专利名称：一种马链球菌兽疫亚种的酶联免疫检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于流行病学和卫生检测领域。具体而言，本发明涉及一种快速检测马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp. zoo印idemicus)的酶联免疫吸附试验(ELISA) 快速检测试剂盒，以及使用该试剂盒进行检测的方法。
背景技术：
马链球菌兽疫亚种是我国猪链球菌病的主要病原，属于兰氏分群中的C群链球菌，该菌主要引起马、猪、牛、犬、猫等多种动物下呼吸道感染，并引起败血症、脑膜炎、关节炎、肺炎的症状，严重时会引起突发性死亡。人与发病动物接触或食用该菌污染的食品，亦可发病，因此该菌为一种重要的人畜共患病的病原。但是，目前尚缺乏快速、敏感的血清学检测方法。因此，研制快速、敏感的新型检测试剂盒是当务之急。马链球菌兽疫亚种类M蛋白(&P)高度抗酸，具有多种生物学功能。其表面有调理素表位，能刺激机体产生抗调理素抗体；能抑制补体Ob在菌体表面沉积，从而抑制机体补体系统的活化；能结合机体的纤维蛋白原，使其具有抗吞噬细胞的吞噬活性。类M蛋白是该菌重要的毒力因子和保护性抗原，而马链球菌兽疫亚种无毒菌株不表达类M蛋白。基于上述原因，本发明人选取马链球菌兽疫亚种的类M蛋白为目标，通过大量实验，建立了检测感染马链球菌兽疫亚种的动物(主要是猪)的抗体的血清学方法。并在此基础上进一步优化，开发出了马链球菌兽疫亚种间接ELISA检测试剂盒。所述方法和试剂盒不仅可以用于该病原的抗体检测，还可以区分动物感染不同病原的血清学差别。
发明内容
本发明的目的在于提供马链球菌兽疫亚种快速检测的间接ELISA诊断方法。一方面，一种用于检测马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp. Z00印idemicus)的酶联免疫试剂盒，其中包括马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原和酶标二抗。本发明所述试剂盒进一步还包括马链球菌兽疫亚种的标准阳性血清、阴性血清、 洗涤液、封闭液、终止液、底物显色剂、浓缩样品稀释液和酶标板。。在本发明中，所述酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶。在一个具体实施方案中，所述的酶标二抗为HRP-SPA。在本发明的一个优选实施方案中，所述的洗涤液为含有0. 5%吐温-20磷酸盐缓冲液。在本发明的一个优选实施方案中，所述的底物显色剂由显色剂A和显色剂B组成， 显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。在本发明的一个优选实施方案中，所述的浓缩样品稀释液为浓缩样品稀释液为含 0. 5%吐温一 20的磷酸盐缓冲液。在本发明的一个优选实施方案中，所述的封闭液为含有5%的脱脂乳的磷酸盐缓冲液。在本发明的一个优选实施方案中，所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。另一方面，本发明还提供了一种检测马链球菌兽疫亚种的酶联免疫方法，该方法包括下列步骤(1)将本发明所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原，用包被液稀释抗原至工作浓度1 640，100 μ L/孔包被酶标板，37°C作用1小时后，4°C包被过夜，用洗涤液洗涤三次，每次5分钟，甩干；(2)加入封闭液，200 μ L/孔，37°C作用2小时后，用洗涤液洗涤三次，每次5分钟，
甩干；(3)加入用血清稀释液稀释过的待检血清和标准阴、阳性血清，100 μ L/孔，37°C 作用2小时后，用洗涤液三次，每次5分钟；(4)加入1 5000稀释的酶标抗体，100 μ L/孔，37°C，90分钟，用PBST洗板三次， 每次5分钟；(5)加入TMB可溶性单组份显色液，各加100 μ L/孔，室温避光显色30分钟；(6)加入终止液100 μ L/孔，酶联免疫检测仪测OD45tl值，根据与建立的判定标准的比对来判定阴性或阳性值。其中所述的建立的判定标准是指检测没有免疫链球菌疫苗，中和试验抗体检测为阴性的血清50份，求得其平均值为X = O. 202 ；标准偏差SD = 0. 061 ；确定阴阳临界点为 X+3SD = 0. 202+3X0. 061 = 0. 385，即待检血清OD450值高于0. 385判为阳性，OD450值低于 0. 35判为阴性。本发明中，所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原是通过基因工程重组表达并纯化得到的。其中所述的基因工程重组表达的步骤包括(a)针对马链球菌兽疫亚种的类M蛋白编码基因的保守区片段设计并合成上下游引物上游引物Pl 5，-GCATGCGCATATGGCCCTCTTGGTTGGTGTGGCAGCTG-3，下游引物P2 5，-GGCACGTCTCGAGGTTTTCTTTGCGTCTTGTTGACACTGC-3，(b)按照扩增程序94 V变性4分钟，94 V 30秒、55 °C 30秒、72 °C 30秒、共30个循环，72°C延伸10分钟，PCR扩增获得类M蛋白编码基因片段；(c)将步骤(b)扩增产物连接入表达载体PetjSa (+)，并将重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中进行原核表达。获得大小为56KD的重组蛋白。(d)大量诱导表达重组菌，4°C，IOOOOg离心lOmin，收集菌体，用高压灭菌的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，重复3次。菌体用1/10菌液体积的超声裂解液重悬，进行超声波破碎菌体，功率200W，工作5s，间隔10s，直至悬液较澄清。超声波裂解后的悬液4°C，IOOOOg离心 20min，分别收集上清和沉淀，用10%的SDS-PAGE电泳分析，检测目的蛋白的表达形式，即以上清蛋白形式或包涵体蛋白形式。结果表明本试验中的类M蛋白以上清蛋白形式表达。本发明所述的纯化马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原的步骤，包括(1)将上清蛋白用0. 45 μ m的滤膜过滤；(2)用5-10倍体积的超纯水清洗带有His2+标签的亲和层析柱；
(3)用5-10倍体积的溶解缓冲液平衡带有His2+标签的亲和层析柱；(4)将步骤(1)中过滤后的蛋白样品加到带有His2+标签的亲和层析柱，并收集流出液；(5)将5-10倍体积的溶解缓冲液加到His蛋白纯化柱，并收集流出液，做好标记， 所述溶解缓冲液的组成为20mM Na3PO4 · 12H20+0. 5NaCl+20mM咪唑；(6)用洗脱缓冲液洗脱蛋白样品，收集蛋白样品，所述洗脱缓冲液的组成为 20mMNa3P04 · 12H20+0. 5NaCl+500mM 咪唑。本发明中纯化马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原的方法包括但不限于亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。
图1图示的是ffestern-blot印迹试验检测蛋白质免疫原性的结果。图2图示的是血清最佳反应时间的确定图3图示的是酶标抗体最佳反应时间的确定图4图示的是底物反应时间的确定
实施例提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(第三版)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press,) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。实施例1 类M蛋白的制备1. IPCR扩增类M蛋白的编码基因片段根据GeneBank公布的马链球菌兽疫亚种ATCC35246类M蛋白的基因序列(登录号为AY^3781)利用I^rimerS. O软件自行设计出一对引物，同时在引物两端分别添加BiolI 和Nde I酶切位点和保护性碱基，引物由上海英骏生物技术公司合成。上游引物(Pl)5，-GCATGCGCATATGGCCCTCTTGGTTGGTGTGGCAGCTG-3，下游引物(P2)5'-GGCACGTCTCGAGGTTTTCTTTGCGTCTTGTTGACACTGC-3，PCR 循环参数为94°C变性 ^iin 后，进入循环，94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，共进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。获得大小为1140bp的基因片段。测序表明其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。1. 2原核表达质粒的构建将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切割目的条带，用DNA快速纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。将回收的PCR产物用B10II和Nde I进行双酶切，提取质粒卩讨-观￡1(+)，进行)01011和而6 I双酶切。并将酶切后的产物用T4DNA连接酶进行连接。将连接产物转化到DH5 α大肠杆菌感受态细胞中，通过PCR鉴定和双酶切鉴定，确定了原核表达质粒构建成功。
1.3类M蛋白基因的诱导表达将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，隔夜挑取单菌落接种到LB培养基中，37°C摇振培养4小时，至OD63tl值为1. 0时，加入IPTG至终浓度为Immol/mL，继续剧烈摇振培养4小时，离心去上清。于沉淀中加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5分钟。含Petj8a(+)的BL21 按同样方法处理，作为阴性对照。最后进行SDS-PAGE，结果样品组有56KD条带出现，与预计大小一致。大量诱导表达重组菌，4°C，IOOOOg离心lOmin，收集菌体，用高压灭菌的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，重复3次。菌体用1/10菌液体积的超声裂解液重悬，进行超声波破碎菌体，功率200W，工作5s，间隔10s，直至悬液较澄清。超声波裂解后的悬液4°C，IOOOOg离心 20min，分别收集上清和沉淀，用10%的SDS-PAGE电泳分析，检测目的蛋白的表达形式，即以上清蛋白形式或包涵体蛋白形式。结果表明本试验中的类M蛋白以上清蛋白形式表达。1.4类M蛋白的纯化用带有His2+tag的亲和层析柱对类M蛋白进行纯化，所需各种溶液的配方如下溶解缓冲液20mMNa3PO4 · 12H20+0. 5NaCl+20mM 咪唑洗脱缓冲液20mMNa3PO4 · 12H20+0. 5NaCl+500mM 咪唑纯化的过程为(1)将上清蛋白用0. 45 μ m的滤膜过滤；(2)用5倍于层析柱体积的超纯水清洗带有His标签的蛋白层析柱；(3)用5倍于层析柱体积的溶解缓冲液平衡带有His标签的蛋白层析柱；(4)取步骤(1)中过滤后的蛋白样品5ml加到带有His2+标签的亲和层析柱，并收集流出液；(5)将5-10ml的溶解缓冲液加到His蛋白纯化柱，并收集流出液；(6)用洗脱缓冲液洗脱蛋白样品，收集蛋白样品。将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测，条带大小为56KD且为单一条带，表明获得了较高纯度的类M蛋白。实施例2对类M蛋白免疫原性的检测对纯化后的类M蛋白进行免疫印迹分析，具体步骤如下(1)将纯化的类M蛋白蛋白进行10% SDS-PAGE电泳。(2)剪1张PVDF膜和4张滤纸，与2孔凝胶大小一致。滤纸置转移缓冲液中平衡 lOmin, PVDF膜置于甲醇溶液中平衡。(3)在夹板面由下至上依次放入4张滤纸、PVDF膜、凝胶、4张滤纸，各层均排尽气泡，精准对齐。(4)将靠上方的电极放于夹层物上，连接电源，15V转印15min。然后断开电源，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层。(5)将PVDF膜放入盛有5%脱脂乳的PBST封闭液的平皿中，放在平缓摇动的摇床上于室温孵育过夜。弃去封闭液，PBST漂洗3次，每次lOmin。(6)将含有马链球菌兽疫亚种的抗体的猪血清按1 1000的比例用5%脱脂乳的PBST稀释，将PVDF膜放入其中孵育池，弃去含阳性血清的封闭液，PBST漂洗3次，每次 IOmin0(7)将HRP-SPA按1 2000的比例用5%脱脂奶粉的PBST稀释，将洗涤好的PVDF膜放入其中，平放在平缓摇动的摇床平台上于室温温孵池。弃去二抗封闭液，PBST漂洗3 次，每次IOmin0(8) PVDF膜放入含有DAB的显色液中显色lOmin，并拍照保存。Western-blot印迹试验结果如图1所示，结果表明本发明的重组蛋白具有良好的免疫原性。实施例3 =ELISA反应最佳条件的确立与检测方法的建立3. 1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定采用方阵滴定法，用0.05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液将马链球菌兽疫亚种类M蛋白抗原作 20μ g/ml,10y g/ml,5y g/ml,2. 5μ g/ml,l. 25μ g/ml，0. 625μ g/ml，0. 312 μ g/ ml倍比稀释，分别加入到96孔酶标板左侧第1-12列的第1_6行，每孔100μ L，37°C作用1 小时后，置4°C过夜。取出用洗涤液(含有0.5%Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗涤3次后， 每孔加入200 μ L封闭液(含有5%的脱脂乳的磷酸盐缓冲液)，37°C作用2小时后，弃孔内的封闭液；用血清稀释液(含有5%脱脂乳、0. 5% Tween-20的磷酸盐缓冲液)将马链球菌兽疫亚种的阳性血清和阴性血清在酶标板横向上进行1 20、1 40,1 80,1 160倍比稀释后，进行ELISA检测。当0D450值接近1. 0时，P/N值高，此时的误差最小，反应最灵敏，为最佳包被浓度与血清最佳稀释度。
抗原浓度
抗体稀释度
(μ g/ml)1201401:801:16040Poutoutout2.972.8952.9632.4092.559N0.1010.1010.0540.060.0670.0760.1160.04520P2.4812.5492.3772.4171.4991.4261.2361.147N0.0170.0840.0590.0480.1060.0780.0990.08210P2.3462.4082.1112.2191.2281.1571.130.932N0.0850.0720.0690.0680.0780.0910.0310.041表 5P2.2312.3641.972.0630.9250.8820.8240.706N0.0750.0720.0540.0540.0970.0930.0580.0392.5P1.9471.9961.9831.8230.790.8130.4960.586N0.0840.060.0710.0780.0590.0620.4590.5341.25P1.8741.8761.5491.5970.5820.5190.4930.476N0.0650.0560.0480.050.050.0470.0320.0410.625P1.1451.2011.0361.0380.4030.3970.2470.194N0.060.0580.0450.0450.0640.0590.0370.040.313P0.5090.4870.3210.3210.2470.1960.1990.186N0.0430.0420.0310.0330.0520.0410.0290.034最后确定血清最适稀释度为1 40，抗原最佳包被浓度为0. 625μ g/mlο
3. 2封闭液的确定
分别用含0. 1% BSA.0. 5% BSA、1 % BSA、5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液作为封闭液， 分别对标准阴阳性血清进行ELISA检测，判定标准为阳性值/阴性值(P/N)最大者为最合适的封闭液。而这四种溶液的P/N值分别为5. 82、5. 51、7. 1、10. 4。
权利要求
1.—禾中求禾中(Streptococcusequi subsp. zooepidemicus)白勺酶联免疫试剂盒，其中包括马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原和酶标二抗。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其中所述试剂盒还包括马链球菌兽疫亚种的标准阳性血清、阴性血清、洗涤液、封闭液、终止液、底物显色剂、浓缩样品稀释液和酶标板。
3.根据权利要求1和2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的酶标二抗为HRP-SPA。
5.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的洗涤液为含有0.5%吐温-20 磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的底物显色剂由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的浓缩样品稀释液为含0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
9.一种检测马链球菌兽疫亚种的酶联免疫方法，该方法包括下列步骤(1)将权利要求1中所述的重组蛋白抗原，用PH9. 6的0. 05mol/L磷酸盐缓冲液稀释至工作浓度1 640，100 μ L/孔包被酶标板，37°C作用1小时后，4°C包被过夜，用洗涤液洗涤三次，每次5分钟，甩干；(2)加入封闭液，200μ L/孔，37°C作用2小时后，用洗涤液洗涤三次，每次5分钟，甩干；(3)加入用血清稀释液稀释过的待检血清和标准阴、阳性血清，IOOyL/孔，37°C作用2 小时后，用洗涤液三次，每次5分钟；(4)加入1 5000稀释的酶标抗体，100 μ L/孔，370C，90分钟，用PBST洗板三次，每次 5分钟；(5)加入TMB可溶性单组份显色液，各加100μ L/孔，室温避光显色30分钟；(6)加入终止液100μ L/孔，酶联免疫检测仪测OD45tl值，根据与建立的判定标准的比对来判定阴性或阳性值。
10.权利要求9所述的检测马链球菌兽疫亚种的酶联免疫方法，其中所述的建立的判定标准是指检测没有免疫链球菌疫苗，中和试验抗体检测为阴性的血清50份，求得其平均值为X = O. 202 ；标准偏差SD = 0. 061 ；确定阴阳临界点为X+3SD = 0. 202+3X0. 061 = 0. 385，即待检血清OD450值高于0. 385判为阳性，OD450值低于0. 35判为阴性。
全文摘要
本发明属于流行病学和卫生检测领域。本发明公开了一种快速检测马链球菌兽疫亚种的ELISA快速检测试剂盒及方法。具体而言，本发明所述试剂盒包括重组马链球菌兽疫亚种类M蛋白抗原和酶标二抗。本发明还公开了一种检测马链球菌兽疫亚种的间接ELISA方法，该方法快速简便，可直接对待检血清进行检测。本发明所述检测试剂盒和检测方法的敏感度高，特异性强。
文档编号G01N33/569GK102565392SQ20121000234
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者周瑾, 范红结, 陆承平 申请人:周瑾, 范红结, 陆承平