专利名称：丝网印刷电极及多重修饰方法和检测玉米赤霉烯酮的方法
技术领域：
本发明涉及属于检测技术领域，具体涉及一种用自组装膜(Nafion膜、碳纳米管和胶体金)修饰的丝网印刷电极及其制备方法和检测玉米赤霉烯酮的方法。
背景技术：
玉米赤霉烯酮毒素aearalenone，ZEN)是镰刀菌属的一些菌株在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物。研究者在小麦、大麦、玉米、黑麦、高粱等谷物中检测到玉米赤霉烯酮，也在一些动物组织或产物中检测到，包括牛奶、鸡蛋等。玉米赤霉烯酮毒素可引发人和动物的多种疾病，主要为致癌促癌毒性，其与自发性乳腺癌等多种癌症，输卵管和子宫水肿、增生，精细胞畸变、凋亡等多种生殖系统疾病有重要关系。玉米赤霉烯酮毒素具有分布广泛、残留时间长、难处理、和其他毒素一起有增强毒性的现象。加入WTO之后， 农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的玉米赤霉烯酮检测方法。电化学传感器是将感受的物理量、化学量等信息按一定规律转换成便于测量和传输的电信号的装置。它由固定化的生物敏感材料作为识别元件，经过理化换能器产生间断的或连续的信号，再由接受装置放大或直接收集处理。因为换能器产生的信号强度与被分析物浓度成比例，因此电化学传感器在一定程度上能精确定量被测物。随着电化学检测方法的发展，利用纳米材料作为电极修饰物从而提高电子转移速度、放大检测信号、提高检测灵敏度，成为电化学传感器的重要领域。其中，多壁碳纳米管由于具有较大表面积、为电子转移提供良好通道、孔穴结构更能增强电子转移的特点，在电化学传感器的研究上广泛应用。而丝网印刷电极相比较普通玻碳电极而言，除了具有良好的电化学表现，还具有以下优势1.三电极系统整合在体积较小的基板上；2.可抛弃式，无须再次研磨；3.可大量使用，利于大规模现场检测；4.可进行任意修饰，并保存较长时间。关于玉米赤霉烯酮的检测国内外已建立了多种方法。目前检测玉米赤霉烯酮的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)然而，由于玉米赤霉烯酮本身既没有特异的紫外吸收基团，同时也没有荧光特性，但在一定条件下玉米赤霉烯酮可同某些物质反应形成具有荧光的衍生物，因此荧光衍生剂和衍生方法的选择与HPLC检测玉米赤霉烯酮的准确度和灵敏性有密切关系。此外该法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。 而ELISA方法虽然较HPLC简单，可以大批量检测，但是灵敏度有限，且不宜进行现场检测。 本方法使用仪器体积小、重量轻，便于携带，适于现场检测，同时具有检测灵敏的特点。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种丝网印刷电极及多重修饰方法和检测玉米赤霉烯酮的方法。本发明使用Nafion-多壁碳纳米管/胶体金/壳聚糖混合物作为电极的修饰系统，充分利用了多壁碳纳米管、胶体金和Nafion膜的特点，实现了有效放大检测信号，提高了检测玉米赤霉烯酮的灵敏度。其中，多壁碳纳米管由于具有较大表面积、为电子转移提供良好通道、孔穴结构，能增强电子转移；胶体金由于具有球体结构， 在附着在多壁碳纳米管上后能增强电子转移；Nafion膜是优良的阳离子交换剂，用作电极修饰材料具有良好的离子选择性，它只与阳离子发生选择性交换，排斥中性分子和阴离子， 其离子簇形成的多孔状结构，由Inm的通道相连，提供阳离子传输的通道，并且具有化学惰性、耐腐蚀性。本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种丝网印刷电极，所述丝网印刷电极的工作电极的工作区域涂覆有 Nafion-多壁碳纳米管-胶体金-壳聚糖混合物膜层。优选的，所述胶体金为16 18nm。本发明还涉及一种制备上述的丝网印刷电极的方法包括如下步骤步骤一，将多壁碳纳米管活化，并和Nafion混合，制备Nafion-多壁碳纳米管；步骤二、制备胶体金，利用壳聚糖将Nafion-多壁碳纳米管和胶体金混合均勻；步骤三、将步骤二制得的混合物涂覆在丝网印刷电极的工作电极的工作区域上， 37°C干燥成膜，即得。优选的，步骤一中，所述碳纳米管活化方法为将5mg多壁碳纳米管溶于15ml活化溶液中，超声30min后，9000rpm离心5min，去除上清后，加入超纯水洗涤，9000rpm离心 5min，去除上清，合并残留物，60°C烘箱烘干，加入5ml水，配制成lmg/ml溶液，4°C贮存备用；所述活化溶液中HNO3和H2SO4的体积比为1 3。优选的，步骤一中，所述Nafion-多壁碳纳米管制备方法为将Img所述活化后的多壁碳纳米管溶解于Nafion溶液中，超声分散30分钟后即可，4°C贮存备用；所述Nafion 溶液中Nafion质量占溶液总体积的百分比为0. 1%。优选的，步骤二中，所述胶体金的制备方法具体为将IOOml的HAuCl4溶液加热至沸腾，加入1. 2ml的柠檬酸三钠溶液，煮沸7 lOmin，最后加三蒸水至100ml，制得胶体金溶液；所述柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠质量占溶液总体积的百分比为1%，所述HAuCl4 溶液中HAuCl4质量占溶液总体积的百分比为0. 01%。优选的于，步骤二中，所述壳聚糖与Nafion-多壁碳纳米管和胶体金的混合具体为将10 μ 1 Nafion-多壁碳纳米管溶液和50 μ 1胶体金溶液加入至50 μ 1壳聚糖溶液中， 超声混勻；所述壳聚糖溶液中壳聚糖质量占溶液总体积的百分比为2%。本发明还涉及一种用前述的丝网印刷电极检测玉米赤霉烯酮GEN)的方法，包括如下步骤步骤一，将6μ 1 ZEN-OVA滴加在所述工作电极区域，37°C放置30min ；步骤二，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加8μ 1 BSA溶液，以封闭工作电极，37°C放置30min ；所述BSA溶液中BSA质量占溶液总体积的百分比为；步骤三，取0.7 待测样品，加入3ml甲醇溶液，震荡、静置、离心后，使用0. OlMPBS 稀释5倍，取5μ1备用；步骤四，将抗ZEN单克隆抗体分别与不同浓度的ZEN标准品和待测样品稀释液混合，37 °C 孵育 60min ；
步骤五，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加6 μ 1抗ZEN单克隆抗体和 ZEN标准品或待测样品稀释液的混合溶液，37°C放置30min ；步骤六，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加6 μ 1 HRP标记的羊抗鼠二抗，37 °C 放置 30min ；步骤七，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，将丝网印刷电极放入IOml pH为 7. 4的0. OlM PBS的缓冲液中，测定背景电流，记录为I0 ；步骤八，将丝网印刷电极取出，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，放入 IOmlpH为7. 4的0. OlM PBS的缓冲液中，再加入过氧化氢和氢醌，使其浓度分别为2mM和 0. ImM，搅拌溶液20min后，停止搅拌，测定电流，记录为I，电流变化值ΔΙ = I-I0 ；步骤九；使用Excel软件，将ZEN标准品不同浓度与相对应的ΔΙ绘制标准曲线， 将待测样品相对应的ΔΙ带入标准曲线中，得到ZEN浓度，并乘以稀释因子，即为待测样品中 ^N含量。优选的，步骤三中，所述离心为3000转离心15分。优选的，步骤三中，所述甲醇溶液为体积比为80 20的甲醇和水。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明检测对象单一且针对性强， 准确率高，灵敏度强，灵敏度大于常用的酶联免疫吸附法。可以满足粮食储存销售机构、出入境、海关等检验部门快速、正确地判断ZEN毒素含量的要求，并且便于基层推广和运用。
图1为本发明实施例示意图；其中，1为参比电极，2为工作电极，3为对电极，4为胶体金，5为Nafion-多壁碳纳米管，6为0VA-ZEN，7为抗ZEN单克隆抗体，8为羊抗鼠HRP标记二抗。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例本发明实施例的示意图如图1所示，所述丝网印刷电极包括参比电极1、工作电极 2、对电极3 ；所述工作电极2的工作区域涂覆有Nafion-多壁碳纳米管5-胶体金4-壳聚糖复合物膜层；用所述丝网印刷电极检测样品中的ZEN时，首先将OVA-FBl 6滴加在已涂覆有混合物膜层的工作电极上，干燥后再加入抗FBl单克隆抗体7与待测样品萃取液的混合溶液，干燥后再加入HRP标记的羊抗鼠二抗8，最后加入底物溶液H2A和HQ。制备本发明的丝网印刷电极以及用其检测玉米赤霉烯酮的方法具体步骤如下步骤一，碳纳米管的活化将5mg碳纳米管溶于15ml混合酸溶液(体积比为1 3的HNO3和&S04)中，超声混勻30分钟。将溶液分装，置于离心机中，9000转/分钟离心5分钟，去除上清后，再用超纯水洗涤一次，具体为9000转/分钟离心5分钟。去除上清后，合并残留物，置于60°C烘箱烘干。最后加入5ml水，4°C储存备用。步骤二，Nafion-多壁碳纳米管的制备Img活化后的碳纳米管溶解于0. 1% (ff/V)Nafion溶液中，超声分散30分钟后即可，4°C贮存备用。步骤二，胶体金的制备先将IOOml的0. 001 % (ff/V) HAuC14溶液加热至沸腾，迅速加入1. 3ml的1 % (W/ V)柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7 IOmin出现透明的酒红色，最后加三蒸水至100ml。使用电镜镜检，确保制备的金颗粒尽量使其大小一致，均勻，颗粒直径在16 18nm。步骤三，在丝网印刷电极上修饰复合纳米材料将10 μ 1 Nafion-多壁碳纳米管溶液和50 μ 1胶体金溶液加入至50 μ 1 2% (W/ V)壳聚糖溶液中。超声混勻5分钟后，取6μ1滴加在丝网印刷电极的工作电极上，室温干燥30分钟即可。步骤四，样品处理取0. 75g待测样品，加入:3ml甲醇溶液(甲醇和水的体积比为80 20)，震荡 15min后，静置10min，3000转离心15分后，使用0. OlM PBS稀释5倍，取5μ 1备用。步骤五，检测过程将6 μ 1 ^N-OVA滴加在工作电极区域，37°C放置30min。使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加8μ 1 1% (W/V)BSA溶液，以封闭工作电极，37°C放置30min。将抗^N单克隆抗体分别与ZEN标准品(0,0. 1,0. 5、1、5、10、50、100ng/ml)和待测样品稀释液混合，37°C孵育60min。使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加6 μ 1抗 ZEN单克隆抗体和ZEN标准品或待测样品稀释液的混合溶液，37°C放置30min。使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加6μ 1 HRP标记的羊抗鼠二抗，37°C放置30min。使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，将丝网印刷电极放入IOml 0.01M PBS(pH 7.4)的缓冲液中， 测定背景电流，记录为Itl;将丝网印刷电极取出，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干， 放入IOml 0.01M PBS (pH7. 4)的缓冲液中，再加入过氧化氢(H2O2)和氢醌(HQ)，使其浓度分别为2mM和0. ImM，搅拌溶液20min后，停止搅拌，测定电流，记录为I，电流变化值ΔΙ = I-I0 ；使用Excel软件，将ZEN标准品不同浓度与相对应的ΔΙ绘制标准曲线，将待测样品相对应的ΔΙ带入标准曲线中，得到ZEN浓度，并X稀释因子0X5)，即为待测样品中ZEN含量(μ g/kg)ο综上所述，本发明检测ZEN毒素的方法是鉴于待测样品若有ZEN毒素，则与抗ZEN 抗体竞争结合，使与电极上的^N-OVA结合的抗体量减少，并由此使电极上HRP-羊抗鼠二抗的量也减少，并影响电流变化值ΔΙ ；然后根据ZEN标准品绘制的标准曲线来判定谷物检测样品中ZEN的含量。可以看出，本实施例的方法可直接定量检测样品中的^Ν，不需要专业培训，操作方便、快速。
权利要求
1.一种丝网印刷电极，其特征在于，所述丝网印刷电极的工作电极的工作区域涂覆有 Nafion-多壁碳纳米管-胶体金-壳聚糖混合物膜层。
2.如权利要求1所述的丝网印刷电极，其特征在于，所述胶体金为16 18nm。
3.一种制备如权利要求1所述的丝网印刷电极的方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤一，将多壁碳纳米管活化，并和Nafion混合，制备Nafion-多壁碳纳米管； 步骤二、制备胶体金，利用壳聚糖将Nafion-多壁碳纳米管和胶体金混合均勻； 步骤三、将步骤二制得的混合物涂覆在丝网印刷电极的工作电极的工作区域上，37°C干燥成膜，即得。
4.如权利要求3所述的丝网印刷电极的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述碳纳米管活化方法为将5mg多壁碳纳米管溶于15ml活化溶液中，超声30min后，9000rpm离心 5min，去除上清后，加入超纯水洗涤，9000rpm离心5min，去除上清，合并残留物，60°C烘箱烘干，加入5ml水，配制成lmg/ml溶液，4°C贮存备用；所述活化溶液为体积比为1 3的 HNO3 和 H2SO4。
5.如权利要求4所述的丝网印刷电极的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述 Nafion-多壁碳纳米管制备方法为将Img所述活化后的多壁碳纳米管溶解于Nafion溶液中，超声分散30分钟后即可，4°C贮存备用；所述Nafion溶液中Nafion质量占溶液总体积的百分比为0. 1%。
6.如权利要求5所述的丝网印刷电极的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述胶体金的制备方法具体为将IOOml的HAuCl4溶液加热至沸腾，加入1. 2ml的柠檬酸三钠溶液，煮沸7 lOmin，最后加三蒸水至IOOml，制得胶体金溶液；所述柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠质量占溶液总体积的百分比为1%，所述HAuCl4溶液中HAuCl4质量占溶液总体积的百分比为 0. 01%。
7.如权利要求6所述的丝网印刷电极的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述壳聚糖与Nafion-多壁碳纳米管和胶体金的混合具体为将10 μ 1 Nafion-多壁碳纳米管溶液和 50 μ 1胶体金溶液加入至50 μ 1壳聚糖溶液中，超声混勻；所述壳聚糖溶液中壳聚糖质量占溶液总体积的百分比为2%。
8.一种用如权利要求1所述的丝网印刷电极检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于， 包括如下步骤步骤一，将6 μ 1 ZEN-OVA滴加在所述工作电极区域，37°C放置30min ； 步骤二，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加8μ 1 BSA溶液，以封闭工作电极，37°C放置30min ；所述BSA溶液中BSA质量占溶液总体积的百分比为；步骤三，取0. 75g待测样品，加入3ml甲醇溶液，震荡、静置、离心后，使用0.01M PBS稀释5倍，取5μ1备用；步骤四，将抗ZEN单克隆抗体分别与不同浓度的^N标准品和待测样品稀释液混合， 37 °C 孵育 60min ；步骤五，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加6 μ 1抗ZEN单克隆抗体和ZEN 标准品或待测样品稀释液的混合溶液，37°C放置30min ；步骤六，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加6 μ 1 HRP标记的羊抗鼠二抗， 37°C 放置 30min ；步骤七，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，将丝网印刷电极放入IOml pH为7. 4 的0. OlM PBS的缓冲液中，测定背景电流，记录为I0 ；步骤八，将丝网印刷电极取出，使用0. OlM PBST洗涤工作电极，并晾干，放入IOmlpH为 7. 4的0. OlM PBS的缓冲液中，再加入过氧化氢和氢醌，使其浓度分别为2mM和0. ImM，搅拌溶液20min后，停止搅拌，测定电流，记录为I，电流变化值ΔΙ = I-I0 ；步骤九；使用Excel软件，将ZEN标准品不同浓度与相对应的ΔΙ绘制标准曲线，将待测样品相对应的ΔΙ带入标准曲线中，得到ZEN浓度，并乘以稀释因子，即为待测样品中ZEN含量。
9.如权利要求8所述的丝网印刷电极检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，步骤三中，所述离心为3000转离心15分钟。
10.如权利要求9所述的丝网印刷电极检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，步骤三中，所述甲醇溶液为甲醇与水体积比为80 20。
全文摘要
本发明公开了一种丝网印刷电极及其制备方法和检测玉米赤霉烯酮的方法。所述丝网印刷电极的工作电极区域涂覆有Nafion-多壁碳纳米管-胶体金-壳聚糖混合物膜层。制备时将多壁碳纳米管活化后和Nafion混合；制备胶体金，利用壳聚糖将Nafion-多壁碳纳米管和胶体金混合均匀；将混合物涂覆工作电极的工作区域上，37℃干燥成膜。本发明检测ZEN的方法是鉴于待测样品若有ZEN毒素，则与抗ZEN抗体竞争结合，使与电极上ZEN-OVA结合的抗体量减少，由此使电极上HRP-羊抗鼠二抗量也减少，并影响ΔI；然后根据ZEN标准品绘制的标准曲线来判定谷物检测样品中ZEN的含量。本发明检测对象单一且针对性强，准确率高，灵敏度强。
文档编号G01N27/333GK102565163SQ20121000234
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者严亚贤, 孙建和, 王元凯, 王斌, 秦易 申请人:上海交通大学