专利名称：通过软骨酸性蛋白1 检测脑梗塞的方法
技术领域：
本发明涉及脑梗塞的检查方法、脑梗塞治疗或预防效果的评估方法、筛选脑梗塞的预防药物或治疗药物的方法，和用于检测脑梗塞、用于评估脑梗塞的治疗效果或用于筛选脑梗塞预防/治疗药物候选化合物的试剂盒。
背景技术：
脑中风是脑梗塞、脑出血、蛛网膜下腔出血等脑血管障碍的总称。在这些脑中风的疾病类型中，近年来脑梗塞是相对增加的。急性脑梗塞的药物疗法可使用溶栓法、抗凝固疗法、抗血小板疗法、施用护脑药物等，对于重症患者或发生出血性脑梗塞的患者可以实施外科手术。脑梗塞的症状在急性期最强，之后慢慢改善。这是由于陷入坏死的脑组织肿胀，压迫、阻碍周围的脑组织而造成的。在引起肿胀的同时，周围组织的功能也逐步恢复，症状逐步固化。但是，由于自脑缺血部位释放的自由基也具有引起周围组织坏死的作用，因此即使已过急性期，为了提高功能预后，仍然需要继续治疗。脑梗塞的临床疾病类型包括由脑内微动脉堵塞而发病的腔隙梗塞、由脑内主动脉粥样硬化堵塞而发病的动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、由心脏内的血栓成为栓子，堵塞脑内动脉而发病的心源性脑栓塞等。由于根据这些临床疾病类型，在急性期和慢性期的合适疗法不同，因此需要快速诊断脑梗塞患者的临床疾病类型的方法。脑梗塞的临床疾病类型的分类方法已公开了通过观察临床症状和实施心脏超声波检查、MR1、MRA、颈部血管超声波检查等，以TOAST分类为基准的脑梗塞临床诊断流程(非专利文献I)等进行分类的方法；使用了分子标志物的方法等，具体而言，在脑梗塞发病的24小时内同时测定了 CRP、D-Dimer、RAGE、MMP-9、SIOOB、BNP等分子标志物的结果，利用BNP和D-Dimer设定特定的截止值，可以将心源性脑栓塞与其他疾病类型分类(非专利文献2)，但仍然需要可以更迅速的诊断确切疾病类型的分子标志物。可以在发病3个月后至I年后的时间，通过改良的Rankin量表(非专利文献3)或巴塞尔指数(Barthel Index)(非专利文献4)，评价日常生活中的动作障碍程度，来判断脑梗塞的预后。事先预测预后对于早期确定脑梗塞的治疗方法是重要的。已公开了通过入院时测定的血浆中的BNP确定特定的截止值，从而可以预测死亡(非专利文献5)，但仍需要可以预测存活时障碍程度的分子标志物。脑梗塞症状的严重程度(重症度)可以在脑梗塞刚发病后至发病后3个月后的过程中，通过美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)评价意识障碍、运动障碍或高度功能障碍等来判断。很多脑梗塞在入院期内症状恶化，通过观察NIHSS的变化，可以确定是否是进行性脑梗塞。由于进行性脑梗塞多发生预后不良，因此早期预测并充分治疗是重要的。然而，尚未建立对进行性脑梗塞进行预测的方法，还需要进行预测的分子标志物。在专利文献I中，记载了使用软骨酸性蛋白I (Cartilage Acidic Proteinl)作为循环器官疾病、血液疾病、神经疾病、呼吸器官疾病、消化器官疾病和泌尿器官疾病的标志物。然而，仅在缺血/心肌梗塞的模式动物中软骨酸性蛋白I表现出表达量高，而没有显示软骨酸性蛋白I可以用于诊断这些疾病的具体数据。现有技术文献专利文献专利文献I美国专利申请公开2010/0081136号说明书非专利文献非专利文献ILee, L.J.等人，Stroke, 1081-1089 (2000)非专利文献2Montaner 等人，Stroke, 2280-2287 (2008)非专利文献3van Swieten, J.C 等人，Stroke, 604-607 (1988)非专利文献4Mahoney, F.L 等人，Maryland State Med J, 61-65 (1965)非专利文献5Shibazaki，K 等人，Inter Med, 1601-1604(2009)非专利文献6Brott T.等人，Stroke, 20，864 (1989)
发明内容
鉴于上述问题，本发明的课题是提供使用脑梗塞患者等的血清或血浆等，迅速准确的检查脑梗塞的方法，以及评价脑梗塞治疗效果的方法。本发明人等为了解决上述课题，深入研究，结果发现:患者血浆中的软骨酸性蛋白I蛋白质在健康者、疾病类型不同或预后不同的患者之间的血浆中的浓度不同，软骨酸性蛋白I蛋白质的含量可作为用于检查脑梗塞的有效指标，从而完成了本发明。换言之，本发明的主旨是:[I]用于在动物中诊断脑梗塞的检查方法，其包括:对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤，当所述蛋白质的量低于健康者时，判断为脑梗塞。[2]根据[I]所述的用于诊断脑梗塞的检查方法，其中，从待检动物中采集的血液样品是在从脑梗塞样症状刚发病后至发病后第20天之间的任意时间从待检动物中采集的血液样品。[3]用于在动物中诊断脑梗塞的疾病类型的检查方法，其包括:对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。[4]根据[3]所述的检查方法，所述疾病类型诊断是诊断下列中的任意:腔隙梗塞、动脉粥样硬化性血栓性、心源性脑栓塞、主动脉源性脑栓塞、分支动脉粥样化病、动脉夹层(動脈解離)、不能分类。[5]用于在动物中预测脑梗塞的预后的检查方法，其包括:对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。[6]根据[5]所述的用于预测脑梗塞的预后的检查方法，其中，从待检动物中采集的血液样品是在脑梗塞发病第7天从待检动物中采集的血液样品。[7]用于在动物中预测脑梗塞的进行性的检查方法，其包括:对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。[8]根据[7]所述的用于预测脑梗塞的进行性的检查方法，其中，从待检动物中采集的血液样品是在脑梗塞发病第7天从待检动物中采集的血液样品。[9]评价动物中的脑梗塞的预防或治疗效果的方法，其包括:对从动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤，所述动物是施用了脑梗塞的预防药物或治疗药物的需要预防或治疗脑梗塞的动物。[10]筛选脑梗塞的预防药物或治疗药物的方法，其包括:在使待检个体与脑梗塞的预防药物或治疗药物的候选化合物进行接触之后，对所述待检个体中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。[11]用于检查脑梗塞、用于评价脑梗塞的治疗效果，或用于筛选脑梗塞的预防/治疗药物的候选化合物的试剂盒，其包括:能够对软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的试剂。本发明提供了脑梗塞患者的血浆中的浓度，与健康者不同、或在疾病类型不同的患者、预后不同的患者或进行性不同的患者的血浆中其浓度不同的软骨酸性蛋白I蛋白质作为用于检查脑梗塞的分子标志物(在本说明书中称为“CRTAC1蛋白标志物”)。通过单独使用CRTACl蛋白标志物，或与其他脑梗塞分子标志物组合使用，可以迅速、准确的诊断脑梗塞，或进行脑梗塞的疾病类型的分类或进行预后预测。
具体实施例方式下面详细的说明本发明的实施方式。(I)脑梗寒的检杳方法本发明的第I个方面是在动物中检查脑梗塞的方法，包括对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。在本说明书中，“脑梗塞”指脑动脉由于血栓或栓塞而成为堵塞的缺血状态，使脑组织坏死和障碍的疾病，包括下述的任意疾病:脑内微动脉堵塞而发病的腔隙梗塞；脑内主动脉粥样硬化堵塞而发病的动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞；由于心脏内的血栓成为栓子堵塞脑内动脉而发病的心源性脑栓塞；栓子从自上行性主动脉至主动脉弓部的粥样硬化斑块解离、堵塞脑内动脉而发病的栓塞症，即主动脉源性脑栓塞；在主动脉上形成的斑块堵塞穿支的入口部位而产生的穿支区域的梗塞，即“分支动脉粥样化病(Branch atheromatousdisease) ” (下文有时称为“BAD”)；脑血管内膜损伤、血液侵入动脉壁内使脑血管堵塞的动脉夹层。此外，脑梗塞也包括急性期、亚急性期、恢复期(慢性期)等中的任意。在本说明书中，软骨酸性蛋白I蛋白质(下文有时称为“CRTAC1蛋白”)意指在本发明的检查方法中，作为测定其在血液样品中的含量的对象的软骨酸性蛋白I蛋白质，只要是源自待检动物的蛋白质即可，具体而言，对于源自人的蛋白质可示例如下述特定氨基酸序列所示的蛋白质。进一步还包括与其具有相同功能的蛋白质片段、衍生物和变体。在上述检查方法中，“待检动物”只要是具有发生脑梗塞的可能性的动物即可，具体而言可列举人、猴子或大鼠等啮齿类等。其中，本发明的脑梗塞的检查方法特别优选在怀疑脑梗塞的人、或脑梗塞发病后的人等中进行。此外，从上述待检动物中采集的“血液样品”只要含有CRTACl蛋白、并可以测定其浓度即可，没有特殊的限制，具体而言可以是EDTA血浆、柠檬酸血浆等血浆、血清、全血中的任意，其中，由于EDTA血浆可以方便的采集，易于保藏且采集量多，因此优选使用EDTA血浆。用于从待检动物中采集所述血液样品的采血时机可以是进行脑梗塞诊断的任意时机。脑梗塞由于在发病后时刻发生症状或疾病状态的变化，因此具体如下详述。在本发明的检查方法中，在人的情况下，作为测定其在从待检动物中采集的血液样品中的含量的对象的软骨酸性蛋白I蛋白质是如UniProtKB的登录名CRAC1_HUMAN所示氨基酸序列组成的蛋白质。例如，可以在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库等输入上述登录名，获得序列信息。上述氨基酸序列是人的序列，在待检动物不同的情况下，以源自所述动物的同源物蛋白质作为测量对象蛋白质。上述蛋白质在血液样品中的含量的测量方法只要是可以测量所述蛋白质的含量的方法即可，没有特殊的限制，可使用例如:使用了所述蛋白质的抗体的现有免疫测量法；色谱技术和飞行时间质谱分析(TOF-MS)的组合；一并测定在一定条件下色谱载体(例:阳离子交换载体、阴离子交换载体、疏水性色谱载体、金属离子等)所捕获的所有成分的质量的方法；二维凝胶电泳法等。免疫测量法优选通过根据酶免疫定量法的定量检查方法；荧光免疫测定法；化学发光免疫测定法等进行测量的方法等。酶免疫定量法是在标记免疫测定法中，使用酶作为标记物的检查方法。此外，使用免疫溶剂，选用酶联免疫吸附测定(ELISA)法是特别优选的。此外，可列举ELISA中的夹心法，考虑其操作简单、经济便利，尤其是普遍适用于临床检查，是特别合适的测量形式之一。这些测量方法可以根据例如新生物化学实验讲座(新生化学実験講座)(日本生化学会编；东京化学同人)、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (T.Maniatis 等人，Cold Spring HarborLaboratory (2001))、Antibodies-A Laboratory Manual (E.Harlow,等人，ColdSpringHarbor Laboratory(1988))等一般实验书中记载的方法或基于上述方法进行。可以通过公知的方法，以对象的CRTACl蛋白作为抗原，获得进行上述测定时所使用的抗体等(包括抗体片段)。但是，以对象的CRTACl蛋白作为抗原来制备不是必需的，只要是至少与所述蛋白质表现出交叉反应性，能够测量其含量即可。这样的免疫测量法及其使用的抗体优选使用例如R&D公司生产的抗人CRTACl抗体(货号AF5234)等。本发明的方法中使用的血液样品优选将刚从待检动物中采集的血液样品用于上述测量，也可以使用保藏的血液样品。血液样品的保藏方法只要是用于检查脑梗塞的分子标志物量不变的条件即可，没有特殊的限制，例如优选是在o-1o°c下不冷冻水平的低温条件、黑暗条件和不振动的条件。在不得不冷冻的情况下，优选深度冷冻等能够避免标志物分子分解或氧化反应等的方法。在本发明的检查方法中，可以测量从待检动物中采集的血液样品(在本说明书中，有时将其称为“检查材料”)中的上述CRTACl蛋白标志物的含量，并以此为指标来检查脑梗塞。此外，可以使用组合CRP或D-Dimer等现有脑梗塞标志物在检查材料中的含量，或关联临床症状观察结果和心脏超声波检查、MR1、MRA、颈部血管超声波检查等结果的复合指标来更准确的检查。在上述以用于检查脑梗塞的分子标志物在检查材料中的含量为指标检查上述脑梗塞的情况下，可以是比较用于检查脑梗塞的分子标志物在检查材料中的含量的绝对值与健康者(健康动物)的值，也可以是规定恰当阈值进行检查的方法。从预先临床上确定没有脑梗塞的健康者中采集血液，与从待检动物中采集的血液进行相同的处理和测量，可定量健康者的上述用于检查脑梗塞的标志物在血液样品中的含量。临床上确定各种脑梗塞的方法没有特殊的限制，可列举例如通过头部X射线CT、头部MR1、MRA、脑血管造影、颈部血管超声波检查等机器诊断方法等来进行确定的方法等。阈值是指着眼于某种物质，在对目标疾病群体和非疾病群体(除目标疾病以外的群体)进行判定的情况下确定的值。在对目标疾病和非疾病进行判断的情况下，可以将阈值以下视为阴性，阈值以上视为阳性；或将阈值以下视为阳性，阈值以上视为阴性，来判断疾病(金井正光编，临床检查法提要金原出版株式会社)。以评价阈值的临床有效性为目的而使用的指标可列举灵敏度和特异性。使用阈值判断某亲代群体，在疾病患者中，判断为阳性的用a(真阳性)表示；属于疾病患者，但判断为阴性的用b (假阴性)表示；不是疾病患者，但判断为阳性的用c (假阳性)表示；不是疾病患者，且判断为阴性的用d(真阴性)表示；可以用a/(a+b)所示的值表示灵敏度(真阳性率)；用d/(c+d)所示的值表示特异性(真阴性率)。目标疾病群体和非疾病群体的测量值分布通常是部分重复的。因此，通过增减阈值，可以改变灵敏度和特异性。降低阈值可以提高灵敏度、减少特异性；增加阈值可以减少灵敏度、提高特异性。就判断方法而言，灵敏度和特异性两者的值越高，越优选。此外，灵敏度和特异性的值不大于0.5的判断方法不认为是有效的。设定阈值的方法可列举包括非疾病群体分布的95%，并设定中央距两端中的任一端点的值为阈值的方法；在非疾病群体的分布显示正态分布的情况下，设定平均值+2倍标准差(SD)或平均值-2SD为阈值的方法等。此外，由于如上所述，灵敏度和特异性随设定的阈值而改变，一般为了判断诊断方法是否有效，与单纯以某一阈值下的灵敏度和特异性进行评价相比，期望当增减阈值时保持灵敏度或特异性高的指标，例如用ROC曲线的AUC值进行评价。当灵敏度和特异性都以100%阈值存在时，ROC曲线的AUC值为1，诊断性能不好时接近0.5。因此，用ROC曲线的AUC值判断时，某诊断方法的性能如果在0.7以上，则可以评价所述方法作为诊断方法是恰当的。由于对于记载在本发明中的CRTACl蛋白标志物，ROC曲线的AUC值在0.7以上，因此可用于后述脑梗塞检查方法中。(1-1)使用了软骨酸性蛋白I(CRTACl)蛋白质标志物的检查脑梗塞的方法使用了本发明的CRTACl蛋白标志物检查脑梗塞的方法的具体方法可列举用于区别健康者和脑梗塞患者的检查方法，即可列举特征是测量从待检动物采集的血液样品中的CRTACl蛋白的量，当CRTACl蛋白的量低于健康者时判断为脑梗塞的检查方法。在此情况下，获得检查材料的时机是从脑梗塞样症状刚发病后起即可，没有特殊的限制，优选意指刚发病后至发病后第20天之间进行诊断。特别优选的时机是刚发病后 发病后第9天之间。可以是测定采集的检查材料中的上述CRTACl蛋白标志物的含量，比较它的绝对值与健康者(健康动物)的值，也可以是通过上述方法规定恰当阈值进行检查的方法。从被怀疑为脑梗塞的待检者采集的血液样品中的CRTACl蛋白标志物的含量的绝对值高于健康者(健康动物)的值时，越高于阈值，则越可以判断所述待检者是脑梗塞患者。健康者的上述用于检查脑梗塞的标志物在血液样品中的含量可以如下定量获得:从预先临床上确定没有脑梗塞的健康者采集血液，与从待检动物采集的血液进行相同的处理和测量。临床上确定各种脑梗塞的方法没有特殊的限制，可列举根据例如头部X射线CT、头部MR1、MRA、脑血管造影、颈部血管超声波检查等机器诊断方法等确定的方法等。此外，可以使用组合CRP或D-Dimer等现有脑梗塞标志物在检查材料中的含量，或关联临床症状观察结果和心脏超声波检查、MR1、MRA、颈部血管超声波检查等结果的复合指标来更准确的检查。(1-2)使用了 CRTACl蛋白标志物的检查脑梗塞疾病类型的方法使用了本发明的CRTACl蛋白标志物检查脑梗塞的方法的具体方法可列举用于区别脑梗塞疾病类型的检查方法。疾病类型是指本身已知在临床上有区别的疾病类型，具体而言，可列举“腔隙梗塞”(本说明书中有时称为“lacunar”)；“动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞”(本说明书中有时称为“动脉粥样硬化性血栓性”)；“心源性脑栓塞”(本说明书中有时称为“心源性脑栓塞”)；栓子从自上行性主动脉至主动脉弓部的粥状硬化斑块解离、堵塞脑内动脉而发病的栓塞症，即“主动脉源性脑栓塞”;在主动脉上形成的斑块堵塞穿支的入口部位而产生的穿支区域的梗塞，即“分支动脉粥样化病”(下文称为“BAD”)；脑血管内膜损伤、血液侵入动脉壁内使脑血管堵塞的动脉夹层；或不符合其中任一项的疾病类型(下文有时称为“不能分类型”)。为了通过测量包含在检查材料中的CRTACl蛋白质的量来区别脑梗塞的疾病类型，首先，通过上述方法确定能够区别各种疾病类型的血液样品中的CRTACl蛋白质的量的阈值，将检查材料中的CRTACl蛋白质的量与所述阈值比较，判断归入哪一种疾病类型群体。通过包含在本发明的血液样品中的CRTACl蛋白质的量能够区别的疾病类型只要是能够设定在两种疾病类型群体之间使CRTACl蛋白质的含量相互区别的阈值即可，没有特殊的限制，具体而言可列举例如表I所示的“动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞”和“动脉夹层”、“心源性脑栓塞”和“动脉夹层”、“腔隙梗塞”和“BAD”、“腔隙梗塞”和“动脉夹层”、“主动脉源性脑栓塞”和“BAD”、“主动脉源性脑栓塞”和“动脉夹层”、“BAD”和“动脉夹层”、“BAD”和“不能分类型”、“动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞”和“腔隙梗塞”、“心源性脑栓塞”和“腔隙梗塞”、“心源性脑栓塞”和“BAD”、“动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞”和“BAD”、“动脉夹层”和除此以外的疾病类型、“BAD”和除此以外的疾病类型等。当进行上述测量时，获得检查材料的时机是在脑梗塞样症状刚发病后即可，没有特殊的限制，表I中显示了优选的时机。
权利要求
1.用于在动物中诊断脑梗塞的检查方法，其包括: 对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤， 其中当所述蛋白质的量低于健康者时，判断为脑梗塞。
2.根据权利要求1所述的用于诊断脑梗塞的检查方法，其中，从待检动物中采集的血液样品是在从脑梗塞样症状刚发病后至发病后第20天之间的任意时间从待检动物中采集的血液样品。
3.用于在动物中诊断脑梗塞的疾病类型的检查方法，其包括: 对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。
4.根据权利要求3所述的检查方法，所述疾病类型诊断是诊断下列中的任意:腔隙梗塞、动脉粥样硬化性血栓性、心源性脑栓塞、主动脉源性脑栓塞、分支动脉粥样化病、动脉夹层、不能分类。
5.用于在动物中预测脑梗塞的预后的检查方法，其包括: 对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。
6.根据权利要求5所述的用于预测脑梗塞的预后的检查方法，其中，从待检动物中采集的血液样品是在脑梗塞发病第7天从待检动物中采集的血液样品。
7.用于在动物中预测脑梗塞的进行性的检查方法，其包括: 对从待检动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。
8.根据权利要求7所述的用于预测脑梗塞的进行性的检查方法，其中，从待检动物中采集的血液样品是在脑梗塞发病第7天从待检动物中采集的血液样品。
9.评价动物中的脑梗塞的预防或治疗效果的方法，其包括: 对从动物中采集的血液样品中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤，所述动物是施用了脑梗塞的预防药物或治疗药物的需要预防或治疗脑梗塞的动物。
10.筛选脑梗塞的预防药物或治疗药物的方法，其包括: 在使待检个体与脑梗塞的预防药物或治疗药物的候选化合物进行接触之后，对所述待检个体中的软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的步骤。
11.用于检查脑梗塞、用于评价脑梗塞的治疗效果，或用于筛选脑梗塞的预防或治疗药物的候选化合物的试剂盒，其包括: 能够对软骨酸性蛋白I蛋白质的量进行测定的试剂。
全文摘要
本发明涉及用于在动物中诊断脑梗塞的检查方法、用于诊断脑梗塞的疾病类型的检查方法，和用于预测脑梗塞预后的检查方法，其包括对从待检动物采集的血液样品中的软骨酸性蛋白1蛋白质的含量进行测定的步骤。
文档编号G01N33/50GK103210312SQ20118005511
公开日2013年7月17日 申请日期2011年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者北园孝成, 鸭打正浩, 吾乡哲朗, 桑城贵弘, 清原裕, 秦淳, 粟野秀人, 小林辉章 申请人:三菱化学株式会社, 国立大学法人九州大学, 公益社团法人久山生活习惯病研究所