP或者可检测标记的Y磷酸ATP (例如 33P-ATP)。在一些实施方案中，所述试剂盒可包含用于分析例如微阵列分析结果或表达谱结果的软件包。在下列实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制在权利要求中描述的本发明的范围。
实施例实施例1:病原体鉴定大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。鉴定出大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌(Enterococcus faecal is)中的独特编码序列(表2)并将其用于阳性鉴定这些生物(图3-6)。使临床隔离群在LB培养基中于37°C生长至对数期。然后向100微升异硫氰酸胍裂解缓冲液(RLT缓冲液，Qiagen)中加入5微升各培养物并涡旋5秒钟。然后依照用于裂解物的制造商标准方案，将4微升各裂解物制品用于nCounter System测定。用于鉴定的标准为对于全部5种(对于铜绿假单胞菌或肺炎克雷伯氏菌)或6种(对于大肠杆菌)生物鉴定探针的计数，其至少在背景平均值(对用于另两种生物的所有生物鉴定探针计数的平均值)的两倍以上。将计数对ProC的计数标准化，以在重复之间比较。利用表2所述生物鉴定探针,使用针对6个大肠杆菌基因(ftsQ、murC、opgG、putP、secA和uup)设计的探针正确鉴定出4个大肠杆菌临床隔离群(图3)。如图4所示，使用针对5个铜绿假单胞菌基因(proA、sltBU nadD、dacC和IipB)设计的探针将2个临床隔离群正确鉴定为铜绿假单胞菌。如图5所示，针对5个肺炎克雷伯氏菌基因(lrp、ycbK、clpS、ihfB和mraW)设计的探针阳性鉴定出一个肺炎克雷伯氏菌临床隔离群。使用针对3个金黄色葡萄球菌基因(pr0C、rpoB和fabD)设计的探针，阳性鉴定出4个临床隔离群(图6)。用于鉴定的截止标准为对rpoB和fabD的计数至少在背景平均值(对用于大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌的所有生物鉴定探针计数的平均值)的两倍以上。 平均说来，较大的库(pool)包含用于各种生物的4-5个序列以获得所需的特异性水平。利用此技术，通过直接探查粗制裂解物，在纯性培养物和在包含8种另外的革兰氏阴性病原体的复杂混合物中检测、鉴定和区分这三种生物的每一种(图22A和22B)。TB。针对Rvl641.1和Rv3583c.1的探针检测结核分枝杆菌中的高丰度转录物(参考文献8)以及将检测鸟分枝杆菌(M. avium)和鸟分枝杆菌副结核亚种(M. aviumsubsp. paratuberculosis)中的直向同源转录物，因此可用于检测任何这三个种。另外，针对3个TB基因(Rvl980c.1、Rvl398c.1和Rv2031c.1)的探针可用来差异地鉴定结核分枝杆菌，即它们不会检测鸟分枝杆菌或鸟分枝杆菌副结核亚种。针对MAP_2121c.1、MAV_3252.1、MAV_3239.1和MAV_1600.1的探针可用于检测鸟分枝杆菌或鸟分枝杆菌副结核亚种，但不会检测结核分枝杆菌。因此，使用Rvl980c和Rv3853探针获得最大灵敏性，而针对 Rvl980c.1、Rvl398c.1 和 Rv2031c.1 以及 MAP_2121c.1、MAV_3252.1、MAV_3239.1 和MAV_1600.1的探针使得能够区分结核分枝杆菌感染和鸟分枝杆菌或鸟分枝杆菌副结核亚种感染。针对既对遍及分枝杆菌属保守又仅对结核分枝杆菌特异的基因设计探针。泛分枝杆菌探针识别多个种，而结核分枝杆菌探针为高度特异的(图22C)。金黄色葡萄球菌和嗜麦芽糖寡养单胞菌利用表2所述生物鉴定探针，使用针对5个金黄色葡萄球菌基因(ileS、ppnK、pyrB.rocD和uvrC)设计的探针正确鉴定出3个金黄色葡萄球菌隔离群(图30)。类似地，使用针对6个嗜麦芽糖寡养单胞菌基因(clpP、dnaK、purC、purF、sdhA和secD)设计的探针正确鉴定出3个嗜麦芽糖寡养单胞菌隔离群(表2 ;以及图31)。实施例2 :方法的灵敏性如图7-10所示，本方法对各种关注病原体为特异的并且在临床样品(例如血和尿)中灵敏地检测少于100个细胞。用24基因探针集探查分离自三种病原体的每一种的RNA(Ing)(图7)。大肠杆菌基因，左；肺炎克雷伯氏菌基因，中；铜绿假单胞菌基因，右。大肠杆菌RNA，上；肺炎克雷伯氏菌，中；铜绿假单胞菌，下。y轴显示如通过利用数字基因表达技术所测定的对每个基因的计数数量。来自各个生物的RNA显示不同的表达特征，其允许容易地鉴定各种病原体。将此24基因探针集用于探查来自10，000个细胞、1000个细胞和100个细胞的粗制大肠杆菌裂解物(图8)。可区分低至100个细胞的不同的大肠杆菌表达特征。在经掺加(spiked)的尿样和血样中模拟临床样品。在经掺加的尿样中，用105个大肠杆菌/mL尿掺加尿样。使样品在4°C冷藏过夜，然后将所述粗制细菌样品裂解并使用用于革兰氏阴性菌的24-基因探针集探查以鉴定大肠杆菌(图9A上图和9B)。将血以1000cfu/ml掺加并且亦用24-基因探针集探查(图9A下图)。使用用于革兰氏阴性菌 的24-基因探针集探查铜绿假单胞菌的2个临床隔离群(获自Brigham和Women临床微生物学实验室)以证实所述基因集能够鉴定相同细菌属的临床多样化菌株(图10)。直接在尿样中鉴定大肠杆菌。使大肠杆菌菌株K12在LB培养基中于37°C生长至对数培养晚期。然后向来自健康供体的尿液标本中加入细菌至100，OOOcfu/ml的终浓度(如通过OD6tltl所估计)。然后将尿样置于室温下达O小时、4小时、24小时或48小时或者置于4°C达24小时。将Iml经掺加的尿在13，OOOx g离心I分钟。去除上清液；用100微升LB培养基重悬沉淀物。用Bacteria RNase Protect (Qiagen)处理细菌,然后在异硫氰酸胍(guianidinium isothiocyanate)裂解缓冲液(RLT缓冲液,Qiagen)中裂解细菌。依照制造商方案将裂解物用于nCounter System测定。直接测定患者尿液标本的等分部分以检测尿路感染中的大肠杆菌转录物(图22D)。为了将来自多种转录物的信号简化成评价生物存在或不存在的单一度量，将来自每个探针的原始计数对数转换并求和。当应用于一组17个临床大肠杆菌隔离群时，各个隔离群容易地区别于一组13个无大肠杆菌样品(相对于无大肠杆菌对照，Z分数> 6. 5，图22E)。实施例3 :病原体的药物敏感性大肠杆菌中氟喹诺酮抗性和氨基糖苷抗性的鉴定。利用大肠杆菌在暴露给氟喹诺酮和氨基糖苷时已公布的表达阵列数据(Sangurdekar DP, Srienc F, Khodursky AB. Aclassification based framework for quantitative description oflarge-scalemicroarray data. Genome Biol2006 ；7 (4) :R32),选择预期其在暴露给氟喹诺酮和氨基糖苷时显著减量调节或增量调节的基因集。使泛敏感性实验室菌株(K12)、抗氟喹诺酮临床隔离群I和2以及抗庆大霉素临床隔离群(E2729181和EB894940)在LB培养基中于37°C生长至对数期。取出各培养物的2ml等分部分，并且向所述等分部分中加入抗生素至8 μ g/ml环丙沙星或128 μ g/ml庆大霉素的终浓度。将培养物在37°C孵育10分钟。向100微升异硫氰酸胍裂解缓冲液中加入5微升各培养物并涡旋5秒钟。依照制造商方案将裂解物用于nCounter System测定。将计数对proC的计数标准化；proC似乎再次为实验之间最具可比性的；通过比较在存在和不存在抗生素暴露时的计数来确定每个基因的倍数诱导。来自 9 个探针(carA、deoC、flgF、htrL、recA、uvrA、ybhK、uup 和 fabD)的明确信号显示了在药物敏感性K12菌株中诱导或阻遏，这将其与2个抗药性临床隔离群区分开(图11)。第十个探针wbbK既不诱导也不阻遏，给具有变化表达的基因提供有用的比较。类似地，针对8个基因的探针显示这些基因在药物敏感性K12菌株中阻遏(flgF、CySD、glnA、opgG)或诱导(ftsQ、bl649、recA、dinD)，这将其与2个抗药性临床隔离群区分开(图12)。葡萄球菌(Staphylococcus)中甲氧西林抗性的鉴定。使6个金黄色葡萄球菌临床隔离群在LB培养基中于37°C生长至对数期。然后取出各培养物的2ml等分部分；加入氯唑西林至25 μ g/ml的终浓度。将培养物在37°C孵育30分钟。向100微升异硫氰酸胍裂解缓冲液中加入5微升各培养物并润旋5秒钟。依照制造商方案将裂解物用于nCounter System测定。利用两个独立的探针(表2)，在已知为抗甲氧西林的4个隔离群中鉴定mecA表达。相比之下，在已知为甲氧西林敏感性的2个隔离群中没有可检测的mecA表达，在不存在氯唑西林时有极微的mecA表达(图13)。肠球菌中万古霉素抗性的鉴定。使4个肠球菌临床隔离群在LB培养基中于37°C生长至对数期。取出2ml等分部分；加入万古霉素至128 μ g/ml的终浓度。将培养物在37°C·孵育30分钟。向100微升异硫氰酸胍裂解缓冲液中加入5微升各培养物并涡旋5秒钟。依照制造商方案将裂解物用于nCounter System测定。利用两个独立的探针(表2),在已知为抗万古霉素的2个隔离群中鉴定vanA表达。相比之下，在已知为万古霉素敏感性的2个隔离群中没有可检测的vanA表达，在不存在万古霉素时有极微的vanA表达(图14)。在所述4个隔离群的任何中均无可检测的vanB表达。除检测转录物用于生物鉴定之外，检测在可动遗传因子上编码的基因可提供关于特定隔离群的更多基因组详情。例如，探查细菌隔离群的meCAmRNA(其在葡萄球菌中赋予对甲氧西林的抗药性)和vanA mRNA(其在肠球菌中赋予对万古霉素的抗药性)。在两种情况下，检测允许快速鉴定MRSA和抗万古霉素肠球菌(VRE)的相关转录物(图22F)。因此，RNA的直接检测能够检出已知的抗药性元件。此外，此方法能够通过其他遗传因子(例如通过在食物传播病原体中的水平基因交换获得的毒力因子，即肠出血性大肠杆菌或产志贺毒素大肠杆菌中的志贺毒素(Shiga toxin))来辨别隔离群。TB中抗药性的鉴定。自公布的基因表达数据中鉴定24基因探针集以鉴定表达特征，所述表达特征将允许鉴定药物敏感性TB在暴露给不同抗生素时的表达变化，所述抗生素包括异烟肼(isoniaid)、利福平、链霉素和氟喹诺酮(图15-18)。药物暴露后诱导或阻遏的量在表3中显示。在存在四种不同的药物(异烟肼，0.4 μ g/ml ;链霉素，2 μ g/ml ;氧氟沙星，5 μ g/ml ;利福平，0. 5 μ g/ml)之一的情况下，使处于A_0. 3的对数期结核分枝杆菌在墨水池(inkwell)瓶(IOml体积，平行培养)中生长。在开始药物治疗之后的指定时间(图15)，通过离心(3000xg，5分钟)收获培养物，用Iml Trizol重悬并且以珠粒搅打(IOOnm玻璃珠，最大速度，两次I分钟脉冲)。向样品中加入氯仿(0. 2ml),接着以6000xg离心5分钟，收集水相用于分析。以1: 10稀释样品并依照制造商方案利用表2所述NanoString 探针集分析。首先通过对三个持家基因(sigA、rpoB和mpt64)的平均计数标准化来计算各转录物的相对丰度，然后将数据绘制为相对于来自未处理对照的样品的倍数变化。框表示基于药物特异性诱导的先前证据选择的探针(Boshoff 等，JBiol Chem. 2004,279(38) :40174-84.)。抗药性TB菌株相比于药物敏感株在暴露给异烟肼时未显示表达特征诱导，药物敏感株在异烟肼暴露时清楚地显示表达特征的诱导(图16)。图16显示了比较异烟肼敏感性和抗性TB菌株的三个散点图，每个点代表24个基因探针之一。轴报告如通过数字基因表达技术(NanoString )测定的转录物数量。左——无药物处理的情况下异烟肼抗性株和异烟肼敏感株中表达的比较。中——经药物处理与未经药物处理的异烟肼敏感株中表达的比较。右——经药物处理与未经药物处理的异烟肼抗性株中表达的比较。根据图17所示药物，在药物敏感性结核分枝杆菌中诱导不同的基因集。药物敏感性和抗药性结核分枝杆菌的转录反应(A)如本文所述用INH(OjygAil)处理菌株A50 (INH-R)。(B)用2 μ g/ml链霉素处理SM-R克隆S10。可通过TB24基因探针集的数字基因表达来测定差异基因诱导，以显示清楚的特征并允许药物敏感性的鉴定(图18)。将二个持豕基因mpt64、rpoB和sigA用于标准化。对于每个实验样品，将实验基因的原始计数对这三个持家基因原始计数的平均值标准化，提供试验基因相对于对照基因的丰度测定。将诱导或阻遏定义为经药物暴露的样品相对于未药物暴露的样品在这些标准化计数上的变化。利用此方法，发现下列基因在暴露给异烟肼、利福平、氟喹诺酮和链霉素之后，在药物敏感性TB中受到诱导或阻遏。异烟肼对于药物依赖性诱导kasA、fadD32、accD6、efpA和Rv3675.1。利福平对于药物依赖性诱导bioD、his1、era和Rv2296。氟喹诺酮对于药物依赖性诱导rpsR、alkA、recA、Itpl和Ihr ;对于药物依赖性阻遏kasA 和 accD6。链霉素对于药物依赖性诱导CHP、bcpB、gcvB和groEL。实施例4 :利用带有分子条形码的数字基因表达鉴定药物敏感性和抗药性TB的基于表型表达特征的试验本实施例描述了用于诊断痰中TB并快速确定抗药谱的基于表型表达特征的试验。所述方法基于在创建带条形码的成对分子探针的探针集的情况下对基因的检测，所述基因的表达谱将唯一检出TB并区分抗药株和药物敏感株。基因的选择通过表达谱数据的生物信息学分析来确定，所述表达谱数据在不同生长条件下利用微阵列获得，包括纯性培养中的TB (复制和非复制状态二者)、细胞培养的巨噬细胞中的TB以及掺加到痰中的TB。A.确定用于TB鉴定的特征已鉴定一组分子探针，其与来自复制和非复制TB 二者的mRNA特异性杂交。所述探针对下列mRNA为特异的，所述mRNA在所有生长条件下为高丰度的并且跨越所有TB菌株为保守的。尽管先前已确定独特DNA序列以鉴定TB识别16S rRNA(Amplicor, Roche)或IS6110区(Gen-piObe)，但这些确定的区不具有数字基因表达中的特征所需的最佳特征。16S rRNA在分枝杆菌物种中没有足够分歧而不能利用50-碱基寡聚物基因探针区分不同的种，所述探针因其长度所致可容许低水平的遗传变异性。基因组的IS6110区并非在所有生长条件下以足够高的水平表达，而不允许其被用作鉴定TB的稳健信号。因此，描述了一种表达特征，其将允许自其他分枝杆菌物种中鉴定出TB。1.对保守TB基因的生物信息学基因分析。已确定用于相对于其他分枝杆菌物种检测TB的独特表达特征。一般而言，用于包含在特征中的最佳基因将满足下列标准1.具有高表达水平(高mRNA拷贝数)以增加灵敏性，2.跨越所有TB菌株为高度保守的并且具有高度保守的序列，和3.相对于所有其他分枝杆菌物种对TB基因组为高度特异的。利用可得TB基因组中保守基因的生物信息学分析鉴定这类基因，所述TB基因组并非存在于所有其他测序的分枝杆菌属(即海分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌(M. avium-1ntracelIulaire)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌)中。可得到来自临床分离株的超过40个TB基因组用于分析,所述基因组已在Broad Institute测序。i1.候选基因mRNA水平的表达谱分析。选择用于检测痰中TB杆菌的分子探针的第二个标准为，它们与高丰度的稳定的mRNA杂交以使灵敏性最高。预期这类mRNA对应于基本的持家基因。利用对数据库(在Broad Institute和Stanford University (tbdb.org)创建)中的现存公开可得表达数据的生物信息学分析和对TB菌株H37Rv的实验表达谱的组合来选择基因，所述实验表达谱利用表达概况分析来确证候选基因在允许复制(对数生长)和不允许复制(通过碳饥饿、稳定期和低氧来诱导)的条件下的高水平表达。对H37Rv的表达概况分析实验使用已建立的TB碳饥饿模型(在7H9/四丁酚醛中饥饿培养5周)、稳定期生长以及用于厌氧生长的Wayne模型(在密闭管中缓慢搅动培养物)进行。，将Solexa/IIIumina测序用于通过将mRNA转换成cDNA和将测序用于计数cDNA分子而确定表达谱。用于鉴定表达水平的此定量方法比微阵列数据更可能反映利用数字基因表达获得的水平，并且其为已使用BroadInstitute测序平台建立的方法。有可能进行多路测定12个样品/测序泳道，假定75bp读出和I千万读出/泳道。
ii1.鉴定TB的表达特征的探针选择。由于所述数字基因表达技术基于两种50个核苷酸探针与关注mRNA的杂交，因此自(Ai)和(Aii)鉴定基因中的两个50个碱基对的区，所述区在基因组内为唯一的以使非特异性杂交减到最少，并且如测序的TB基因组所证实，其包含最少多态性。以生物信息学法选择探针，以在5度解链温度窗口内适合并具有最少mRNA 二级结构。利用可得技术针对分离自复制和无复制TB (包括多个菌株，即H37Rv、⑶C1551、FlU Erdman)、海分枝杆菌、胞内海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌(M. kansaii)和偶发分枝杆菌的mRNA测试探针，以确证整个探针集的特异性。可针对这些其他的分枝杆菌物种选择探针，其将同样允许自痰中鉴定这些病原体。在感染的巨噬细胞模型中测试鉴定胞内杆菌的能力，以证实在宿主mRNA存在下检测TB mRNA的能力。最后,通过向下滴定试样中的TB杆菌的数量(和因此存在于细胞裂解物中的mRNA)来确定测定的灵敏性。利用数字基因表达的所有实验使用针对相同基因集的定量RT-PCR来确证。所述集合的改进和精化将以迭代方式进行。B.确定特征以区分敏感性和抗药性TB已鉴定与mRNA杂交的一组分子探针，其允许获得区分药物敏感株和抗药株的特征，所述mRNA在暴露给各单独的TB药物时被特异性诱导。已确定暴露给异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和莫西沙星的特征。对于待包含在特征中的理想基因，除以上特性(即跨越TB菌株为保守的、对TB基因组为特异的)之外，在选择用于抗药性特征的基因上，还要优先考虑数个其他特性。由于抗药性将通过药物敏感株和抗药株的转录物诱导之间的差异来确定，理想的候选基因应在暴露给给定药物时在药物敏感株中高度诱导。理想的是，早期和快速地诱导这些基因，因为这段时间将在很大程度上决定整个诊断试验的速度。基于使用qRT-PCR的数据，在短达1-2小时中观察到对药物暴露的转录反应(图19)。考虑到mRNA分子的半寿期，利用基因诱导而非利用基因阻遏提供更快且更可检测的反应。对于涉及异烟肼和链霉素的所有描述的实验，将TB菌株H37Rv用于BSL3环境，其中已产生一组单独抗药株以用于与野生型完全药物敏感性H37Rv对比。为了确保利福平在实验室获得性感染的不可能事件中仍然是治疗选项，将在TB的营养缺陷型菌株(lysA、panC)中产生抗利福平突变型，所述TB的营养缺陷型菌株需要加入赖氨酸和泛酸盐用于生长。最后，鉴定了对每种抗生素唯一的特征而非对任何或所有抗生素的普遍应激反应。此特异性的基本原理为，在临床环境中，许多患者已用不同的抗生素经验地治疗，并因此可能已在痰样内的杆菌中激活一些普遍的应激反应。然而，保留药物特异性反应用于测试和分析。1.响应抗生素暴露的表达概况分析。进行了表达概况分析以鉴定候选基因，所述候选基因区分在H37Rv的药物敏感株和抗药株中的转录反应。由于杆菌在痰中的复制状态或转录活性为未知的，因此对非复制(通过5周碳饥饿模型诱导)杆菌进行附加的实验。其将确定非复制杆菌在丰富培养基(7H9/0ADC)中是否需要短时间U1)的“生长刺激”以刺激一些基础转录，所述基础转录之后可响应药物暴露(图20)。亦确定了为了获得区分药物敏感株和抗药株的稳健特征以及最佳药物浓度对药物暴露而言所需的最佳时间(t2)，以获得稳健的可重现的反应。对每个单独的抗生物素进行这些实验。如果痰中杆菌处于非复制的休眠状态，则完全非复制状态为“最坏情况”(即将需要最长时间)。实际上，基于检查患者痰中杆菌的表达谱的已公布工作，如果真的需要的话，此时间将极其短，假定表达谱直接获自痰杆菌。(注意，此公布数据亦将结合到分析中以提供对痰中细菌的可能候选基因的最初见识。)进行概况分析实验矩阵，从0、1和2小时改变暴露给富含7H9/0ADC培养基的时间U1);对于每个t1;改变暴露给各抗生素的时间(t2)。对于敏感性和抗药性H37Rv菌株二者，对于每组和t2，对各抗生物素从最小抑菌浓度(MIC)的lx、3x和5x改变抗生素浓度，以确定最佳参数。表达概况分析将用来鉴定用于产生稳健的可重现特征的最适条件。基于最适条件U1和t2)，在这些条件下对药物敏感性和抗药性H37Rv菌株进行表达谱分析。进行生物信息学分析以鉴定用于每种药物的基因，其中药物敏感株中的诱导水平比抗药株高(除在利福平中之外，其中药物敏感株中的阻遏水平比抗药株高)。在药物敏感株和抗药株之间比较表达水平并通过定量RT-PCR确证表达水平。i1.开发分析算法以鉴定抗药性。确定了优化算法以分析基因集的表达比率，所述表达比率区分敏感株和抗药株(如通过标准MIC测定所确定的)。本方法的优势之一为，对于大多数情况(即未经预暴露给TB抗生素的那些情况)，可在未经暴露给给定抗生素和暴露给给定抗生素的相同菌株的基因表达水平之间完成比较。将定量RT-PCR用于在下列条件下自H37Rv测定mRNA水平，所述条件包括1.未暴露给抗生素，2.暴露给异烟肼，3.暴露给利福平，4.暴露给乙胺丁醇，5.暴露给链霉素，和6.暴露给莫西沙星。将暴露给抗生素之后的给定基因的表达水平对来自一组稳态持家基因(即sigA，其编码刺激持家基因转录的主要σ因子；和rpoB，其编码RNA聚合酶的合成亚基)的表达水平标准化，并与经同样标准化的无抗生素暴露情况下相同基因的表达水平进行比较。亦与标准的敏感性和抗药性对照菌株进行比较(图21)。理想的是，暴露给特定药物将诱导药物敏感株中的基因表达至高水平，A >> B，而对于对药物暴露不敏感的抗药株，A = B。(对于利福平将有例外，其中鉴于利福平的机制，检测具有最短半寿期的mRNA的基因阻遏，即A = C<<B = D。)由于转录水平的大动态范围，选择对其而言C/D比率为最大的基因，从而允许敏感株和抗药株的明显强烈的差异。此外，对于每个单独的抗生素选择最佳唯一的基因集，使得在诱导反应上与其他抗生素没有重叠。ii1.预先抗生素暴露对TB杆菌特征的影响的分析。为了确定这些特征即使在患者已用抗生素预治疗的情况下鉴定抗药性模式的有效性，在施用此测试之前，将药物敏感性和抗药性TB杆菌(复制、非复制，巨噬细胞内)预暴露给阿莫西林、头孢菌素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和红霉素，其为在TB地方性环境中患者可能暴露给其的普通抗生素。亦进行TB杆菌对当前TB药物的不同组合的预暴露，以确定这类预暴露是否也会影响转录反应和我们检测这类反应的能力。应保留独特的特征，因而不会削弱我们确定抗药性的能力。关注基因集的基因表达水平将使用定量RT-PCR确定。iv.表达特征的探针选择以鉴定抗药谱。基于在Sub-aim Bi中获得的数据,选择了一组候选基因，所述候选基因将产生用于对抗生素暴露的转录反应的特征。在整个TB基因组内高度保守的区内选择用于每个基因的两个50个碱基对的区。以生物信息学法选择探针，以在5度解链温度窗口内适合并具有最少mRNA 二级结构。这些探针将用于在下述条件下利用可得的技术比较药物敏感株和抗药株，包括纯性培养中最初复制或非复制的杆 菌、我们实验室现有的细胞培养巨噬细胞感染模型中的胞内杆菌以及预暴露给不同抗生素组合的细菌。将所有结果与通过定量RT-PCR获得的数据进行比较。所述集合的改进和精化将以迭代方式进行。C.优化样品处理用于带有分子条形码的数字基因表达。除确定用于鉴定表达特征的探针集之外，第二个主要挑战为优化样品处理以从存在于样品内的杆菌测定数字基因表达。由于大多数TB病例为肺起源的以及大多数待处理的样品为患者痰，因此优化痰样的处理以从感染性TB杆菌获得mRNA测定。使用经掺加的痰模型，其中用处于复制或非复制(碳饥饿)状态的TB杆菌掺加收集自健康未感染患者(其未用抗生素治疗)的痰。待处理的问题包括处理痰的可变粘度以及有效地在痰样内裂解TB杆菌。数字基因表达的主要优点之一为使mRNA在极其粗制的样品中与其各自的探针杂交的能力，所述样品包括粗制的细胞裂解物、固定的组织样品、全血和尿中的细胞、来自蜱的粗制裂解物的细胞以及含有400mM异硫氰酸胍(GITC)、聚丙烯酰胺和trizol的样品。因此，最初迹象表明，在裂解痰内的细菌后将不需要纯化步骤，因为全血、尿或固定的组织样品已不需要纯化。仅需要充分混合以允许探针与mRNA之间的接触。对于这些实验，未感染的痰获自Brigham和Women’ s医院(BWH)标本库。所述标本库为IRB管理的单位，由BWH病理科的Lyn Bry,MD, PhD管理。废弃的痰将在实验室中完成所有处理之后获得(一般在收集的12-24小时之内)。仅从前48个小时中未接受任何抗生素的受试者中收集痰。将所有样品去识别化并且收集未受保护的卫生信息。基于标本实验室的当前工作量，在大约数周内获得所需量的痰(25-50mL)。1.痰处理。痰样在细菌接种量、稠度和粘度上不同。测试了数种方法使以下速度达到最大，细菌以所述速度与培养基条件中杀菌水平的抗生素接触并暴露给寡聚物探针以杂交。使用了处理痰的数种方法，包括不处理、使痰通过注射器针头、用溶菌酶和/或DNA酶、Sputalysin (Calbiochem ；0.1 % DTT,标准地用于处理来自囊性纤维化患者的痰)处理或者将样品简单稀释到某些轻微变性剂(即GITC)中。用H37Rv掺加痰并通过多种方法处理以改变其粘度，进行上述以确定这些方法中的任一种是否干扰所述技术。
i1.用TB杆菌掺加的痰中的细菌裂解。在测定中使用了有效裂解细菌细胞、阻止转录和基于酶的mRNA降解以及使mRNA易接近探针的数种方法。检测痰中细菌转录反应的先前研究首先向样品中加入GTC或类似试剂以阻止转录反应。然后可在GTC处理后使用离心自痰样中浓缩细菌。分枝杆菌的裂解通常通过物理方法完成，即用O.1ml玻璃珠或锆珠匀浆。开发这类物理方法破碎经处理痰内的细菌，以利用来自IA的经设计以检测TB杆菌的探针集分析掺加到未感染人痰中的杆菌。用于裂解的备选方法可能更遵从基于领域的考虑，包括噬菌体裂解。加入噬菌体或者更优化的纯化的噬菌体溶素可提供用于细菌裂解的低成本、简易且非电的选项。Fischetti实验室(Rockefeller University)近期已证实利用纯化的卩遼菌体溶素快速并彻底裂解数种革兰氏阳性物种，所述噬菌体溶素以酶法水解肽聚糖，导致渗透性裂解。Hatfull实验室(University of Pittsburgh)目前正致力于从数种裂解性分枝杆菌卩遼菌体 表征LysA酶的活性并优化其性能。在不存在纯化的溶素时，进行研究以确定裂解性噬菌体例如D29对TB的高MOI感染可否在痰中有效地裂解TB。目前不清楚此方法将如何影响细菌的转录谱，因为其将可能需要在不存在变性剂的情况下进行，所述变性剂会影响噬菌体的结合、进入和随后的裂解性质。分枝杆菌噬菌体TM4亦表达具有肽聚糖水解酶活性的结构蛋白Tmp，所述Tmp可允许将其用作高MOI下细胞裂解的快速方法。一旦裂解，用GITC、RNAlater或者可钝化内源RNA酶活性的其他试剂稳定mRNA。实施例5:细菌和真菌培养使大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、斯氏普罗威登斯菌、奇异变形菌(P. mirabilis)、粘质沙雷氏菌(S. marcescens)、产气肠杆菌(E. aerogenes)、阴沟肠杆菌(E. cloacae)、摩氏摩根氏菌(M. morganu)、产酸克雷伯氏菌(K. oxytoca)、弗氏朽1檬酸杆菌(C. freundii)或白假丝酵母(C. albicans)在Luria-Bertani培养基(LB)中生长至OD6tltl约为I。对于混合实验,在裂解用于NanoString 分析之前，将如通过OD6c 所确定的相等数量的细菌组合。如上所述在收获或抗生素暴露之前，使分枝杆菌隔离群在Middlebrook7H9培养基中生长至对数中期。抗药性实验室菌株的衍生自Hooper实验室，Massachusetts GeneralHospital,Boston, MA获得在gyrA中具有限定的抗氟喹诺酮染色体突变(gyrAl_G81D ;gyrA2_S83L)的大肠杆菌实验室菌株J53。从预先确定含有这些质粒的临床隔离群中纯化血浆介导的喹诺酮抗性决定簇(oqxAB、qnrB、aac6_Ib)。用这些质粒转化大肠杆菌亲株J53,并且用PCR确证其存在。病毒和疟原虫感染在所示的MOI下分别用HSV-1菌株KOS和HSV-1菌株186Syn+、A 型流感 PR8 或 HIV-1NL-ADA 感染 HeLa 细胞(IxlO6)、293T 细胞(2χ105)和人外周血单核细胞(5χ105)。用恶性疟原虫菌株3D7感染原代红细胞(5χ109)直至其达到指定的寄生虫血症水平。在所示的时间，将所述细胞用PBS清洗一次并采集。抗生素暴露使大肠杆菌或铜绿假单胞菌的培养物在LB中生长至0D_约为I。然后将培养物分成两个样品，其中之一用抗生素处理(大肠杆菌处理10分钟环丙沙星4-8 μ〖/!!11或300叩/1111、庆大霉素64或128 4 g/ml或者氨节西林500 μ g/ml ;铜绿假单胞菌处理30分钟环丙沙星16 μ g/ml)。将处理部分和未处理部分二者维持在37°C，以200rpm振荡。使金黄色葡萄球菌或屎肠球菌的培养物在LB中生长至OD6c 约为I。然后将培养物分别暴露给氯唑西林(25μ g/mL)或万古霉素(128μ g/mL)达30分钟。使结核分枝杆菌的培养物生长至对数中期，然后对0D_0. 2标准化。不用抗生素或用以下抗生素之一(终浓度)处理2ml各培养物异烟肼O. 2-1. O μ g/ml ;链霉素5 μ g/ml、利福平O. 5 μ g/ml或环丙沙星5 μ g/ml。将平板密封并在无振荡的情况下孵育3或6小时。然后制备裂解物并如上所述使用表6所列探针分析。样品处理对于革兰氏阴性隔离群，将5-10μ I培养物直接加入100μ IRLT缓冲液中并涡旋。对于临床标本，将来自患者的20 μ I尿直接加入100 μ IRLT缓冲液中，所述患者经临床实验室确定为患有大肠杆菌尿路感染。对于分枝杆菌，将1. 5ml培养物离心,然后用Trizol(Gibco)重悬，进行或不进行通过珠粒搅打的机械破碎，收集最初水相用于分析。使用Trizol和氯仿类似地制备病毒和寄生虫RNA。对于所有裂解物，依照标准NanoString 方案，将3-5 μ I直接用于杂交。将原始计数对样品的所有探针的平均值标准化，并且通过将抗生素处理的样品与未经抗生素处理的样品比较来确定每个基因的倍数诱导。生物鉴定探针的选择为了选择NanoString 探针用于生物的示差检测，将相关生物的所有公开可得经测序的基因组进行比对。通过选择与所述物种的所有经测序基因组的至少70%编码序列(⑶S)长度具有至少50%同一性的⑶S，来鉴定在各物种之内保守的基因。将CDS断裂成重叠的50-聚体并且仅保留以下50-聚体，所述50-聚体在物种内完全保守并且与研究中任何其他物种的CDS具有不高于50%的同一性。回顾了 GeneExpression Omnibus中可得的已公布表达数据，并且选择在多数条件下良好表达的基因。为了鉴定唯一的结核分枝杆菌探针，使用已公布的微阵列数据鉴定落入以下两类之一的高表达基因结核分枝杆菌复合物独有的类别(使用BLASTN与非冗余数据库中的任何其他基因具有>70%同一性并且跨越所有可得的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(Ebovis)基因组为保守的)，以及在一组临床上相关的分枝杆菌(包括结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌)内具有>85%同一性的类别。针对白假丝酵母基因组的50-聚体区段设计白假丝酵母探针，所述50-聚体区段与包含在其探针集中的十个附加病原生物的完整基因组相比为唯一的。针对在病毒(即所有HSV-2或HIV-1隔离群)内高度保守的基因设计病毒探针，所述基因在相同家族内的病毒之间(即HSV-1和HSV-2之间)较不保守。针对在寄生虫生命周期的每个血阶段中大量表达的基因设计恶性疟原虫探针。对所有探针进行筛选以 避免与人RNA的交叉杂交。探针集对于革兰氏阴性生物鉴定，使用包含用于大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌的探针的合并探针集。对于分枝杆菌生物鉴定，用于结核分枝杆菌的种特异性探针和更广泛的分枝杆菌属探针在针对微生物病原体的更大探针集中。为在暴露给不同抗微生物剂时差异调节的基因设计探针，以测定反应的存在或不存在(Sangurdekar 等，Genome Biology7, R32 (2006) ;Anderson 等，Infect.1mmun. 76,1423-1433, (2008) ；Brazas 和 Hancock, Antimicrob. AgentsChemother. 49,3222-3227,(2005))。在将野生型大肠杆菌K-12暴露给环丙沙星、庆大霉素或氨苄西林10-30分钟之后，观察到在转录物水平上的预期改变，所述改变一起限定用于各抗生素的药物敏感性表达特征(图23Α和23Β，表7)。在相应的抗药株中没有引出这些特征(图23Α和23Β)。快速表型药物敏感性测试将在结核病中造成尤其深远的影响，因为已建立的用于表型测试的方法花费数周至数月(Minion等,Lancet Infect DislO, 688-698, (2010))。响应抗结核药异烟肼、环丙沙星和链霉素的表达特征能够在3-6小时抗生素暴露后区分敏感性和抗药性隔离群(图23C)。转录谱中的一些基因为机制特异性的(即对于环丙沙星为recA、alkA和Ihr ;对于链霉素为groEL ;以及对于异烟肼为kasA和accD6)。其它基因尤其是涉及分枝菌酸合成或中间代谢的基因，因响应多种抗生素而减量调节，表明自生长转向损伤控制。为了将这些复杂响应简化成单一定量的度量以区分敏感株和抗药株，利用以下度量，即每个实验样品的表达反应离对照抗生素敏感样品的形心的均方距离(MSD)。抗生素敏感株紧密聚簇，因此具有小MSD。相反地，抗生素抗性株具有较大值，因为许多基因未能以类似于一般敏感株的方式响应抗生素。将MSD报告为无因次的Z分数,表不样品离大肠杆菌(图24A、24B、27和28)或结核分枝杆菌(图24C和29)的敏感性隔离群平均值的标准差数量。由于表达谱反映表型而不是基因型，因此可使用单一整合的表达特征测定通过多种机制介导的抗药性。将环丙沙星敏感性大肠杆菌J53菌株的转录反应与具有不同抗药性 机制的一系列同基因突变型比较两个突变型在氟喹诺酮靶基因拓扑异构酶gyrA中具有单突变(6810或5831^)，三个突变型携有附加型喹诺酮抗性基因，包括&&(3(6’)-113(乙酰化钝化酶)、qnrB(其阻断gyrA的活性部位)和oqxAB(流出泵)。与亲株相比，所有J53衍生物具有高Z分数，反映了抗药性(图24B)。将对异烟肼的反应与一系列敏感性临床隔离群和实验室隔离群以及两个抗异烟肼菌株比较，包括携有在katG(前药激活所需的过氧化氢酶)的突变(S315T)的H37Rv衍生实验室菌株，以及在异烟肼靶标inhA的启动子具有突变(C-15T)的临床隔离群。因它们不同的抗药性机制所致，这两个菌株对异烟肼具有不同水平的抗药性，katG突变型具有高水平抗药性(在最小抑菌浓度(MIC)上> 100倍增加至> 6. 4 μ g/mL)，而inhA启动子突变在MIC上仅具有8倍增加至O. 4 μ g/mL。暴露给低异烟肼浓度(O. 2 μ g/mL)在任一个抗药株中均未引起转录反应,但是在更高异烟肼浓度(lyg/mL)下,inhA突变型以与katG突变型相比敏感的方式反应(图24C)。因此，本方法不仅是机制独立的，而且也可提供区分高水平和低水平抗药性的相对衡量。最后，由于RNA几乎普遍存在于范围从细菌、病毒、真菌到寄生虫的病原体中，因此可将RNA检测整合到适用于跨越广泛范围传染剂的单一诊断平台中。利用一大群混合的病原体探针，我们能够直接和特异地检测信号以鉴定真菌病原体白假丝酵母(图25A)；以剂量依赖性方式在细胞培养物中鉴定人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒和单纯疱疹病毒-2(HSV-2)(图25B-D);以及在受感染红细胞中鉴定恶性疟原虫生命周期的不同阶段(图 25E)。NanoString 数据分析以及对于药物敏感性的距离度量均方距离的计算对于所有经药物处理的样品，首先将每个探针的原始NanoString 计数对每个样品的所有相关(即种适当的)探针的平均值标准化。通过将每个测试条件下经抗生素处理的样品中每个探针的标准化计数与未经处理的基线样品中的相应计数进行比较，确定在转录水平上的倍
数变化。为了将定性的表达特征转换成敏感性或抗药性的二元结果，开发了算法以计算样品的转录谱离暴露给相同药物的敏感株的转录谱的均方距离(MSD)。药物敏感性实验中的MSD度量如下计算1.通过将原始值对样品中所有相关探针计数的平均数标准化，来修正在样品量上的变化。2.选择一组NanoString 探针，我们将其表示为P」。下标j为1-Nsm (所选探针的总数)。将所述分析限于在药物敏感性和抗药性隔离群之间差异变化的探针。3.将药物敏感株的重复定义为Nsanip。对于每个重复，将在药物处理前后对每个探
针P」的标准化计数表示为，i表示样品指数。4.接着计算“对数诱导比率”
权利要求
1.一种确定病原体的药物敏感性的方法，所述方法包括提供包含病原体的样品；使所述样品与一种或多种试验化合物接触以提供试样；在将信使核糖核酸(mRNA)自病原体释放进入试样的条件下处理所述试样；将所述试样暴露给包含多个探针子集的多种核酸探针，其中各子集包含与靶mRNA特异性结合的一种或多种探针，与抗药性生物相比，所述靶mRNA在对试验化合物敏感的生物中差异表达，其中所述暴露在使探针和靶mRNA之间的结合可发生的时间内和条件下进行；确定探针与祀mRNA之间的结合水平,从而确定祀mRNA水平；和将存在试验化合物时的靶mRNA水平与参考水平进行比较，其中所述靶mRNA水平相对于靶mRNA参考水平的差异表明所述病原体对试验化合物是敏感的还是抗性的。
2.权利要求1的方法，其中所述试验化合物为针对病原体的已知或潜在治疗。
3.权利要求1的方法，其中所述方法包括使样品与两种或更多种试验化合物接触。
4.权利要求1的方法，其中使所述样品与一种或多种试验化合物接触达少于4小时。
5.—种鉴定传染病病原体的方法，所述方法包括提供来自疑似被病原体感染的受试者的试样；在释放信使核糖核酸(mRNA)的条件下处理所述试样；将试样暴露给包含多个探针子集的多种核酸探针，其中各子集包含与靶mRNA特异性结合的一种或多种探针，所述靶mRNA唯一地鉴定病原体，其中所述暴露在使探针和靶mRNA之间的结合可发生的时间内和条件下进行；和确定探针与祀mRNA之间的结合水平,从而确定祀mRNA水平；其中试样相对于参考样品在祀mRNA方面的增加,表明试样中病原体的身份。
6.权利要求1或5的方法，其中所述试样选自痰、血、尿、粪便、关节液、脑脊液和子宫颈/阴道拭子。
7.权利要求1或5的方法,其中所述试样包含多种不同的传染病病原体或非致病生物。
8.权利要求1或5的方法,其中所述一种或多种核酸探针选自表2。
9.权利要求1或5的方法，其中所述病原体为细菌、真菌、病毒或寄生虫。
10.权利要求1或5的方法，其中所述病原体为结核分枝杆菌。
11.权利要求1或5的方法，其中所述mRNA在与探针接触之前为粗制的。
12.权利要求1或5的方法，其中所述方法不包括扩增mRNA。
13.权利要求1或5的方法，其中所述方法包括以酶法、化学法或机械法裂解细胞。
14.权利要求1或5的方法，其中所述方法包括微流体装置的使用。
15.权利要求1或5的方法，其中将所述方法用于监测病原体感染。
16.权利要求1的方法，其中所述病原体在来自受试者的样品中。
17.权利要求5或16的方法，其中所述受试者为人。
18.权利要求5或16的方法，其中所述方法进一步包括确定或选择用于受试者的治疗，以及任选给予受试者所述治疗。
19.一种选择用于受试者的治疗的方法，所述方法包括任选用以下方法鉴定来自受试者的样品中的病原体，所述方法包括提供来自疑似被病原体感染的受试者的试样；在释放信使核糖核酸(mRNA)的条件下处理所述试样；将试样暴露给包含多个探针子集的多种核酸探针，其中各子集包含与靶mRNA特异性结合的一种或多种探针，所述靶mRNA唯一地鉴定病原体，其中所述暴露在使探针和靶mRNA之间的结合可发生的时间内和条件下进行；和确定探针与祀mRNA之间的结合水平,从而确定祀mRNA水平；其中试样相对于参考样品在祀mRNA方面的增加,表明试样中病原体的身份；利用权利要求1的方法确定病原体的药物敏感性；以及选择所述病原体对其敏感的药物用于治疗受试者。
20.一种在受试者中监测病原体感染的方法，所述方法包括在第一时间获得包含病原体的第一样品；利用权利要求1的方法确定第一样品中病原体的药物敏感性；任选选择所述病原体对其敏感的治疗并给予受试者所选治疗；在第二时间获得包含病原体的第二样品；利用权利要求1的方法确定第二样品中病原体的药物敏感性；和将第一样品和第二样品中病原体的药物敏感性进行比较，从而在受试者中监测感染。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者为免疫缺损的。
22.权利要求20的方法，其中所述方法包括选择病原体对其敏感的治疗并给予受试者所选治疗，以及利用权利要求1的方法确定第二样品中的病原体对所选治疗的药物敏感性，其中在病原体的药物敏感性上的改变表明所述病原体是对所述治疗有抗性还是变为对所述治疗有抗性。
23.权利要求20的方法，其中在病原体的药物敏感性上的改变表明所述病原体对所述治疗有抗性或变为对所述治疗有抗性，以及所述方法进一步包括给予受试者不同的治疗。
24.一种在受试者群体中监测病原体感染的方法，所述方法包括在第一时间获得来自群体中受试者的第一多种样品；利用权利要求1的方法确定第一多种样品中病原体的药物敏感性，以及任选用以下方法鉴定第一多种样品中的传染病病原体，所述方法包括提供来自疑似被病原体感染的受试者的试样；在释放信使核糖核酸(mRNA)的条件下处理所述试样；将试样暴露给包含多个探针子集的多种核酸探针，其中各子集包含与靶mRNA特异性结合的一种或多种探针，所述靶mRNA唯一地鉴定病原体，其中所述暴露在使探针和靶mRNA之间的结合可发生的时间内和条件下进行；和确定探针与祀mRNA之间的结合水平,从而确定祀mRNA水平；其中试样相对于参考样品在祀mRNA方面的增加,表明试样中病原体的身份；任选给予受试者治疗；在第二时间获得来自群体中受试者的第二多种样品；利用权利要求1的方法确定第二多种样品中病原体的药物敏感性，以及任选用以下方法鉴定第一多种样品中的传染病病原体，所述方法包括提供来自疑似被病原体感染的受试者的试样；在释放信使核糖核酸(mRNA)的条件下处理所述试样；将试样暴露给包含多个探针子集的多种核酸探针，其中各子集包含与靶mRNA特异性结合的一种或多种探针，所述靶mRNA唯一地鉴定病原体，其中所述暴露在使探针和靶mRNA之间的结合可发生的时间内和条件下进行；和确定探针与祀mRNA之间的结合水平,从而确定祀mRNA水平；其中试样相对于参考样品在祀mRNA方面的增加,表明试样中病原体的身份；将第一多种样品和第二多种样品中病原体的药物敏感性以及任选所述病原体的身份进行比较，从而在受试者群体中监测感染。
25.与固相支持体结合的多种多核苷酸，其中所述多种多核苷酸包含至少一种多核苷酸，每种多核苷酸选择性地与选自表2的一个或多个基因杂交。
26.权利要求25的多种多核苷酸，所述多种多核苷酸包括SEQID N0:l_227或其任何组合。
全文摘要
本说明书一般涉及检测、诊断和/或鉴定病原体例如传染病病原体以及确定其药物敏感性和适当的治疗方法的方法。本发明亦一般涉及在单个受试者以及更大的受试者群体中监测病原体感染的方法。
文档编号G01N33/15GK103003446SQ201180020693
公开日2013年3月27日 申请日期2011年2月24日 优先权日2010年2月24日
发明者D.洪, J.戈麦斯, L.科西米, R.尼科尔, M.博罗夫斯基, A.巴查克, A.B.安德东克 申请人:布罗德研究所有限公司, 综合医院公司, 布里格姆妇女医院