专利名称：一种基于微悬臂梁的检测杀虫晶体蛋白Cry1Ab的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于微悬臂梁检测杀虫晶体蛋白CrylAb的方法，具体涉及一种微悬臂梁表面修饰杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的方法及应用。
背景技术：
CrylAb蛋白是一种源于苏云金杆菌[Bacillus Thuringiensis (Bt)]的基因表达的毒蛋白。苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，是一类对害虫毒力 强、致死速度快且对害虫天敌无毒性的昆虫病原微生物。菌体在稳定生长期可形成伴胞晶体蛋白，又称杀虫晶体蛋白(ICP)或D2内毒素。ICP由Cry基因和Cyt基因编码，对敏感昆虫有较强毒性，而对高等动物和人无毒性。CrylAb属于Cry基因家族，是Bt基因表达的毒蛋白(Microbiol.Rev. 1989，53，242)。Bt在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中已成为化学合成农药的有力替代品，它还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。对Bt蛋白快速、准确地测定，将为育种、转基因植物的虫害管理和基因标识提供技术支撑。目前常见的Bt蛋白检测方法有基于核酸DNA检测的PCR法(Anal. Bioanal. Chem. 2003, 373，985)和基于蛋白检测的酶联免疫吸附测定法(ELISA) (Nature, 1999，402，480)，PCR法能够从作物种子开始到作物成熟整个过程中对转基因成分进行精确测定，不受样品的处理方法的影响，但容易出现假阴性和假阳性等问题，对于经过高度处理的转基因产品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等，它们不含任何DNA成分，因此PCR法很难实现对此类转基因食品的检测；酶联免疫吸附检测是基于抗原和抗体的特异性结合以及酶底物的高效催化特性的一种快速检测技术，具有快速、灵敏、准确、低成本等特点，己能定性又能定量检测目标转基因蛋白。但该方法需要进行荧光标记，操作复杂。而微悬臂梁基于表面应力的改变来检测抗原和抗体的特异性结合，无需标记，操作简单，且灵敏度更高。微悬臂梁生化传感技术是近年来伴随着扫描探针显微镜(SPM)和微机电系统(MEMS)迅速发展起来的一种新兴技术。当有生化反应在微悬臂梁的单侧表面发生时，其表面应力的改变会导致微悬臂梁产生弯曲变形，通过光学或电学读出方法可以测量变形值(Nat. Biotech. 2001，19，856;Chem. Rev. 2008，108，522)。和传统的 ELISA 方法相t匕，基于抗体修饰的微悬臂梁免疫传感技术具有以下优点无需标记、灵敏度高、容易实现实时在线的大尺度、高通量、平行阵列测量，可能潜在地用于替代现有的酶联免疫吸附检测方法，对转基因物种的分析检测具有十分重要的意义。目前基于微悬臂梁的免疫传感器主要是用于检测 PSA (Biosens. Bioelectron.，2005, 20, 2157)、CRP (Biosens.Bioelectron. , 2004, 20, 269)、scFv (Proc. Natl. Acad. Sci. , 2005, 102, 14587)、IgG(Biosens. Bioelectron. , 2005, 21, 597)、myoglobin (Sens. Actuators, B2006, 117, 332)和GST (Nanotechnology, 2007, 18，125503)等等，但到目前为止，还没有任何专利和文献报道基于微悬臂梁的检测转基因蛋白(如杀虫晶体蛋白CrylAb)的方法
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种新型无标记、高灵敏度、高特异性的基于微悬臂梁的检测杀虫晶体蛋白CrylAb的方法。为解决上述技术问题，本发明开发了一种基于微悬臂梁的检测杀虫晶体蛋白CrylAb的方法,包含以下步骤将带金膜的微悬臂梁进行前处理，浸入巯基化试剂的醇类溶液中，使巯基化试剂修饰到微悬臂梁的金膜上，清洗；所述清洗包括用 乙醇清洗，氮气吹干；将微悬臂梁浸入I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC .HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中，使巯基化试剂的羧基活化，清洗；所述清洗包括用去离子水清洗，用生物缓冲溶液清洗；将微悬臂梁浸入杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的生物缓冲溶液中，所述生物缓冲溶液包括PH 7. 4的PBS缓冲液，静置，使活化后的羧基和杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的氨基结
八
口 o将上述修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁用于对杀虫晶体蛋白CrylAb的检测。进一步地，所述巯基化试剂为11-巯基十一烷酸、6-巯基己酸或3-巯基丙酸，浓度为I X IOlTl X IO^3M ;所述浓度优选为I X 1(T4M。进一步地，所述浸入巯基化试剂的醇类溶液的条件为时间为12tT24h，温度为15°C ^37. 5°C ;所述时间优选为12h，所述温度优选为15°C进一步地，所述前处理包括用去离子水清洗，氮气吹干。进一步地，所述I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐浓度为IOmg/ml 100mg/ml,优选为10mg/ml ;所述N-轻基琥拍酰亚胺的浓度为10mg/ml 100mg/ml，优选为10mg/ml ;所述I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的体积比为广5:1 ;所述体积比优选为1:1 ;所述浸入的反应时间为0. 5tT4h ;所述反应时间优选为4h。进一步地，所述杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的浓度为0. lmg/mflmg/ml,优选为
0.lmg/ml0进一步地，所述静置的条件为时间为4h 8h，优选为4h。本发明具有如下有益效果I、本发明对转基因植物中杀虫晶体蛋白CrylAb的检测具有很高的特异性和灵敏度，最低检测限能达到0. 4pg/ml，低于现有的杀虫晶体蛋白CrylAb酶联免疫吸附检测方法的检测限(7. 8ngml 2. 9pg/ml)。2、本发明的方法无需标记、操作简单、灵敏度高，可能用于替代现有的酶联免疫吸附检测方法，对转基因物种的分析检测具有十分重要的意义。
具体实施例方式实施例II、微悬臂梁表面修饰杀虫晶体蛋白CrylAb抗体I)将带金膜的微悬臂梁(美国Mikromasch,长350um,宽35um,厚lum,—侧镀有20nm的铬和20nm的金)在物质的量的比值为7:3的浓H2S04/30%H202的混合溶液中浸泡lmin，之后用去离子水清洗三次，氮气吹干。然后将微悬臂梁浸入浓度为I X IQ-4M的巯基化试剂11-巯基十一烷酸的乙醇溶液中，时间为12h，温度为15°C，取出用乙醇清洗三次，氮气吹干；2)将步骤I)处理过的微悬臂梁浸入EDC HCl和NHS的混合溶液中，EDC HCl和NHS的浓度均为10mg/ml，I-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的体积比为I : I ;所述浸入的反应时间为0. 5h。取出用去离子水洗三次，再用pH7. 4的PBS缓冲溶液洗三次；3)连接抗体将经步骤2)处理过的微悬臂梁浸入浓度为0. lmg/ml的杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的溶液中，加入PBS溶液，避光条件下静置4h，取出用pH 7. 4的PBS缓冲溶液洗三次，放A pH 7. 4的PBS缓冲溶液静置Ih。2、微悬臂梁传感器灵敏度效果检测
(I)清洗去离子水清洗微悬臂梁传感器样品池三次，再用乙醇清洗三次，氮气吹干。(2)样品溶液用pH 7. 4的PBS缓冲溶液配置CrylAb蛋白溶液；样品溶液浓度分另1J 为 0. 4pg/ml、4pg/ml、40pg/ml、0. 4ng/ml、4ng/ml(3)样品测定将已修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁置入微悬臂梁传感器的样品槽中，流动相为PH 7. 4的PBS缓冲溶液，流速为lml/h。当微悬臂梁传感器信号稳定后分别加A Iml上述所配置的样品溶液，避光条件下利用微悬臂梁传感器进行监测，得到微悬臂梁的弯曲位移曲线。(4)系统平衡反应实验结束后，取出微悬臂梁，用PBS平衡样品池系统。每测定一个浓度后，取出微悬臂梁，然后按(I)进行新的操作。每一个修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁只检测一种浓度的CrylAb蛋白溶液。实验设三次重复，结果取平均值，结果表明检测不同浓度杀虫晶体蛋白CrylAb的悬臂梁弯曲位移为6. Onm> 10. lnm、16. 0nm、25. 2nm和35. 5nm,说明该微悬臂梁检测杀虫晶体蛋白CrylAb的弯曲位移随着CrylAb的浓度的增大而增大,最低能检测0. 4pg/mlCrylAb.3、微悬臂梁传感器特异性效果检测(I)清洗去离子水清洗微悬臂梁传感器样品池三次，再用乙醇清洗三次，氮气吹干;(2)样品溶液用pH 7. 4的PBS缓冲溶液稀释羊抗人IgG和豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI);样品溶液浓度均为I U g/ml ；(3)样品测定将已修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁置入微悬臂梁传感器的样品槽中，流动相为PH 7. 4的PBS缓冲溶液，流速为lml/h。当微悬臂梁传感器信号稳定后分别加A Iml上述所配置的样品溶液，避光条件下利用微悬臂梁传感器进行监测，得到微悬臂梁的弯曲位移曲线。(4)系统平衡反应实验结束后，取出微悬臂梁，用PBS平衡样品池系统。每测定一个浓度后，取出微悬臂梁，然后按(I)进行新的操作。每一个修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁只检测一种蛋白溶液。实验设三次重复，结果取平均值，结果表明检测IgG和CpTI的悬臂梁弯曲位移均小于3nm。说明该悬臂梁对杀虫晶体蛋白CrylAb的检测具有特异性。实施例2I、微悬臂梁表面修饰杀虫晶体蛋白CrylAb抗体I)将带金膜的微悬臂梁(美国Mikromasch,长350um,宽35um,厚lum,—侧镀有20nm的铬和20nm的金)在物质的量的比值为7:3的浓H2S04/30%H202的混合溶液中浸泡lmin，之后用去离子水清洗三次，氮气吹干。然后将微悬臂梁浸入浓度为IXlO-4M的巯基化试剂6-巯基己酸的乙醇溶液中，时间为12h，温度为15° ，取出用乙醇清洗三次，氮气吹干;2)将步骤I)处理过的微悬臂梁浸入EDC HCl和NHS的混合溶液中，EDC HCl和NHS的浓度为10mg/ml，I-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的体积比为1:1 ;所述浸入的反应时间为0. 5h。取出用去离子水洗三次，再用pH 7. 4的PBS缓冲溶液洗三次；3)连接抗体将经步骤2)处理过的微悬臂梁浸入浓度为0. lmg/ml的杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的溶液中，加入PBS溶液，避光条件下静置4h，取出用pH 7. 4的PBS缓冲溶液洗三次，放A pH 7. 4的PBS缓冲溶液静置Ih。2、微悬臂梁传感器灵敏度效果检测(I)清洗去离子水清洗微悬臂梁传感器样品池三次，再用乙醇清洗三次，氮气吹干。(2)样品溶液用pH 7. 4的PBS缓冲溶液配置CrylAb蛋白溶液；样品溶液浓度分另1J 为 0. 4pg/ml、4pg/ml、40pg/ml、0. 4ng/ml、4ng/ml(3)样品测定将已修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁置入微悬臂梁传感器的样品槽中，流动相为PH 7. 4的PBS缓冲溶液，流速为lml/h。当微悬臂梁传感器信号稳定后分别加A Iml上述所配置的样品溶液，利用微悬臂梁传感器进行监测，得到微悬臂梁的弯曲位移曲线。(4)系统平衡反应实验结束后，取出微悬臂梁，用PBS平衡样品池系统。每测定一个浓度后，取出微悬臂梁，然后按(I)进行新的操作。每一个修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁只检测一种浓度的CrylAb蛋白溶液。实验设三次重复，结果取平均值，结果表明检测不同浓度杀虫晶体蛋白CrylAb的悬臂梁弯曲位移为3. 5nm、7. 2nm、ll. 0nm、18. 2nm和30. lnm,说明该微悬臂梁检测杀虫晶体蛋白CrylAb的弯曲位移随着CrylAb的浓度的增大而增大,最低能检测0. 4pg/ml CrylAb.3、微悬臂梁传感器特异性效果检测(I)清洗去离子水清洗微悬臂梁传感器样品池三次，再用乙醇清洗三次，氮气吹干;(2)样品溶液用pH 7.4的PBS缓冲溶液稀释羊抗人IgG和豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI);样品溶液浓度均为I U g/ml ；(3)样品测定将已修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁置入微悬臂梁传感器的样品槽中，流动相为PH 7. 4的PBS缓冲溶液，流速为lml/h。当微悬臂梁传感器信号稳定后分别加A Iml上述所配置的样品溶液，利用微悬臂梁传感器进行监测，得到微悬臂梁的弯曲位移曲线。(4)系统平衡反应实验结束后，取出微悬臂梁，用PBS平衡样品池系统。每测定一个浓度后，取出微悬臂梁，然后按(I)进行新的操作。每一个修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁只检测一种蛋白溶液。实验设三次重复，结果取平均值，结果表明检测IgG和CpTI的悬臂梁弯曲位移均小于3nm。说明该悬臂梁对杀虫晶体蛋白CrylAb的检测具有特异性。实施例3I、微悬臂梁表面修饰杀虫晶体蛋白CrylAb抗体I)将带金膜的微悬臂梁(美国Mikromasch,长350um,宽35um,厚lum,—侧镀有20nm的铬和20nm的金)在物质的量的比值为7:3的浓H2S04/30%H202的混合溶液中浸泡 lmin，之后用去离子水清洗三次，氮气吹干。然后将微悬臂梁浸入浓度为IXlO-4M的巯基化试剂3-巯基丙酸的乙醇溶液中，时间为12h，温度为15°C，取出用乙醇清洗三次，氮气吹干;2)将步骤I)处理过的微悬臂梁浸入EDC HCl和NHS的混合溶液中，EDC HCl和NHS的浓度为10mg/ml，I-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的体积比为1:1 ;所述浸入的反应时间为0. 5h。取出用去离子水洗三次，再用pH 7. 4的PBS缓冲溶液洗三次；3)连接抗体将经步骤2)处理过的微悬臂梁浸入浓度为lmg/ml的杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的溶液中，加入PBS溶液，避光条件下静置4h，取出用pH 7. 4的PBS缓冲溶液洗三次，放入pH 7. 4的PBS缓冲溶液静置Ih。2、微悬臂梁传感器灵敏度效果检测(I)清洗去离子水清洗微悬臂梁传感器样品池三次，再用乙醇清洗三次，氮气吹干。(2)样品溶液用pH 7. 4的PBS缓冲溶液配置CrylAb蛋白溶液；样品溶液浓度分另1J 为 0. 4pg/ml、4pg/ml、40pg/ml、0. 4ng/ml、4ng/ml(3)样品测定将已修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁置入微悬臂梁传感器的样品槽中，流动相为PH 7. 4的PBS缓冲溶液，流速为lml/h。当微悬臂梁传感器信号稳定后分别加入Iml上述所配置的样品溶液，利用微悬臂梁传感器进行监测，得到微悬臂梁的弯曲位移曲线。(4)系统平衡反应实验结束后，取出微悬臂梁，用PBS平衡样品池系统。每测定一个浓度后，取出微悬臂梁，然后按(I)进行新的操作。每一个修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁只检测一种浓度的CrylAb蛋白溶液。实验设三次重复，结果取平均值，结果表明检测不同浓度杀虫晶体蛋白CrylAb的悬臂梁弯曲位移为0nm、5. lnm、10. 0nm、13. 2nm和24. 3nm,说明该微悬臂梁检测杀虫晶体蛋白CrylAb的弯曲位移随着CrylAb的浓度的增大而增大,最低能检测4pg/ml CrylAb.3、微悬臂梁传感器特异性效果检测(I)清洗去离子水清洗微悬臂梁传感器样品池三次，再用乙醇清洗三次，氮气吹干；
(2)样品溶液用pH 7. 4的PBS缓冲溶液稀释羊抗人IgG和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI);样品溶液浓度均为I U g/ml ；(3)样品测定将已修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁置入微悬臂梁传感器的样品槽中，流动相为PH 7. 4的PBS缓冲溶液，流速为lml/h。当微悬臂梁传感器信号稳定后分别加A Iml上述所配置的样品溶液，避光条件下利用微悬臂梁传感器进行监测，得到微悬臂梁的弯曲位移曲线。(4)系统平衡反应实验结束后，取出微悬臂梁，用PBS平衡样品池系统。每测定一个浓度后，取出微悬臂梁，然后按(I)进行新的操作。每一个修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁只检测一种蛋白溶液。实验设三次重复，结果取平均值，结果表明检测IgG和CpTI的悬臂梁弯曲位移均小于3nm。说明该悬臂梁对杀虫晶体蛋白CrylAb的检测具有特异性。
本发明在所列举的浓度、修饰时间、比值和温度范围内都可以达到本发明的技术效果。根据中国专利CN 102095855 (Anal. Bioanal. Chem.，2010，396，2203-2211、J. Agric. Food. Chem.，2011, 59，2184-2189)报道，现有的杀虫晶体蛋白CrylAb酶联免疫吸附检测方法的检测限为7. 8ng/mf2. 9pg/ml。通过上述实施例可以看出，本发明对转基因植物中杀虫晶体蛋白CrylAb的检测具有很高的特异性和灵敏度，最低检测限能达到0. 4pg/ml，低于现有的杀虫晶体蛋白CrylAb酶联免疫吸附检测方法的检测限范围，具有高灵敏度。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
权利要求
1.一种基于微悬臂梁的检测杀虫晶体蛋白CrylAb的方法，其特征在于，该方法包含以下步骤 将带金膜的微悬臂梁进行前处理，浸入巯基化试剂的醇类溶液中，清洗； 将微悬臂梁浸入I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，清洗； 将微悬臂梁浸入杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的生物缓冲溶液中，静置； 将上述修饰有CrylAb抗体的微悬臂梁用于对杀虫晶体蛋白CrylAb的检测。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述巯基化试剂为11-巯基十一烷酸、6-巯基己酸或3-巯基丙酸，浓度为I X KrtTl X 10_3M。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述浸入巯基化试剂的醇类溶液中的条件为时间为12h 24h，温度为15。。 37. 50C o
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述前处理为在浓H2S04/30%H202的混合溶液中浸泡Imin ;所述浓H2SO4 30%H202物质的量的比值为7 3。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述前处理还包括用去离子水清洗，氮气吹干。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的浓度为10mg/ml 100mg/ml ;所述N-轻基琥拍酰亚胺的浓度为IOmg/m广100mg/ml ;所述I-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的体积比为广5 I ;所述浸入的反应时间为0. 5tT4h。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述杀虫晶体蛋白CrylAb抗体的浓度为0.lmg/ml lmg/ml o
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述静置的时间为4tT8h。
全文摘要
本发明公开了一种基于微悬臂梁的检测杀虫晶体蛋白Cry1Ab的方法。本发明以11-巯基十一烷酸、6-巯基己酸或3-巯基丙酸作为巯基化试剂修饰到微悬臂梁的金膜上，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化巯基化试剂的羧基，使之和杀虫晶体蛋白Cry1Ab抗体的氨基结合得到修饰有杀虫晶体蛋白Cry1Ab抗体的微悬臂梁。本发明将此修饰有Cry1Ab抗体的微悬臂梁用于杀虫晶体蛋白Cry1Ab的检测，取得了良好效果。此方法无需标记、操作简单、灵敏度高，可能用于替代现有的酶联免疫吸附检测方法，对转基因物种的分析检测具有十分重要的意义。
文档编号G01N33/68GK102778569SQ20121014651
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者佟振合, 吴骊珠, 彭荣鹏, 陈彬 申请人:中国科学院理化技术研究所