一种提取样本中被分析物质的试剂以及提取的方法
【专利摘要】本发明提供一种在检测前处理样本的试剂，该试剂包括：萃取助剂，通过该萃取助剂让处于样本中的被分析物质与该样本分离，或/和让被分析物质呈非带电性质，或/和让被分析物质处于被排斥的环境中；萃取试剂，通过萃取试剂将被分析物质从被萃取助剂处理后的环境中萃取出来；非极性调节剂，通过加入非极性调节剂将改变被分析物质在分离的萃取物中的溶解度，让被分析物分配到免疫反应相容性试剂中，用于后续的免疫学检测。
【专利说明】一种提取样本中被分析物质的试剂以及提取的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在检测前处理样本的试剂以及处理方法，特别的，本发明涉及一种在用免疫方法检测样本中被分析物质前处理样本的试剂以及处理方法。
【背景技术】
[0002]免疫学检测技术首先从临床检验领域发展起来，其主要检测样本为血液，尿液，唾液等液体类样本。一般这些液体类样本可以直接被用于免疫学检测。而在食品安全检测领域，一般需要将被分析物质，例如一些小分子物质，从组织样本，例如肝脏、脂肪、肾脏等等，中先提取出来，再用于后续的检测。
[0003]在被分析物质提取方面，还存在一些传统的方法，例如，索氏提取法，它适用于低灵敏度检测手段的项目，需要样本中的被检测物质尽量被提取出来，对其提取后的纯度亦有要求，以满足如传统的光谱测定等常规方法。再例如液液萃取法，该方法在弱极性和强极性溶剂之间萃取，但是需要大量的有机溶剂才能满足检测的要求。
[0004]目前国际上公认的农兽药残留检测的确认方法为仪器方法，包括液相色谱，气相色谱，气质联用和液质联用。这方面，为了适应仪器的要求，常使用C18或HLB (亲水亲脂共聚物)的固相萃取柱来净化样本，另外还有分子印迹聚合材料(MIP)作为富集材料(与目标分子专一性结合的功能基的三位空穴的高聚物)，它实质上是一种仿生学原理，即人工模拟抗体来识别和捕获具有空间互补的表位。近年来，一些大的生物公司，利用抗体技术制备免疫亲和色谱，用于仪器方法的检测前的样本净化。
[0005]与这些这传统的方法相比，目前，组织样本中的被分析物质的提取方法在提取效率，使用溶剂量上都有较大改善，但还是存在效率低下的问题。有学者也在探索提高效率的方法，如高通量，96孔萃取固相萃取装置，一天只能处理24个样本，效率较低。
[0006]关于使用仪器进行分析使用的前处理技术，目前还在不断取得进展，如超临界萃取，凝胶渗透色谱，加速溶剂萃取，固相微萃取，基质固相微萃取等。
[0007]总之，对于传统的仪器检测，复杂的组织样本中的被分析物质的前处理方法是个极大的考验，甚至，有些前处理方法仅适用于一种组织的检测，而另一种组织则不能适用。这主要的原因是仪器本身的检测物质手段为色谱和质谱特征，这些特征的信噪比在非常低的浓度(10_9摩尔/升)下难于稳定维系。
[0008]目前，对于食品安全检测尽管出现了一些免疫试剂，例如ELISA试剂盒，胶体金试纸等，一定程度上解决了检测的效率和准确性问题，但在前处理方面仍不能做到即高效又有效。关于如何在复杂的样本中提取小分子，目前的免疫学方法还主要参考趋于成熟的仪器法前处理方法，甚至许多方法是直接参考仪器方法的。
[0009]以氯霉素为例，农业部1025公告-26-2008动物源食品中氯霉素残留检测酶联免疫吸附法的肌肉，肝脏和鱼虾样本的前处理方法为称取试料3g，加入乙酸乙酯(有机溶剂)6ml振荡，离心，取上层有机相，氮气吹干，残渣用正己烷溶解，再加入缓冲溶液强烈振荡，离心，取下层(非正己烷)层液体进行免疫分析。该方法与农业部公告781-1-2006动物源食品中氯霉素残留量的测定气相色谱一质谱法，农业部781号公告-2-2006动物源食品中氯霉素残留量的测定高效液相色谱一串联质谱法，农业部1025号公告-21-2008动物源食品中氯霉素残留检测气相色谱法的提取方法基本一致，其核心仍然是使用乙酸乙酯将目标分子氯霉素同杂质分开，在保证有效萃取的前提下，利用氮气吹干去除乙酸乙酯，再利用不同的方法来排除对后续检测的干扰，从而达到一定的准确度。
[0010]以β -激动剂类莱克多巴胺为例，农业部1025号公告-6-2008动物性食品中莱克多巴胺残留检测酶联免疫吸附法采用乙腈做萃取组织中的莱克多巴胺小分子，经过氮气吹干，复溶步骤得到可用于酶联免疫法测定的样本，与农业部1025号公告-18-2008动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱一串联质谱法中的提取方法流程基本类似，即有机溶剂萃取，去除有机溶剂，再将残渣溶解在适于仪器检测的溶剂中上机测试。
[0011]以硝基呋喃类代谢物为例，DB33T 744-2009水产品中呋喃唑酮、呋喃它酮代谢物的快速测定酶联免疫法中先对样本进行衍生化，再使用乙酸乙酯将呋喃类衍生物萃取出来，去除乙酸乙酯，该处使用氮气吹干，再利用正己烷和生物相容性缓冲溶液将目标物质溶解出来，用于免疫测定。该种方法与农业部1077号公告-2-2008水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定高效液相色谱法，农业部783号公告-1-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法的提取方法基本都遵循萃取和氮气或旋转蒸发仪等方法去除乙酸乙酯，再进行下一步的测定步骤。
[0012]采用免疫学检测，虽然在后续的检测阶段可以实现无设备化，高通量的检测，但就整个检验方法来看，并未明显提高检验的效率。该问题产生的主要原因在于，目前用于免疫学检测的前处理方法的步骤主要还是考虑适应仪器的检测，如防止堵塞色谱柱而采取适当的溶剂来去除样本中的蛋白类或脂类物质，为了使得检测样本中的待检测物质易被给予理化性质的仪器和方法分析，常常采用净化，以及衍生化步骤。另外，这些小分子并不是游离于样本组织中而是与这些样本组织通过各种化学或物理作用有机的结合，让小分子与这些样本组织有效的游离出来，且不影响后续的免疫学检测，目前的方法只能通过吹干有机溶剂的方法来实现。
[0013]最近，这种免疫检测装置已经越来越多地被普通家庭或非专业机构采用。由于这些检测评估是专为非专业人员所设计的，所以这些检测装置需要操作过程简单，并能保证检测结果的准确性。因此，操作简单而且检测结果准确可靠的检测装置是目前社会所迫切需要的。
【发明内容】
[0014]为了解决传统产品存在的这些缺陷，本发明提供一种在检测前对组织样本处理的试剂以及采用试剂处理样本的方法，通过该方法可以大大简化处理过程，用于非专业人事操作。特别地，当采用免疫试剂来检测被分析物质的时候，可以提高检测的效率和准确性。
[0015]一方面，本发明提供一种在检测前处理样本的试剂，该试剂包括:萃取助剂，通过萃取助剂让处于样本中的被分析物质与该样本分离，或/和让被分析物质呈非带电性质，或/和被分析物质处于被排斥的环境中；萃取试剂，通过该萃取试剂让被分析物质从被萃取助剂处理后的环境中被萃取到萃取试剂中。
[0016]在一些优选的方式中，优选的，萃取助剂的使用发生在样本与萃取试剂接触之后。当然，萃取助剂和萃取试剂二者也可以同时与样本组织接触混合，或者混合后进行匀浆处理。
[0017]在一些优选的方式中,萃取试剂为有机萃取试剂。在一些优选的方式中，萃取试剂的极性与非带电状态下的被分析物质的相似程度高于样本及萃取助剂。更优选的，该萃取试剂或部分萃取试剂与样本和萃取助剂不能相混溶。在另外一些优选的方式中，该萃取试剂具备低毒或无毒，化学惰性，及无制爆制毒性质。这些萃取试剂可以为酯类，腈类，以及酯类与醇类或醚类的混合物。
[0018]本发明的试剂还可以进一步包括非极性调节试剂，该非极性调节试剂与萃取试剂能够混溶形成混溶液体。优选的，该非极性调节试剂的极性与非带电状态下的目标被分析物质的相似程度低于萃取试剂。在一些优选的方式中，非极性调节试剂包括烃类化合物。更优选的，非极性调节试剂包括脂肪烃类和/或脂肪烃类相应的衍生物。这些非极性调节试剂包括，但不局限于，戊烷、己烷、辛烷，环己烷、环己酮、甲苯环己酮，十三烧，十二烧，石油醚，十氢萘，松节油，汽油，煤油等。
[0019]在另外一些优选的方式中，本发明的试剂还可以进一步包括一些免疫反应相溶性试剂。优选的，免疫反应相容性溶液与非极性溶剂和萃取试剂混溶形成的混溶液体不相溶。
[0020]另方面，本发明还提供一种处理样本的试剂盒，该试剂盒包括:萃取助剂，通过萃取助剂让处于样本中的被分析物质与该样本分离，或/和让被分析物质呈非带电性质，或/和被分析物质处于被排斥的环境中；萃取试剂，通过该萃取试剂让被分析物质从被萃取助剂处理后的环境中被萃取到萃取试剂中；非极性调节试剂，该非极性调节试剂与萃取试剂能够混溶形成混溶液体；和免疫反应相溶性试剂。
[0021]在一些优选的方式中，萃取助剂、萃取试剂、非极性调节试剂和免疫反应相溶性试剂分别各自存在而不相互混合，例如以上四种试剂各自被盛装在容器内。在另外一些方式中，萃取助剂和萃取试剂被盛装在一个容器内，例如玻璃容器或塑料容器，非极性调节试剂和免疫反应相溶性试剂被盛装载另一个容器内，例如玻璃容器或塑料容器。
[0022]另一方面，本发明提供一种在检测前处理样本的方法，该方法包括以下步骤:
[0023](I)、让萃取助剂与样本接触，该萃取助剂让样本中的被分析物质与样本分离；和/或让被分析物质呈非带电性质，或/和让被分析物质处于被排斥的环境中；
[0024](2)、让被样本与萃取试剂接触，让被分析物质被萃取到萃取试剂中；
[0025](3)、让分离的萃取物与非极性调节剂和免疫相容性试剂接触，让被分析物质分配到免疫相容性试剂中。
[0026]在一些优选的方式中，在样本中可以先和萃取助剂接触，然后再与萃取试剂；和萃取助剂接触；或者，让样本先和萃取试剂接触，然后再与萃取助剂接触；或者，萃取助剂和萃取试剂可以同时与样本接触。
[0027]在一些优选的方式中，让萃取试剂的极性与非带电状态下的被分析物质的相似程度高于样本及萃取助剂。更优选的，让萃取试剂或部分萃取试剂与样本和萃取助剂不能相溶。或者让萃取试剂或部分萃取试剂与样本和萃取助剂可以分层。
[0028]在另一些优选的方式中，该方法还包括在萃取试剂中加入非极性调节试剂，让非极性调节试剂与萃取试剂能够混溶形成混溶液体。优选的，让非极性调节试剂的极性与非带电状态下的目标有机小分子的相似程度低于萃取试剂。[0029]在另外一些优选的方式中，本发明的方法还可以进一步包括在非极性调节试剂与萃取试剂形成的混溶液体中加入一些免疫反应相容性试剂。优选的，让免疫反应相容性溶液与非极性溶剂与萃取试剂混合形成的液体不相溶。
[0030]在免疫反应相容性溶液，萃取试剂，和非极性溶剂的混合过程中，被分析物质，将受到电离，氢键等的作用，重新分配回免疫反应相容性溶液中，最终实现对被分析物质的检测。
[0031]在以上前述的所有实施方式中，萃取助剂可以包括一些无机盐类。这些无机盐包括，但并不限于，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁等。更优选的，这些无机盐为高浓度，例如无机盐类为与水在10-50°C的溶解度大于20%的无机盐类，包括钠，钾，铯，镁，钙，铜，银，铁，铵的盐酸，硝酸，硫酸盐，及符合溶解性为水在10_50°C的溶解度大于20%的碱类物质。
[0032]在以上前述的所有实施方式中，样本与萃取助剂的体积比可以为0.2-4。
[0033]在以上前述的所有实施方式中，样本/萃取助剂的混合物与萃取试剂的体积比可以为 0.2-10。
[0034]在以上前述的所有实施方式中，分离的萃取物与非极性调节剂的体积比为0.2-10。
[0035]在以上前述的所有实施方式中，样本可以为动物体的组织，例如肌肉组织、脂肪组织、内脏器官组织，毛发组织；或者包括血液，血浆，血清，汗液，唾液，尿液等体液。
[0036]在以上前述的所有实施方式中，被分析物质可以包括作为药物的任何小分子物质，例如一些有机小分子物质。有机小分子物质可以为激素类药物，抗生素，和工业化学品。有机小分子物质可以是，但不局限于，β -激动剂类药物，氯霉素，磺胺类药物，四环素，呋喃类药物代谢物，氟喹诺酮类药物，β_内酰胺类抗生素，孔雀石绿，隐性孔雀石绿，结晶紫，三聚氰胺，喹乙醇，19-去甲睾酮，群勃龙，炔诺酮，己烯雌酚，氟苯尼考，醋酸甲羟孕酮，雌二醇，或安定中的一种或几种。
[0037]在以上前述的所有实施方式中，免疫反应相容性试剂或溶液包括，但不局限于，磷酸盐缓冲溶液，柠檬酸缓冲溶液，碳酸缓冲溶液，MES, TRIS，HEPES, MOPES，生理盐水。
[0038]在以上前述的所有实施方式中，检测包括任意方法的检测，例如包括液相色谱，气相色谱，气质联用和液质联用等仪器方法。检测方法也包括基于免疫学原理的免疫学检测，例如基于抗体与抗原结合原理的酶联免疫方法和横向流动试剂条方法，以及与这些免疫方法配合使用的仪器读取方法。
[0039]有益效果
[0040]利用本发明的试剂可以有效地从样本中提取被分析物质，让后续的检测与真实的水平一致，提高了检测的准确性；因为其减少了传统的浓缩和蒸发，利用本发明的试剂和处理方法不需要复杂的步骤和复杂的辅助设备，一般不具有专业水平的人都可以进行操作；另外，使用本发明的试剂和方法提取的被分析物质可以直接利用免疫学检测方法进行检测，与目前的一些市售的免疫检测方法可以很好的配合，利于推广。
[0041]本发明的详细阐述
[0042]本发明提供一组试剂和该组试剂的使用方法。通过该组试剂的使用，可以将10_5摩尔/千克样本以下，特别地，IO-7摩尔/千克样本10,摩尔/千克样本的有机小分子物质，主要包括各种农药，兽药，激素，环境污染物残留从生物样本中提取出来，用于免疫学检测。
[0043]所谓的样本，主要包括动物组织，乳制品，禽蛋，和各种体液，及毛发。
[0044]所谓萃取试剂指的是中等极性，化学惰性，不溶或微溶于水，或与水不能以任一体积比混溶的溶剂。
[0045]所谓非极性调节试剂，其与萃取试剂有良好的混溶性的弱极性或无极性溶剂。
[0046]所谓萃取助剂，指能与水混溶液体，包括但不限于强酸，如盐酸；或强碱，如氢氧化钠；或氧化剂，如亚硝酸钠，或蛋白质变性剂，如尿素；或酸性或碱性缓冲溶液，如甘氨酸缓冲液，Tris缓冲液；或Lewis酸，如三氯化铝；或Lewis碱，如氨水；蛋白酶，如胃蛋白酶；或在水中常温常压环境下溶解度高的无机盐类；以及如上的一种或几种混合溶液。
[0047]所谓分层，是指不同相的外观区分明显，方法包括静置，离心，但不限于静置，或离心方法。
[0048]被分析物质可以为有机小分子药物，所谓有机小分子药物:分子量低于1000道尔顿的有机化合物，其对生物机体的生理活动具有一定的影响。
[0049]所谓残留:供食用的动物源性食品中，残留的药物，或药物的代谢物，含量低于10-7摩尔/千克样本以下。
[0050]所谓免疫反应相溶性溶液是指常用的免疫学反应缓冲溶液，及其与特殊物质的混合物，该溶液不显著影响免疫学反应和后续的检测。
[0051]本发明的原理特征一为:萃取助剂，其功能包括但不限于在强酸，强碱，氧化/还原，或酶的作用下将于待检组织中的共价结合有机小分子物质解离出来；包括但不限于在变性剂的作用下，将待检组织中物理吸附药物小分子的结构破坏；包括但不限于改变小分子在自身的带点特征，使其趋于分配到适当的萃取试剂中。
[0052]本发明的原理特征二为:适当的萃取试剂，与样本和/或萃取助剂充分混合，利用外力，包括但不限于离心，或静置分层，将目标有机小分子萃取至萃取试剂相中。
[0053]本发明的原理特征三为:一定适当比例的非极性调节剂和萃取试剂和免疫反应相容性溶液充分混合，利用外力，包括但不限于离心，或静置使得目标有机小分子溶解于免疫反应相容性溶液中，用于后续的免疫学检验。
[0054]被分析物质
[0055]被分析物可以为有机小分子，作为药物的有机小分子的包括农药，兽药，激素和环境污染物等，以及一些含碳元素的化合物(除碳的氧化物、碳酸、碳酸盐、氰、氰化物、氧氰、氰酸盐、硫氰、金属碳化物等以外)统称为有机物。一般认为分子量低于1000道尔顿的分子，为小分子。以兽药为例主要指在养殖过程中为促进动物生长或治疗动物疾病而人为添加的药物，主要为抗生素，磺胺类药物，呋喃类药物，驱虫化学品，激素等。
[0056]作为药物的有机小分子的药效本质
[0057]从宏观水平观察，与机体相互作用产生的反应，即药物接触或进入机体后，促进体表与内部环境的生理生化功能改变，或抑制入侵的病原体，协助机体提高抗病能力，达到防治疾病的效果。作为微观水平的解释，目前公认为药物与机体或病原体的特定结构发生相互结合作用后，机体结合自身调节功能而发挥相应的疗效。药物与机体或病原体的结合的核心是药物分子与相应的靶位的有效结合。药物分子与机体或病原体靶位间的作用力有两方面来源，一方面为空间三维结构的互补性，另一方面来源于互补结构的对应位点的相互作用，及结合后配合体的稳定性。
[0058]有机小分子与机体组织样本(又可以称为配体)结合的本质。
[0059]小分子与组织样本之间的结合在于机体或病原体的生物大分子表面存在与药物互补的靶位结构，而往往该结构的本质是机体或病原体自身的蛋白质在生理条件下氨基酸链的自然折叠而产生的特异性构象的结果，同时，蛋白质的氨基酸残基上结合脂类和糖类物质，在生理条件下也会形成特异性的构象，在一定药物浓度下与药物发生非共价性结合。利用这些原理，可以让带有配体的小分子物质处于极端条件下，如强酸，强碱，高盐，去垢剂的作用下，通过破坏与药物结合的配体的构象，来使小分子从样本中游离出来。
[0060]有机小分子物质溶解的本质
[0061]主要决定于小分子物质本身的性质，在极端情况下，组织的蛋白质将会被彻底破坏，从而失去了与小分子特异性结合的性质，在不同分相中，小分子的分配，取决于小分子本身在不同相之间的分配性质。根据相似相溶原理，小分子在不同相充分混合后的分配中，小分子趋于极性相似的相中。这在以下的说明书中将会详细的阐述。
[0062]当被分析物质的浓度10_7摩尔/千克样本10,摩尔/千克样本时，在组织中的有机小分子药物残留由于与正常生理状态下的靶位非共价结合，或代谢物与活性基团在生物酶的催化下的共价结合，呈现10_7摩尔/千克样本-?ο,摩尔/千克样本浓度和高度分散性，一般不会以结晶状态存在。因此这种情况下小分子的萃取本质在于选择适当萃取试剂，以及破坏与其互补的机体或病原体配体。
[0063]当低浓度有机小分子，如10_7摩尔/千克样本-10,摩尔/千克或以下的小分子物质被萃取后，通过加入一定量的非极性调节试剂，和免疫相容性溶液，可以改变萃取试剂对有机小分子的溶剂化作用，在适当的配方和比例情况下，低浓度的有机小分子将会重新分配回免疫反应相容溶液中，这时可以用于后续的基于免疫学反应的高灵敏度测试方法。
`[0064]样本
[0065]任何可能含有被分析物质的组织都可以作为样本，例如含有有机小分子药物的机体组织也可以作为样本，这些机体组织可以是动物体的组织，例如肌肉组织、脂肪组织、内脏器官组织，毛发组织；也可以是包括血液，血浆，血清，汗液，唾液，尿液等的体液样本。动物组织可以是任何动物，例如作为食品的各种养殖动物或野生动物，例如猪、羊、鸡、鸭，牛等动物。
[0066]萃取助剂
[0067]本发明中，在待测的样本，例如组织样本中加入萃取助剂后，进行物理机械振荡。在该过程中萃取助剂将对样本中有机小分子互补配体结构产生不可逆的破坏。由于萃取助剂的高浓度(通常终浓度在0.5M左右)的强酸，如盐酸，或强碱，如氢氧化钠，或氧化剂，如亚硝酸钠，将会水解样本中承担与小分子互补配体结构支架作用的蛋白质，使得蛋白质链发生断裂。让被分析物质为非带电性质，或者/和让被分析物质处于被排斥的环境中。或蛋白质变性剂，如尿素，存在下，使得蛋白质进一步发生变性。在这种极端情况下，原来与小分子结合的配体结构发生了不可逆的变化，变化后的产物将会重新在该种极端环境下通过各种弱作用力，如范德华力，氢键，盐键，静电作用及输水作用，重新相互结合。这种相互结合，已经不具备生理特征，一方面由于链式结构的柔性，使得这种相互作用非常强，另一方面排除了小分子物质与之结合的可能性。同时在该种环境下，有机小分子呈现非带电性质，使得小分子自身与环境中的物质的静电作用得到进一步的削弱。这样小分子与其互补的配体彻底分开，从而游离出来。
[0068]同时，萃取助剂包括含有高浓度的无机盐，如硫酸铵。萃取助剂可以包括一些无机盐类。这些无机盐包括，但并不限于，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁等。更优选的，这些无机盐为高浓度，例如无机盐类为与水在10_50°C的溶解度大于20%的无机盐类，包括钠，钾，铯，镁，钙，铜，银，铁，铵的盐酸，硝酸，硫酸盐，及符合溶解性为水在10-50°C的溶解度大于20%的碱类物质。无机盐有助于样本和萃取试剂的分离，以及调节有机小分子的萃取效率。
[0069]另外，在萃取助剂的环境中，有机小分子被处于排斥的环境中，当用下文的萃取试剂进行萃取的时候，游离的有机小分子更容易从这些组织样本中进入萃取试剂中，从而达到完全的分离。例如至少60%以上的从组织中分离出来的有机小分子进入萃取试剂中，这种比例可以为至少70%，80%或90%，95%以上。
[0070]萃取试剂
[0071]在实际的萃取过程中，可以先对样本进行萃取助剂处理，然后再加入萃取试剂；也可以将萃取助剂与萃取试剂同时加入到样本中，使两种作用同时进行。
[0072]按照物质的成分，一般将萃取试剂分为，①芳香烃类，如苯、甲苯、二甲苯等(有毒)；②脂肪烃类:戊烷、己烷、辛烷等(低毒)；③脂环烃类，如环己烷、环己酮、甲苯环己酮等(低毒)；④卤化烃类，如氯苯、二氯苯、二氯甲烷等(有毒)；⑤醇类，如甲醇、乙醇、异丙醇等(低毒)；⑥醚类:如乙醚、环氧丙烷等(有毒)；⑦酯类:如醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸丁酯等(低毒)；⑧酮类:如丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮等(易制爆，受管制);⑨二醇衍生物:如乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚等(有毒)；_其他:如乙腈、吡啶、苯酚等(有毒)。以上这些萃取试剂都可以作为萃取试剂使用。
[0073]—般，在选择合适的萃取试剂的时候，让选择的萃取试剂最好具备这样的特性:该萃取试剂的极性与非带电状态下的目标有机小分子的相似程度高于样本及萃取助剂。当然，作为优选的一个方式，该萃取试剂或部分萃取试剂与样本和萃取助剂不能相溶，以保证分层(或分相)，这样可以更好的分离。作为一个更优选的方式，该萃取试剂具备低毒或无毒，化学惰性，及无制爆制毒性质，这样可以在任何情况下都可以进行操作，而且更为安全和简便。另外，作为优选的补充，在常温常压下，萃取试剂液态，和低粘度特征。在本发明中符合上述特征萃取试剂，可以为酯类，腈类，以及酯类与醇类或醚类或腈类的混合物。
[0074]本发明中，萃取试剂最好与样本和萃取助剂能够分离，例如自然的分层或通过常规的机械作用，例如离心进行分离。例如，由于萃取试剂的弱极性特征，以及样本中生物大分子的内聚力和大分子之间的多位点作用，在静置足够长时间情况下，萃取试剂和萃取助剂和样本将会自然分离，表现为外观上分层，且分层界面明显。然而在实际应用中，为了更好的进行提取来提高提取的效率，也可以采用离心的方法。即在一定离心力的情况下，使得不相溶各相快速分离。一般分离效果由离心力与离心时间的乘积决定。在低离心力情况下，通过延长离心时间可以实现不同相的分离，在高离心力情况下，在短时间内即可完成分离。对于本发明，离心力可以为IOOOg以上，离心时间设定在20分钟以下。
[0075]非极性调节试剂与免疫反应相容性试剂
[0076]本发明中，当被分析物质为低浓度，如10_7摩尔/千克样本10,摩尔/千克样本或以下。在该种浓度下，被分析物质的溶解度决定于被分析物质本身的极性或电离特征，该种特征与其存在的环境具有一定程度的相对性。在该种情况下，在分离出的萃取试剂中加入可与萃取试剂混溶的非极性调节试剂，或者同时加入免疫反应相容性溶液，这样可以改变萃取试剂中被分析物质的溶解度。在该种情况下，被分析物质将会在萃取/非极性溶剂混合液相，与免疫反应相容性溶液中重新分配。
[0077]一种情况为不改变被分析物质本身的带电特征。萃取/非极性调节试剂混合液表现为弱极性，免疫反应相容性溶液表现为中强极性，此时，低浓度的小分子将会按一定的比例重新分配在两项中，通过调节不同比例的萃取和非极性调节试剂的比例，和选用含适当有机溶剂的缓冲溶液即可实现该种过程。通过离心分离的方法，最终排除萃取/非极性溶剂。
[0078]另一种情况为改变被分析物质本身的带电特征，如对于含羧基的被分析物质，免疫反应相容性溶液为偏碱溶液，则小分子以阴离子状态，重新分配到免疫反应相容性溶液中；反之，对于含氨基的被分析物质，免疫反应相容性溶液为偏酸性溶液，则小分子以阳离子状态重新分配到免疫反应相容性溶液中。
[0079]本发明中，非极性调节剂主要指非极性溶剂。在选择该种溶剂应该至少具备以下特征中的一种或几种:该非极性溶剂的极性与非带电状态下的目标有机小分子的相似程度低于萃取试剂。在一些优选的方式中，该非极性溶剂与萃取试剂混溶，且混溶液体与免疫反应相容性溶剂不互溶，可以自然分层。在另一些更优选的方式中，该非极性具备低毒或无毒，化学惰性，及无制爆制毒性质。在更为优选的方式中，非极性调节剂在常温常压下，该种物质呈液态，和低粘度等特征。非极性调节剂可以包括烃类，及其相应的衍生物；或脂肪烃类，及其相应的衍生物。非极性调节剂可以包括但不限于戊烷、己烷、辛烷环己烷、环己酮、甲苯环己酮，十三烷，十二烷，石油醚，十氢萘，松节油，汽油，煤油等。
[0080]非极性调节剂可以包括植物油，从植物种子或果实中榨取或提炼出的油都以作为非极性调节剂，例如豆油、麻油、桐油、蓖麻油、椰子油、红花油、葵花籽油、油茶籽油、玉米胚油、芥菜籽油、橄榄油和调和油等等。
[0081]免疫反应相溶性试剂
[0082]本发明中，免疫反应相容性试剂是一个实验性概念，只要满足不明显影响免疫反应，在该种溶液中，抗原和抗体能够发生特异性识别，结合，和经过该溶液并未影响到所涉及到的生物固定效果，涉及到的示踪信号的减弱的任何一种溶液。这样试剂可以是包括，但不局限于，磷酸盐缓冲溶液，柠檬酸缓冲溶液，碳酸缓冲溶液，MES, TRIS，HEPES, MOPES,生理盐水。
_3] 免疫学检测
[0084]所谓免疫学检测是基于抗原抗体的高灵敏度，高专一性结合反应的特征，而开发出的用于检测抗体或抗体可识别抗原或类似结构化合物的方法。
[0085]抗体(antibody):机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。所有抗体都是免疫球蛋白。利用抗原对动物的反复刺激，收集血清，或通过单克隆技术制备单克隆抗体，可以得到特异性识别抗原的抗体，即在适当的溶液环境下，一定浓度抗原即可被抗体识别，发生结合，该种浓度特别低，一般都在10_12摩尔/升水平之下，同时这种识别具备高度专一性，例如识别抗原表位上临位硝基的苯环结构的抗体，不能在同等浓度或高出数千倍浓度的条件下识别带间位硝基的苯环结构。利用该种特征，基于抗原抗体反应的免疫学检测技术从上个世纪50年代开始发展起来，并在医学，微生物学检验方面逐步开始了商业化应用。
[0086]抗体的本质是蛋白质，应用其氨基酸残基和蛋白质本身的性质，可以将抗体与各种示踪物质结合或固定在某种高分子材料表面，用于检测抗原物质。这些示踪物质包括胶体金，酶，放射性物质，荧光染料的，固定高分子材料包括硝酸纤维素膜，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚乙烯，尼龙等。
[0087]在具体的应用中，对于各种示踪物质，分别发展了具有不同性能的检测方法，如胶体金技术。金免疫技术是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术，胶体金是指金微小粒子(1-1OOnm)分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质(抗原、抗体或SPA、SPG)，胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体高分子材料上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的定位或定性。利用含有免疫试剂条的装置来检测样本中是否含有被分析物质在很多现有技术中都有揭示或描述。这些试剂条一般包括试剂区域和检测区域，其中试剂区域可以包括样本接受区域和标记区域。在检测区域上包括显示检测结果的区域和位于检测区域下游的检测结果对照区域。通常，这些试剂条的样本接受区域包括样本接受片，标记区域包括标记片，这两个区域共同组成试剂区域，在试剂区域上包括完成反应所必须的试剂，检测区域包括检测片，在检测片上包括显示测试结果的区域和位于该区域下游的检测结果控制对照区域，一般检测结果区域为线条状，在检测结果区域上显示颜色变化来表示样本中被分析物质是否存在；吸水区域包括吸水片，这些部件首尾相连让液体可以从试剂条的一端沿着箭头所指的方向流向另一端完成测试。一般常用的试剂条为硝酸纤维素膜试剂条，即检测区域包括硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上固定特异结合分子来显示检测的结果；还可以是醋酸纤维素膜或尼龙膜等等。例如如下一些专利描述的试剂条或含有试剂条的装置:US 4857453 ；US 5073484 ；US 5119831 ；US 5185127 ；US5275785 ；US5416000 ；US 5504013 ；US 5602040 ；US 5622871 ；US 5654162 ；US 5656503 ；US 5686315 ；US 5766961 ；US 5770460 ；US 5916815 ；US 5976895 ；US 6248598 ；US 6140136 ；US6187269 ；US 6187598 ；US 6228660 ；US 6235241 ；US 6306642 ；US 6352862 ；US 6372515 ；US 6379620 ;和 US6403383。
[0088]对于酶联免疫技术，是将抗原或抗体标记酶，将与之对应的抗体和抗原或抗原和抗体固定在高分子材料上，在液体环境下使液体中的抗原或抗体自由扩散，当液体中含有被检测物质时，该物质将会影响到标记的抗原或抗体与固定的抗原或抗体的反应，通过洗涤，将结合态的被标记酶的抗原或抗体与游离态的分开，通过酶触反应，放大信号，比较信号的强弱，来反映被检测液体中是否含有目标抗原。该种方法相对于胶体金法灵敏度高数倍，并且通过设置目标抗原或抗体的标准曲线，可以做到定量测定目标物质。如上的两种方法均不需要昂贵的实验设备即可完成，相对于质谱，色谱等仪器方法具有不可比拟的成本和可操作优势。
[0089]有机小分子药物一般不能独立成为引起机体免疫反应的抗原，专业上称这类物质为半抗原。当与载体共价结合后，可以作为全抗原，用以制备抗体。由于免疫学反应的高灵敏度，和高度专一性，以及在医学检验领域的广泛应用，相关技术已经较为成熟。而基于同样原理的各种技术，已经逐步向小分子药物的测定渗透，特别地，近来在食品安全检测领域应用逐渐开展起来。
[0090]免疫学检测可以是包括酶联免疫吸附法，胶体金乳胶法，免疫凝集法，放射性免疫法，免疫亲和层系技术，免疫荧光法，和免疫化学发光等方法。
【具体实施方式】
[0091]为了进一步对本发明进行详细的说明，现举例进行说明，这些说明只是在本发明的精髓下进行有限的列举，并不能对本发明的权利要求的范围作出任何的限制。
[0092]实施例1:使用本发明所涉及的原理利用酶联免疫试剂盒来测定猪肉，猪肝，牛肉，牛肝组织的模拟样本中克伦特罗分子的残留。
[0093]样本的制备:在牛肉，猪肉，牛肝，猪肝样本中添加禁用药物克伦特罗分子(俗称“瘦肉精”)，至其含量为0.5ug/Kg，为了模拟真实样本，将添加瘦肉精的样本在4-8°C静置48小时。
[0094]前处理所使用的溶剂包括:
[0095]萃取助剂:浓度为0.1-10M的氢氧化钠水溶液；
[0096]萃取试剂:乙酸乙酯；
[0097]非极性调节剂:庚烷；
[0098]免疫反应相容性溶液:pH为6.0-7.0的磷酸缓冲溶液。
[0099]前处理的具体实施操作:
[0100]准确称取Ig组织样本，加入氢氧化钠(萃取助剂)lmL，加入乙酸乙酯(萃取试剂)lmL，快速振荡10分钟后，在离心力为4000g的条件下离心5分钟；
[0101]将上层液体与pH为6.0-7.0的磷酸缓冲溶液(免疫反应相容性溶液)以及庚烷(非极性调节剂)以体积比为2:1:4的比例混合，静置或离心待分层后，取下层液体进行免疫测定。所进行的免疫检测如下:
[0102](I )、用市售克伦特罗酶联免疫试剂盒(r-biopharm、RIDASCREEN* ClenbuteroIFast, Lot:12280)，其试剂盒的灵敏度为0.lppb。
[0103]结果:
【权利要求】
1.一种提取样本中被分析物质的试剂，该试剂包括:萃取助剂，通过该萃取助剂让处于样本中的被分析物质与该样本分离，或/和让被分析物质呈非带电性质，或/和让被分析物质处于被排斥的环境中；萃取试剂，通过该萃取试剂让被分析物质从被萃取助剂处理后的环境中被萃取到萃取试剂中；其中，所述的试剂还包括非极性调节试剂，该非极性调节试剂与萃取试剂能够混溶形成混溶液体。
2.根据权利要求1的试剂，其中，萃取试剂为有机萃取试剂，萃取试剂的极性与非带电状态下的被分析物质的相似程度高于样本及萃取助剂。
3.根据权利要求1的试剂，其中，该萃取试剂或部分萃取试剂与样本和萃取助剂不相混溶。
4.根据权利要求1的试剂，其中，该非极性调节试剂的极性与非带电状态下的被分析物质的相似程度低于萃取试剂。
5.根据权利要求1的试剂，萃取试剂与非极性调节剂的体积比为0.2-10。
6.根据权利要求1的试剂,其中,所述的试剂还包括免疫反应相溶性试剂,该免疫反应相容性溶液与非极性试剂和萃取试剂混溶形成的混溶液体不相溶。
7.根据权利要求6的试剂，萃取试剂与免疫反应相溶性试剂的体积比为0.2-2。
8.根据权利要求1-7之一所述的试剂，其中，萃取助剂包括与水在10-50°C的溶解度大于20%的无机盐类。
9.根据权利要求1-7之一所述的试剂，其中，萃取试剂为酯类，腈类，醇类，醚类，以及酯类与腈类、醇类或醚类的混合物。
10.根据权利要求1-7之一所述的试剂，其中，非极性调节剂为烃类溶剂或植物油。
11.根据权利要求6的试剂，其中，免疫反应相溶性试剂包括磷酸盐缓冲溶液，柠檬酸缓冲溶液，碳酸缓冲溶液，MES, TRIS，HEPES, MOPES或生理盐水中的一种或几种。
12.根据权利要求1的试剂,其中,被分析物质包括激动剂类药物，氯霉素，磺胺类药物，四环素，呋喃类药物代谢物，氟喹诺酮类药物，β -内酰胺类抗生素，孔雀石绿，隐性孔雀石绿，结晶紫，三聚氰胺，喹乙醇，19-去甲睾酮，群勃龙，炔诺酮，已烯雌酚，氟苯尼考，醋酸甲羟孕酮，雌二醇或安定中的一种或几种。
13.一种从样本中提取被分析物质的方法，该方法包括以下步骤:(1)、让萃取助剂与样本接触，该萃取助剂让样本中的被分析物质与样本分离；和/或让被分析物质呈非带电性质，或/和让被分析物质处于被排斥的环境中；(2)、让样本与萃取试剂接触，让被分析物质被萃取到萃取试剂中；其中，该方法还包括在萃取试剂中加入非极性调节试剂，让非极性调节试剂与萃取试剂能够混溶形成混溶液体。
14.根据权利要求13所述的方法，让样本先和萃取助剂接触，然后再让样本与萃取试剂接触；或者，让萃取助剂和萃取试剂同时与样本接触；或者，让样本先和萃取试剂接触，然后再让样本和萃取试剂的混合物与萃取助剂接触。
15.根据权利要求13所述的方法，让萃取试剂的极性与非带电状态下的被分析物质的相似程度高于样本及萃取助剂。
16.根据权利要求13所述的方法，该方法还包括让所述的非极性调节试剂与萃取试剂形成的混溶液体与免疫反应相溶性试剂相混合。
17.一种从样本中提取被分析物质的方法，该方法包括以下步骤:(1)、让萃取助剂溶液与样本接触，该萃取助剂让样本中的被分析物质与样本分离；和/或让被分析物质呈非带电性质，或/和让被分析物质处于被排斥的环境中；(2)、让样本与萃取试剂溶液接触，让被分析物质被萃取到萃取试剂中；其中，在步骤(2)后让含有萃取助剂、萃取试剂和被分析物质的混合试剂进行分层，然后再让分层的上层溶液与非极性调节试剂和免疫性相容性溶液混合。`
【文档编号】G01N1/30GK103512789SQ201210214022
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月26日 优先权日:2012年6月26日
【发明者】李翰卿 申请人:李翰卿