专利名称：用于检测和诊断神经变性疾病的诊断性自身抗体谱的制作方法
用于检测和诊断神经变性疾病的诊断性自身抗体谱相关申请的交叉引用本申请要求2010年5月13日提交的美国临时申请第61/334，466号和2011年2月21日提交的美国临时申请第61/444，932号的优先权，其公开的内容通过引用整体并入本文。
背景技术：
自身抗体是由个体免疫系统产生的针对个体自身蛋白抗原的抗体。正常情况下，响应体内的外源性蛋白或物质而产生抗体，所述外源性蛋白或物质通常为作为感染性生物的病原体。正常情况下，免疫系统能够识别和忽略机体的自身细胞，并且不对环境中的非威胁性物质(例如食物)进行过度反应。然而，有时，免疫系统停止将一种或多种机体的正常组分识别为“本体”，导致产生自身抗体。这些自身抗体攻击机体的自身细胞、组织和/或器官，导致炎症和损伤。血清自身抗体参与多种神经性疾病和综合症。已经从源自表现出强迫症、西德纳姆舞蹈病、链球菌感染相关性儿童自身免疫神经精神障碍(“PANDAS”)以及桥本氏脑病的个体的血清中检测到了结合神经元的自身抗体。精神分裂症也与自身抗体的出现有关，包括数种针对神经表面受体的自身抗体。已知由抗核抗体导致的系统性红斑狼疮(“SLE”)具有与一组抗DNA抗体的出现相吻合的认知和记忆丧失组分，所述抗DNA抗体与N-甲基-D-天冬氨酸受体(“NMDAR”)交叉反应。另外，在将自闭症儿童母亲的脑反应性抗体施用于怀孕哺乳动物时引发了行为异常。另外，在神经变性疾病中，发现自身抗体已见于帕金森氏病、自闭症谱系障碍、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆以及阿尔茨海默病(“AD”)。在阿尔茨海默病的情况下，有许多文献报道了患者具有高滴度的针对非脑和脑相关靶的自身抗体，包括结合神经元的自身抗体。另外，已经鉴定了数种特异性自身抗体靶，包括醛缩酶、神经丝重亚基、组蛋白、微管蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白以及S-100。阿尔茨海默病(AD)是一种老年人的进行性和破坏性神经变性疾病，其体现为显著的记忆和认知减退，与神经元和突触的损失有关(Selkoe (2002) Science298，789-91)。其他的关键病理特征包括神经元中沉积的淀粉样蛋白(Αβ)，尤其是42氨基酸肽(Αβ 42)，和脑血管壁中的淀粉样蛋白斑块，以及出现神经原纤维缠结、神经胶质激活以及广泛的炎症(Schwab et al.(2008) J Alzheimers Disl3, 359-69 ；Thal et al.(2008)Acta Neuropathol 115, 599-609 ；ffeisman et al.(2006)Vitam Horm74, 505-30)。神经元中的Αβ 42沉积始于疾病过程早期，之后是淀粉样蛋白斑块和缠结形成，在时间和空间上与人阿尔茨海默病和转基因小鼠脑中的突触损失相符合(D’Andrea et al.(2001)Histopathology38, 120-134 ；Nagele et al.(2002)J Neurosci110, 199-211 ；Gouras etal.(2000) Am J Path0.156，15-20)。这导致提出A β沉积物的逐渐生长可进行性破坏神经元支持其广泛的树突棘的能力，由此促成早期突触损失，最终表现出先兆性症状(telltalesymptoms)。
有研究报道，在死者的阿尔茨海默病脑组织切片中存在免疫球蛋白(Ig)免疫阳性神经元，这极少见于在年龄匹配的非痴呆对照的相当脑区中(Stein et al.(2002)J Neuropathol Exp Neurol61, 1100-8 ;Bouras et al.(2005)Brain Res Brain ResRev48, 477-87 ；Of Andrea(2003)Brain Res Brain Res Rev982, 19-30)。还有报道在阿尔茨海默病患者血清中存在特异性脑反应性自身抗体(Bouras et al.(2005)Brain ResBrain Res Rev48, 477-87；Kulmala et al.(1987)Exp Aging Resl3, 67-72 ;Mecocci etal.(1993)Biol Psychiatry34, 380-5 ；Mecocci et al.(1995)J Neuroimmuno157, 165-70 ；Weksler et al.(2002)Exp Gerontol37, 971-979)。
自闭症谱系障碍(“ASD”)是一组脑发育障碍的疾病，包括自闭症、阿斯伯格综合征、雷特病以及儿童期崩解症(childhood disintegrative disorder)。自闭症谱系障碍的特征为社会行为和沟通损害，通常表现于儿童期的最初36个月内(American PsychiatricAssociation:Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, FourthEdition (2000))。显著比例(20-30%)的自闭症患者经历自闭性退化期，在此过程中，其经历了先前在语言和行为技能上所获取的能力的丧失(Fombonne (2003) JAMA289，87-89)。令人费解的是，自闭症谱系障碍的流行显著增加，此发现并非是由于诊断改进，而是表明与某些环境因素有关。目前，自闭症系障碍影响1:150的儿童，其病因很大程度上未知，但可能是多因素的(Fombonne, 2003)。
自闭症患者的神经病理学和神经影像研究报道了脑尺寸和重量增加(Bailey etal.(1998)Psychol Med25, 63-77 ；Kemper and Bauman(1998)Neurol Clinicl, 175-87 ；Palmen et al.(2004) Brainl27, 2572-2583)。许多自闭症脑研究报道神经元尺寸总体减少和神经元存储密度增加，尤其是在海马、脑下脚以及杏仁核中(Kemper and Bauman, 1993)。
自闭症谱系障碍与特定的脑异常相关。神经学观察和神经影像研究提供证据证明在自闭症中可累及许多脑区，包括小脑、大脑皮质、杏仁核、海马、基底神经节以及脑干(Akshoomoff et al., 2002 ；Acosta and Pearl (2004)Semin Pediatr Neurol11,205-213)。小脑异常也常见于ASD患者中，其标志为浦肯野细胞(Purkinje cell)和粒细胞的缺少(Courchesne et al., 2001)。
自身免疫和自身抗体参与自闭症谱系障碍的发病机制(Ashwood et al.(2006) JLeukocyte Biol80, 1-11 ；ffills et al.(2007)AnnN.Y.Acad Sci 1107,79-91 ；Zimmermanet al.(2007) Brain Behav Immun21, 351-357)。自身抗体与神经兀结合可破坏关键时期神经发育的正常模式。据报道，在自闭症儿童中有脑反应性自身抗体，并且有数种自身免疫因素，包括脑特异性自身抗体，淋巴功能受损、细胞因子调节异常以及病毒联合(viralassociation)与其有关(Singh and Rivas (2004) Neurosci Lett355, 53-56)。例如，Singh和Rivas (2004)揭示了自闭症儿童血清含有脑特异性自身抗体。在68名4_12岁的自闭症儿童的研究中，分别在49%、18%以及9%的自闭症儿童中检测到抗尾状核、大脑皮质以及小脑的抗体，但在正常儿童中检测不到。另一研究显示患有妥瑞氏综合征(tourettesyndrome)的儿童具有抗纹状体抗体，将这些抗体输注到大鼠纹状体中导致了与妥瑞氏综合征相似的神经元功能障碍(Hallet et al.(2000)J Neuroimmunol 111,195-202)。在自闭症患者中还发现其他抗脑抗体，包括针对5-羟色胺受体、髓磷脂碱性蛋白、轴突丝蛋白、小脑神经丝、神经生长因子、脑内皮蛋白的抗体以及针对其他未鉴定脑蛋白的抗体。在儿童链球菌感染后病例中显示了在抗神经元自身抗体和神经性疾病之间具有强关联性，例如，强迫症(OCD)、西德纳姆舞蹈病、妥瑞氏综合征、PANDAS、伴肿瘤效应(paraneoplasia),并且在系统性红斑狼疮老年患者中显示了认知和记忆的丧失(Swedo et al.(1989)Am J Psychiatryl54, 110-2 ；Kalume et al.(2004)J NeurosciRes77, 82-89 ；Tanaka et al.(2004)J Neurological Sci217, 25-30)。DeGeorgio 等人(DeGeorgio et al.(2001) Nature Med 11，1189-1193)和 Kowal 等人(Kowal et al.(2004)Immunity21, 179-188)报道了通过分子模拟，系统性红斑狼疮患者的一组抗DNA抗体与NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)亚型谷氨酸受体交叉反应，并且在体外和体内诱导神经元损伤和死亡。
发明内容
在一种实施方式中，本发明提供了一种检测受试者神经变性疾病诊断性自身抗体的方法，所述方法包括:从所述受试者获得生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体。在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于诊断受试者神经变性疾病的方法，所述方法包括:从所述受试者获得生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在神经变性疾病诊断性自身抗体；如果存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，则诊断为所述神经变性疾病。在一种实施方式中，本发明提供了一种鉴定处于发生神经变性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括:从所述受试者获得生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；如果存在所述一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，则将所述受试者鉴定为处于发生所述神经变性疾病风险。在另一种实施方式中，本发明提供了一种生成受试者特异性神经变性疾病诊断性自身抗体谱的方法，所述方法包括:从受试者获得生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，并生成存在于所述样品中的受试者特异性神经变性疾病诊断性自身抗体谱。本发明的另一种实施方式提供了一种基材，所述基材上固定有对于一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体具有特异性的一种或多种自身抗原。本发明的另一种实施方式提供了一种微阵列，所述微阵列包含基材，所述基材上固定有对于一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体具有特异性的一种或多种自身抗原。本发明的另一种实施方式提供了一种用于检测神经变性疾病诊断性自身抗体的试剂盒。
图1是实施例8中例示的诊断逻辑的图示。
具体实施例方式根据本发明，发现在人血清中存在丰富和普遍的自身抗体，也称为自身反应性抗体，与年龄或是否存在疾病无关。某些自身抗体为脑反应性，其他的自身抗体对于全身其他器官中的靶具有反应性。尽管某些自身抗体可为过往疾病和免疫活性的残余物，但根据本发明发现，由于现有或发展中的疾病，血液和脑脊液(CSF)中还存在许多自身抗体。该后一组可用于现有疾病的早期检测和诊断。
本发明发现因活动性神经变性疾病的存在，包括长期和短期疾病，导致由于与进行中的病变相关的细胞损伤而产生和释放出细胞产物，其中某些具有细胞类型和器官特异性。这些释放的细胞产物(其中许多为蛋白质)，其裂解片段以及疾病相关翻译后修饰物进入血液和淋巴循环,充当抗原，引发免疫应答。该免疫应答导致血液中产生和出现较大量的自身反应性自身抗体。遍布机体的细胞共有大量蛋白质，但仅一组较小量的自身抗体对涉及特定疾病的细胞、组织以及器官具有特异性反应性。根据本发明发现该应答导致所涉及的各疾病和特定细胞类型所特有的疾病特异性自身抗体谱。另外，本发明发现，在患有并发症的个体中，特定的自身抗体谱反映了这些并发症中的每一种的疾病过程。
另外，本发明发现，能够结合脑特异性靶(包括神经元及其支持性胶质细胞)的自身抗体常见于血液中，实际上它们显示为遍在的。这些自身抗体与脑中的神经元和/或胶质细胞的结合对于这些细胞及其所参与的功能是有害的。这不仅破坏正常细胞功能，而且还最终导致神经元和胶质细胞死亡和从脑中永久性丧失。
一旦自身抗体位于脑组织中，则其自由选择性结合脑中于其表面具有并呈现合适靶抗原的任何细胞。如果细胞表面上的自身抗体靶特别丰富，许多自身抗体分子的结合可交联和固定该蛋白。如果所述靶是重要的受体，可使得靶和细胞不具功能性，导致更广泛的脑功能损害。当靶细胞为神经元时，自身抗体结合可导致神经元功能障碍，所述神经元障碍可最终表现为行为、认知、记忆以及活动损害。当所述靶为支持神经元的胶质细胞时，该支持的丧失可间接破坏神经元功能。由此，人血清中的特异性脑反应性自身抗体可将人置于特定神经变性疾病的风险中。本发明提供了一种用于检测人生物样品中这些自身抗体的方法。
由此，在一种实施方式中，本发明提供了一种鉴定处于发生神经变性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括:从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；如果存在一种或多种所述神经变性疾病诊断性自身抗体则将所述受试者鉴定为处于发生所述神经变性疾病风险中。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种检测受试者的神经变性疾病诊断性自身抗体的方法，所述方法包括:从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品，并进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体。
在优选的实施方式中，所述神经变性疾病选自:阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、链球菌感染相关性儿童自身免疫神经精神障碍(“PANDAS”)、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎(Rasmussen encephalitis)、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合征、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人。在本发明的优选实施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物样品为血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液样品可通过本领域已知方法获得，包括静脉穿刺或指穿刺。CSF可通过本领域已知的方法获得，包括腰椎穿刺。为了由血液获得血清，接收血液样品，在足以沉淀所有细胞和血小板的速度下离心，由所产生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液样品可通过本领域已知的方法收集。可使用合适的缓冲液稀释生物样品。在本发明的优选实施方式中，通过如下方法进行用于检测所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体的测定:在允许形成自身抗原与自身抗体的免疫复合物的条件下，使所述生物样品与神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原接触，并检测所述免疫复合物的存在。 可通过将存在于来自患有神经变性疾病的受试者的含有免疫球蛋白的样品中的自身抗体与存在于来自年龄匹配的无病对照受试者的含有免疫球蛋白的样品中的自身抗体进行比较来鉴定神经变性疾病诊断性自身抗体特异性的自身抗体。存在于来自患有所述疾病的受试者的样品中而不存在于来自对照受试者的样品中的自身抗体的靶自身抗原提供了所述疾病诊断性自身抗体的鉴定。所述样品优选为血清。例如，点在单样品载玻片上的含有数千个完整或近完整人蛋白的蛋白微阵列可用于鉴定患者样品中与微阵列中抗原靶具有反应性的自身抗体。对照样品中的自身抗体可通过相似的方式鉴定。可将患者自身抗体谱与对照自身抗体谱进行比较以检测所述疾病特异性自身抗体和相应的自身抗原。可用于鉴定神经变性疾病诊断性自身抗体和自身抗原的蛋白微阵列可通过本领域已知方法制备，还可商购获得。可商购获得的蛋白微阵列包括，例如，Invitrogen的ProtoArray 人蛋白微阵列v5.0,该微阵列优选根据Invitrogen ProtoArray 方案和免疫应答生物标志物谱(Immune Response Biomarker Profiling)应用来使用。用于探测和扫描此类蛋白微阵列和用于检测所得数据的诊断性意义的方法为本领域技术人员已知，并公开在例如，Tibshirani et al.(2002)Proc Natl Acad SciUSA99, 6567-6572。一旦通过前述方法鉴定了神经变性疾病诊断性自身抗体，则鉴定和筛选相应的自身抗原以用于检测和诊断方法。自身抗原可包括蛋白抗原、多肽或其肽片段，所述蛋白抗原、多肽或其肽片段含有由所述疾病诊断性自身抗体识别的一种或多种表位，或由所述疾病诊断性自身抗体识别的表位拟肽(peptidomimetic)。自身抗原可由天然来源纯化而来,或通过本领域已知的方法重组或合成性制备，可为融合蛋白形式。可使用无细胞翻译系统体外制备自身抗原。在优选的实施方式中，在哺乳动物或昆虫表达系统中制备自身抗原以确保正确的折叠和功能。所有这些方法可为自动化的以用于高通量制备。用于检测免疫复合物的测定和条件为本领域技术人员已知。这样的测定包括，例如，竞争性测定、直接反应测定以及夹层型测定。所述测定可为定量或定性的。在优选的实施方式中，测定利用与自身抗原直接或间接连接的固相或基材，例如微量滴定板或微量测定板、载玻片、磁珠、非磁珠、柱、基质、膜、试纸片、过滤器、膜、针或片，可由合成性材料(例如，聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺或其他合成性聚合物)、天然聚合物(例如纤维素)、衍生性天然聚合物(例如醋酸纤维素或硝酸纤维素)以及玻璃(例如玻璃纤维)构成。所述基材优选包括固定于表面上的可分别定位的多种自身抗原。可分别定位的自身抗原优选固定于表面上以形成阵列。所述基材可以以合适的形状使用，例如薄膜、片或板，或可包被、粘合或层压至合适的惰性载体上，例如纸、玻璃、塑料薄膜或织物。在优选的实施方式中，所述基材为载玻片或微珠。
将自身抗原连接到支持物或基材上的方法为本领域已知，包括共价和非共价相互作用。例如，所应用的蛋白扩散至例如水凝胶的多孔表面允许在水凝胶结构中未修饰蛋白的非共价结合。共价偶联方法提供了稳定的连接，可应用于许多蛋白。使用蛋白上的标签(例如，六组氨酸/N1-NTA或生物素/亲和素)和固定于基材表面上的配偶体(partner)试剂的生物捕获方法提供了稳定的连接，以可再现取向(reproducible orientation)特异性结合蛋白。在优选的实施方式中，将自身抗原涂覆或点至支持物或基材(例如化学衍生玻璃)上。在更优选的实施方式中，使用硝酸纤维素包被的载玻片。
在一种优选的实施方式中，以阵列、优选微阵列的形式提供自身抗原。蛋白微阵列为本领域已知，并且综述在例如Hall et al.(2007)Mech Ageing Devl28:161-167和Stoevesandt et al (2009)Expert Rev Proteomics6:145-157 中，该文献公开的整体内容通过引用并入本文。可通过使用接触点样器或非接触微阵列仪将纯化的自身抗原固定于基材(如处理过的显微镜载玻片)上来制备微阵列。还可通过由相应DNA阵列直接原位无细胞合成来制备微阵列。
外源制备和纯化待点样至阵列上的自身抗原的合适方法包括在细菌中表达(如Venkataram et al.(2008)Biochemistry47:6590-6601 所揭不的)、在酵母中表达(如 Liet al.(2007)ApplBiochem Biotechnol.142:105-124 所揭不的)、在昆虫细胞中表达(如Altman et al.(1999)Glyco conj J 16:109-123所揭示的)以及在哺乳动物细胞中表达(如 Spampinato et al.(2007) Curr Drug Targets8:137-146 所揭不的)。
合适的原位(“芯片上”)蛋白制备方法公开在例如,Ramachandran et al.(2006)Methods Mol.Biol2328:l_14and He et al.(2008)Curr.0pin Biotechnol19:4-9
同时平行在阵列表面上表达和固定蛋白的其他方法也是本领域已知的，可用于本发明。例如，在蛋白原位阵列(PISA)方法(He et al.(2001)Nucleic Acids Res29:e73)中，直接由DNA制备溶液或固定形式的蛋白，当通过识别标签序列而制备时连接到阵列表面。利用无细胞系统(通常为兔网织红细胞或大肠杆菌S30)体外平行表达蛋白，以进行偶联的转录和翻译。在该方法中，在其上预包被有能够结合标签的固定剂的表面上进行蛋白表达。由此，在各蛋白翻译后，其同时特异性固定于邻近的表面上，而其他物质可随后被洗除。可通过将DNA与无细胞裂解物系统混合之后点样，或通过首先点样随后与表达系统混合的多次点样技术(MIST)直接将微阵列制备至载玻片上。
在已知为核酸程序化蛋白阵列(NAPPA) (Ramachandran et al.(2004)Science305:86-90)的系统中，由固定(与溶液相对)的DNA模板进行转录和翻译允许将DNA阵列转化为蛋白阵列。在该方法中，将编码作为GST融合物的蛋白的生物素化cDNA质粒与用作捕获实体的抗GST抗体一起印至亲和素包被的载玻片上。然后使用兔网织红细胞裂解物覆盖cDNA阵列以表达蛋白，所述蛋白由邻近各DNA点的抗体捕获，由此所述蛋白以与cDNA相同的布局固定。该技术产生了其中固定的蛋白与DNA和捕获剂一起存在的蛋白阵列。另一种产生蛋白阵列的合适方法是DNA阵列至蛋白阵列(DAPA)方法。该原位蛋白阵列的方法使用固定的DNA阵列作为模板以在分离的表面上由DNA产生“纯”蛋白阵列，还可由相同DNA模板产生多拷贝蛋白阵列(He et al.(2008)Nature Methods, 5:175-7)。在置于两个表面(例如载玻片)之间的膜中进行无细胞蛋白合成，其中一个表面布有DNA分子阵列，而另一个表面带有特定试剂以捕获所翻译的蛋白。由所布阵列的DNA平行合成各标记的蛋白，所述蛋白经间隙扩散，之后通过其与位于相对面的标签捕获试剂相互作用而固定，以形成蛋白阵列。产生了在位置和量上准确反映DNA的离散点。可通过再利用DNA获得蛋白阵列的复制拷贝。阵列构建方法包括机器人接触印刷、喷墨、压电点样以及照相平板印刷。例如，可使用柔性蛋白微阵列喷墨印刷系统(例如，ArrayJet, Roslin, Scotland, UK)将外源制备和纯化的本发明的纯化自身抗原点样至微阵列基材上，以提供高质量蛋白微阵列生产。可将精确的自身抗原的行和列转化为标示出已结合诊断性自身抗体的存在和量的可检测点。优选使用经设计以维持自身抗原三维形状的可商购印刷缓冲液进行微阵列的制备。在一种优选实施方式中，用于微阵列的基材是硝酸纤维素包被的载玻片。可通过本领域已知的方法进行测定，在所述方法中在允许形成自身抗原与抗体的免疫复合物的条件下，使一种或多种自身抗原与生物样品接触，并检测所述免疫复合物。可通过本领域已知的方法检测免疫复合物的存在和量，所述方法包括基于标签和无标签的检测。例如，基于标签的检测方法包括添加第二抗体，所述第二抗体与包含产生信号的化合物的指示剂偶联。所述第二抗体可为抗人IgG抗体。所述指示剂包括生色剂、诸如酶偶联物的催化剂、诸如荧光素和若丹明的荧光化合物、诸如二氧杂环丁烷、吖啶类、菲啶类(phenanthridiniums)、钌以及鲁米诺(Iuminol)的化学发光化合物、放射性元素、直接可视标签以及辅因子、抑制剂和磁性颗粒。所述酶偶联物的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶以及半乳糖苷酶。无标签检测方法包括表面等离振子共振、碳纳米管以及纳米线以及干扰量度法。基于标签和无标签检测方法为本领域已知，并公开于例如Hall etal.(2007)and by Ray et al.(2010)ProteomicslO:731-748。可通过本领域已知且适于所使用标签的扫描方法，以及相关的分析软件来实现检测。在本发明的一种优选实施方式中，使用突光标记和检测方法来检测免疫复合物。可使用可商购的载玻片扫描仪(例如，Genepix4000B载玻片扫描仪(MolecularDevices, Inc.))和相关的分析软件。在一种优选实施方式中，使用突光标记(例如，Alexa-Fluor (Invitrogen))的抗人抗体探测免疫复合物,使用微阵列扫描仪检测各蛋白点的突光强度。可使用可商购的软件(例如，GenePix Pro5.0软件(Axon instruments))从扫描仪产生的数字图像提取各特征的净中值像素强度。可通过比较相同阵列的不同区域中的多个相同对照点的中值来对数据进行标准化。检测到免疫复合物是生物样品中存在神经变性疾病诊断性自身抗体的标志，由此表明是神经变性疾病的阳性诊断。本发明的另一种实施方式提供了一种诊断受试者神经变性疾病的方法，所述方法包括:由所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，和如果存在一种或多种所述神经变性疾病诊断性自身抗体，则诊断为患有所述疾病。
在优选的实施方式中，所述神经变性疾病选自:阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、PANDAS、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合症、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。
在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人。
在本发明的优选实施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物样品为血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液样品可通过本领域已知方法获得，包括静脉穿刺或指穿刺。CSF可通过本领域已知的方法获得，包括腰椎穿刺。为了由血液获得血清，接收血液样品，在足以沉淀所有细胞和血小板的速度下离心，由所产生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液样品可通过本领域已知的方法收集。可使用合适的缓冲液稀释生物样品。
在优选的实施方式中，通过如下所述进行用于诊断受试者神经变性疾病的测定:在允许形成自身抗原与自身抗体的免疫复合物的条件下，使所述样品与神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原接触，并检测所述免疫复合物的存在(上文有详细描述)。可以以阵列或优选微阵列的形式提供自身抗原。
本发明另一种实施方式包括一种生成受试者特异性的神经变性疾病特异性自身抗体谱的方法，所述方法包括:由所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品，进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体，和生成存在于样品中的所述神经变性疾病诊断性自身抗体的受试者特异性神经变性疾病特异性自身抗体-1'TfeP曰。
在更优选的实施方式中，所述神经变性疾病选自:阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、PANDAS、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合症、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。
在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人。
在本发明的优选实施方式中，所述含有免疫球蛋白的生物样品为血清、全血、CSF、唾液或痰液。血液样品可通过本领域已知方法获得，包括静脉穿刺或指穿刺。CSF可通过本领域已知的方法获得，包括腰椎穿刺。为了由血液获得血清，接收血液样品，在足以沉淀所有细胞和血小板的速度下离心，由所产生的上清抽取待分析的血清。痰液和唾液样品可通过本领域已知的方法收集。可使用合适的缓冲液稀释生物样品。
在优选的实施方式中，通过如下所述进行用于诊断受试者神经变性疾病的测定:在允许形成自身抗原与自身抗体的免疫复合物的条件下使所述样品与神经变性疾病特异性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原接触，和检测所述免疫复合物的存在(上文有详细描述)。可以以阵列或优选微阵列的形式提供自身抗原。本发明的另一种实施方式提供了一种基材，所述基材上固定有神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原。在另一种实施方式中，本发明还提供了一种微阵列，所述微阵列包含基材，所述基材上固定有神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原。所述基材和微阵列可如上文所述制备，可用于制备神经变性疾病诊断性自身抗体谱和诊断神经变性疾病。自身抗原可包括蛋白抗原、多肽或其肽片段，所述蛋白抗原、多肽或其肽片段含有由所述疾病诊断性自身抗体识别的一种或多种表位，或由所述疾病诊断性自身抗体识别的表位拟肽。对于每种神经变性疾病，所述基材和微阵列含有至少一种特异性自身抗原，优选对每种神经变性疾病含有约两种至约三十种特异性自身抗原。所述基材和微阵列可含有多组(panels)自身抗原，其中各组含有对于特定神经变性疾病的诊断性自身抗原。这样的多基材和多阵列允许在相同测定中诊断多于一种的神经变性疾病，还允许区分神经变性疾病。在优选的实施方式中，所述神经变性疾病选自:阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、PANDAS、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合症、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于检测样品中神经变性疾病特异性自身抗体的试剂盒。所述试剂盒包含神经变性疾病特异性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原和用于检测所述自身抗原与所述样品中自身抗体结合的工具。所述试剂盒还包含包装材料(packaging material),所述包装材料包括指示所述试剂盒的所述一种或多种自身抗原可用于鉴定神经变性疾病的标签。所述试剂盒中可包含本领域技术人员已知可包含在此类试剂盒中其他组分，诸如缓冲液、对照、检测试剂等。所述试剂盒可用于检测神经变性疾病特异性自身抗体和诊断神经变性疾病。阿尔茨海默病本文中阿尔茨海默病(AD)诊断性自身抗体被定义为特异性结合蛋白或肽抗原和作为可用于区分阿尔茨海默病与没有患有阿尔茨海默病的对照受试者的诊断指示剂的抗体。已经鉴定为可潜在用于诊断性指示剂的蛋白抗原列于下表I中。表I中的蛋白抗原通过本领域接受的名称及数据库识别号而确定。数据库识别号是指可公开获得的美国国家生物技术信息中心(NCBI)蛋白数据库，该数据库为本领域公知并为本领域普通技术人员可获得。表I
权利要求
1.用于检测受试者的神经变性疾病诊断性自身抗体的方法，所述方法包括: (a)从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品；和 (b)进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体。
2.用于诊断受试者的神经变性疾病的方法，所述方法包括: (a)从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品； (b)进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；以及 (C)如果存在一种或多种所述神经变性疾病诊断性自身抗体，则诊断为所述神经变性疾病。
3.用于鉴定处于发生神经变性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括: (a)从所述受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品； (b)进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；以及 (C)如果存在一种或多种所述神经变性疾病诊断性自身抗体，则将所述受试者鉴定为处于发生所述神经变性疾病风险。
4.用于生成受试者特异性神经变性疾病特异性自身抗体谱的方法，所述方法包括: (a)从受试者获得含有免疫球蛋白的生物样品； (b)进行测定以确定所述生物样品中是否存在一种或多种神经变性疾病诊断性自身抗体；以及 (C)生成存在于所述样品中的疾病诊断性自身抗体的受试者特异性神经变性疾病特异性自身抗体谱。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述神经变性疾病选自:阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合征、慢性周围神经病、视神经炎、血管性痴呆、强迫症、西德纳姆舞蹈病、PANDAS、桥本氏脑病、精神分裂症、系统性红斑狼疮、血管性认知病、中风、亨廷顿病、视神经脊髓炎、副癌综合征、边缘性脑炎、罗斯默森氏脑炎、桥本氏脑炎、昏睡性脑炎、僵人综合症、链球菌感染后运动障碍、风湿热、麸质性肠病、ASD、孤独症、诵读困难、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征以及先天性多发性关节挛缩。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述受试者是人。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述生物样品选自全血、血清、脑脊液、唾液和痰液。
8.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中通过如下进行所述测定:在允许形成自身抗原与自身抗体免疫复合物的条件下，使所述样品与神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原接触，并检测是否存在所述免疫复合物，其中存在所述免疫复合物则表明存在神经变性疾病特异性自身抗体，其中不存在所述免疫复合物则表明不存在神经变性疾病特异性自身抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中使所述一种或多种自身抗原连接到基材。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种自身抗原为阵列形式。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述阵列为微阵列。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述基材为硝酸纤维素包被的载玻片。
13.—种基材，所述基材上固定有神经变性疾病诊断性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原。
14.根据权利要求13所述的基材，其上固定有可分别定位的多种自身抗原，所述自身抗原对神经变性疾病针对性自身抗体具有特异性。
15.根据权利要求13所述的基材，其包含多组自身抗原，其中每一组含有用于一种神经变性疾病的诊断性自身抗原。
16.根据权利要求13所述的基材，其中所述基材为载玻片或微珠。
17.—种微阵列，所述微阵列包含基材，所述基材上固定有神经变性疾病特异性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原。
18.根据权利要求17所述的微阵列，其包含多组自身抗原，其中每一组含有用于一种神经变性疾病的诊断 性自身抗原。
19.一种试剂盒，其包含神经变性疾病特异性自身抗体的一种或多种特异性自身抗原和用于检测所述自身抗原与含免疫球蛋白的生物样品中的自身抗体结合的工具。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述一种或多种自身抗原固定于基材上。
全文摘要
本发明提供了用于检测神经变性疾病特异性自身抗体，用于诊断神经变性疾病和处于发生神经变性疾病风险，以及用于生成患者特异性神经变性疾病的诊断性自身抗体谱的方法、组合物以及试剂盒。
文档编号G01N33/567GK103154736SQ201180034612
公开日2013年6月12日 申请日期2011年4月1日 优先权日2010年5月13日
发明者罗伯特·G·纳格勒 申请人:新泽西医科和牙科大学