专利名称：基于能量共振转移的荧光试纸条及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光免疫层析检测领域，属于干化学检测方法的一种，特别涉及一种基于能量共振转移的荧光试纸条及制备方法与应用。
背景技术：
免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列检测抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子，小分子的实验方法。在免疫学检测中，国内外主要采用放射性免疫技术，酶联免疫吸附法，免疫电化学分析技术，胶体金免疫层析法等方法实现定量或者定性检测。但是这些方法都存在不同程度的缺点①放射性免疫和酶联免疫吸附法检测有很高的灵敏度，但是需要配套的大型仪器，对检测环境有一定的要求，检测时间较长，从而不宜在基层推广。
②胶体金免疫层析试纸条具有成本低，快速，高效，高通量检测等特点。经过多年的研究，胶体金免疫层析试纸条在原材料的选择，胶体金颗粒的释放和跑板，检测结果的稳定性等各方面有很成熟的工艺流程。但是由于胶体金颗粒信号放大作用有限，所以胶体金免疫层析试纸条灵敏度不高，并且胶体金免疫层析试纸条很难实现定量检测。③与胶体金免疫层析试纸条相比，荧光免疫层析试纸条具有灵敏度高，可实现准确检测的目的。荧光免疫层析试纸条的示踪剂有单个荧光染料，荧光乳胶微球，镧系元素，量子点等。单个荧光染料信号放大能力有限，并且在光照条件线容易发生荧光淬灭现象，影响了试纸条的灵敏度和稳定性。镧系元素具有比较好的稳定性，但是量子产率较低，影响了试纸条的灵敏度。量子点具有激发光谱宽，发射光谱窄，斯托克斯位移大、稳定性高等特点，但是量子点也有一些不足量子点亮度中等、价格较高，这些影响了试纸条的灵敏度，增加了试纸条的研发和生产的成本，并且量子点含有重金属元素，具有一定的毒性。荧光乳胶微球具有荧光信号强，稳定性高，易于和蛋白标记等优点，是一种很好的免疫层析试纸条的示踪剂。但是荧光乳胶微球也有不足之处相比胶体金颗粒，荧光乳胶微球生产成本高，生产难度更大、和胶体金免疫层析试纸条相比，基于荧光乳胶微球的免疫层析试纸条在颗粒的释放和跑板，结果的稳定性等方面的研究不是很成熟。根据检测的对象和使用抗原抗体的不同，试纸条对荧光乳胶微球的粒径和荧光光谱有不同的要求，而除过国外一些大公司，国内的荧光乳胶微球生产公司难以提供各种荧光光谱和粒径的荧光微球。因此，仍需进一步研究，以期获得一种高灵敏度、操作简单、快速、低成并且可定量检测的方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于能量共振转移的的荧光试纸条。本发明的另一目的在于提供上述荧光试纸条的制备方法。本发明的另一目的在于提供上述荧光试纸条的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种基于能量共振转移的的荧光试纸条，包含底衬、样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连、且附着在底衬上；其中，结合垫上附着荧光受体标记的抗体；层析膜上设置检测线和校准线，检测线靠近结合垫，校准线靠近吸水垫；检测线上附着有荧光物质标记的抗原，校准线上附着有荧光物质标记的蛋白；荧光物质标记的抗原中的抗原与荧光受体标记的抗体中的抗体能通过抗原抗体反应特异性结合，荧光物质标记的蛋白中的蛋白与荧光受体标记的抗体中的抗体不反应；所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条，还包含塑料外壳，塑料外壳包裹底衬和附着在底衬且依次紧密连接样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，塑料外壳上设置有加样孔和观察孔，加样孔位于样品吸收垫的位置，观察孔位于检测线和校准线区域；塑料外壳的作用是防止基于能量共振转移的的荧光试纸条受到污染以及便携易用；所述的底衬为不透水物质，优选为聚氯乙烯(PVC)；所述的样品吸收垫的材质优选为玻璃纤维； 所述的结合垫的材质优选为聚酯膜或者玻璃纤维素膜；所述的层析膜的材质优选为硝酸纤维素膜；所述的吸水垫的材质优选为吸水纸；所述的荧光物质优选为荧光染料、荧光乳胶微球、镧系元素、量子点、发荧光的聚合物或荧光蛋白；更优选为荧光乳胶微球；所述的荧光受体优选为胶体金纳米颗粒、银纳米颗粒或碳纳米颗粒；更优选为胶体金纳米颗粒或石墨烯等可以使检测线上荧光信号淬灭的物质；所述的抗原为完全抗原，优选为完全抗原Cr-iEDTA-BSA或完全抗原CP-AM0Z-BSA ；所述的抗体优选为抗Cr-EDTA抗体或抗呋喃它酮代谢物抗体；所述的蛋白为与抗原或抗体不反应的物质，优选为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述的荧光受体标记的抗体优选通过如下方法制备得到将荧光受体与抗体混合，搅拌均匀；再加入牛血清白蛋白封闭即可；所述的荧光受体标记的抗体更优选通过如下方法制备得到①将荧光受体物质的pH调节为7. 8 8. 2，边搅拌边加入抗体，搅拌反应；②再加入牛血清白蛋白，搅拌反应；离心，沉淀物为荧光受体标记的抗体；步骤①中所述的抗体为抗Cr-EDTA抗体或抗呋喃它酮代谢物抗体；步骤①和步骤②中所述的搅拌反应的时间为25 35min ；所述的荧光物质标记的抗原优选通过如下方法制备得到通过N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的作用，将抗原与荧光物质进行偶联得到；所述的荧光物质标记的抗原更优选通过如下方法制备得到( I)将荧光物质、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺混匀后反应；离心收集沉淀物，用三蒸水分散并且混匀；(2)接着加入抗原，混匀后避光反应；(3)再加入牛血清白蛋白，混匀后反应；离心后收集沉淀物，得到荧光物质标记的抗原；其中，荧光乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、碳二亚胺、抗原和牛血清白蛋白按质量比90 100 4 6 0. 3 10 配比；步骤(I)中所述的荧光物质优选为荧光乳胶微球；步骤(I)中所述的反应的条件优选为20 30°C反应30min ；步骤(2)中所述的避光反应的条件优选为20 30°C反应120min ；步骤(2)中所述的抗原优选为完全抗原Cr-iEDTA-BSA或完全抗原CP-AM0Z-BSA ；步骤(3)中所述的反应的条件优选为20 30°C反应120min ；所述的荧光物质标记的蛋白优选通过如下方法制备得到通过N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的作用，将牛血清白蛋白与荧光物质进行偶联得到；所述的荧光物质标记的蛋白更优选通过如下方法制备得到
·
( I)将荧光物质、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺混匀后反应；离心收集沉淀物，用三蒸水分散并且混匀；(II)接着加入蛋白，混匀后反应；离心后收集沉淀物，得到荧光物质标记的蛋白；其中，荧光乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、碳二亚胺和蛋白按质量比90 100 4 6 10配比；所述的蛋白优选为牛血清白蛋白或卵清蛋白；步骤(I)中所述的荧光物质优选为荧光乳胶微球；步骤(I)中所述的反应的条件优选为20 30°C反应30min ；步骤(II)中所述的反应的条件优选为20 30°C反应120min ；所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条的制备方法，包含以下步骤( I)将荧光受体标记的抗体分散在结合垫上；(2)将荧光物质标记的抗原呈直线型附着在层析膜上，形成检测线；将荧光物质标记的蛋白呈直线型附着在层析膜上，形成校准线；检测线和校准线为平行关系；(3)在底衬上将样品吸收垫、步骤(I)得到的结合垫、步骤(2)得到的层析膜和吸水垫依次相互搭接，其中层析膜上的检测线靠近结合垫，校准线远离结合垫，靠近吸水垫；得到基于能量共振转移的的荧光试纸条；步骤(I)优选为用喷金划膜仪将荧光受体标记的抗体喷到结合垫上；所述的荧光受体标记的抗体在结合垫上的量优选为I. 2 μ 1/cm ；步骤(2)中所述的荧光物质标记的抗原优选通过喷金划膜仪包裹到层析膜上；步骤(2)中所述的荧光物质标记的蛋白优选通过喷金划膜仪包裹到层析膜上；所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条在检测领域中的应用。本发明的原理突光能量共振转移(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)是距离很近的两个荧光物质间或者荧光物质和能量受体之间产生的一种能量转移现象。当供体荧光物的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在一定范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使供体的荧光强度比它单独存在时要低的多或者消失。胶体金颗粒，石墨烯，纳米碳颗粒等材料的吸收光谱很宽，是理想的荧光共振能量转移受体。本发明利用荧光物质和相应的在特定波长具有吸光性质的荧光受体之间的荧光能量共振转移(FERT)制备出了高灵敏度，低成本，稳定，可定量检测的免疫层析试纸条。在试纸条硝酸纤维素膜上有两条在激发光源激发下可以发出荧光的线，检测线和校准线。当样品中没有检测物时，荧光受体标记的抗体和检测线荧光标记的抗原结合，使得检测线上的荧光强度减弱或者消失。当样品中存在检测物时，检测物和检测线上的抗原竞争结合荧光受体标记的抗体，使得和检测线结合的荧光受体标记的抗体减少，从而使检测线上的荧光出现。检测物在一定的范围内随着浓度增加检测线上的荧光强度增强。而在检测时校准线上的荧光强度不变。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条与放射性免疫技术、ELISA相t匕，具有操作安全(无放射物污染)，简便，低成本，快速等优点。与胶体金免疫层析试纸条比较，具有灵敏度高，可以定量化检测等特点。和荧光免疫层析试纸条相比，具有以下优点①本发明使用的荧光受体为金纳米颗粒，银纳米颗粒，碳纳米颗粒等，这些颗粒和制备相对简单，生产成本较低。②本发明所使用的荧光物质结合在硝酸纤维素膜检测线和校准线上，所以对荧光物质的量子产率，颗粒大小，生产工艺等方面要求降低。 ③本发明所使用的荧光物质固定在硝酸纤维素膜的检测线和校准线上，所以在试纸条的研发和生产过程中减少了荧光物质的使用，节约的研发和生产的成本。④本发明的免疫荧光能量共振转移试纸条和基于荧光乳胶微球的荧光试纸条相t匕，在颗粒的释放，跑板以及试纸条结果的稳定性方面的工艺更加成熟。(2)本发明所述的免疫荧光能量共振转移试纸条使用竞争法，应用范围广，能够用于单项检测或者一检多项等快速检测项目；检测基质可以是全血，血清，唾液，尿液，食品样本，水样等；检测对象可以是食品中的毒素，抗生素，与疾病相关的小分子，环境中的有害物质或者国家禁止生产和使用的如毒品等一些物质。
图I是本发明提供的基于能量共振转移的的荧光试纸条的示意图；其中11_底衬，12-样品吸收垫，13-结合垫，14-层析膜，15-吸水垫，16-检测线，17-校准线，18-荧光受体标记的抗体。图2是本发明所使用的荧光试纸条摄像仪的剖面示意图，其中1_外壳；2_LED灯散热器；3_摄像仪；4-LED灯源；5_用于过滤LED灯源发光波长的滤光片；6_用于过滤荧光物质发光波长的滤光片；7_进样槽。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I快速检测三价铬离子的基于能量共振转移的的荧光试纸条的制备和应用，包括如下步骤(I)荧光标记完全抗原的制备将100 μ I荧光乳胶微球(PS-G0200-010，苏州照康生物科技有限公司)加入到I. 5ml EP管中，再加入400 μ I三蒸水，混匀后超声波(36000Hz)处理3分钟；接着加入浓度为100mg/ml的NHS(N_羟基琥珀酰亚胺)40 μ I和浓度为IOOmg/ml的EDC(碳二亚胺)60 μ 1，混匀后室温反应30分钟；10000 X g离心两分钟，离心后收集沉淀物并且用500 μ I三蒸水分散并且混匀；加入浓度为30mg/ml的完全抗原Cr-iEDTA-BSA(颜露等，抗重金属Cr3+单克隆抗体的制备及其应用，细胞与分子免疫学杂志，2011，27 (4)422-424) 10μ 1，混匀后室温避光反应2小时；加入质量体积比10%BSA (牛血清白蛋白)100 μ 1，混匀后室温反应2小时；10000Xg离心两分钟，离心后收集沉淀物并且用200 μ I复溶解液(pH值7. 2、O. OlM的PBS溶液中含质量百分比20%的海藻糖、质量百分比20%的蔗糖、体积百分比1%曲拉通X-100以及质量百分比2%的PEG (聚乙二醇)4000)溶解，得到荧光标记完全抗原，4 0C避光保存。(2)荧光标记BSA的制备将100 μ I荧光乳胶微球加入到1.5ml EP管中，再加Λ 400 μ I三蒸水，混匀后超声波(36000Hz)处理3分钟；接着加入浓度为100mg/ml的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)40 μ I和浓度为100mg/ml的EDC (碳二亚胺)60 μ 1，混匀后室温反应30分钟；10000 Xg离心两分钟，离心后收集沉淀物用500 μ I三蒸水分散并且混匀；加入质量体积比10%BSA (牛血清白蛋白)100μ 1，混匀后室温避光反应2小时；10000Xg离心两分 钟，离心后收集沉淀物并且用200 μ I复溶解液溶解溶解，得到荧光标记BSA，4°C避光保存。(3)胶体金标记抗EDTA-Cr抗体的制备A、胶体金的制备在250ml锥形瓶中装有IOOml三蒸水，将其放在磁力加热搅拌器上搅拌并加热至沸腾；准确加入2ml质量百分比1%的氯金酸后加入4ml质量百分比1%的二水合柠檬酸三钠，加热搅拌10分钟后停止加热继续搅拌10分钟；所制备的胶体金溶液冷却后，4°C保存备用。B、胶体金标记抗体的制备取步骤A制备好的胶体金溶液5mL，用O. 25M碳酸钾将胶体金溶液的pH值调节为8. O。边揽拌边加入 100 μ I O. 04mg/ml 的抗 Cr-EDTA 抗体(Colloidal gold nanoparticleprobe-based immunochromatographic assay for the rapid detection of chromiumions in water and serum samples. Analytica Chimica Acta. 2012，745:99-105),揽拌30分钟；加入质量百分比10%BSA 550ml，搅拌30分钟；12000r/min离心15分钟，弃上清液，将沉淀物用200ml复溶解液(pH值7. 2,0. OlM的PBS溶液中含质量百分比20%的海藻糖、质量百分比20%的蔗糖、体积百分比1%曲拉通X-100以及质量百分比2%的PEG (聚乙二醇)4000)复溶，4 °C保存备用。(4)免疫FERT试纸条的组装如图I所示，免疫FERT试纸条包括底衬11、以及附着在底衬上依次紧密相连的样品吸收垫12、结合垫13、层析膜14和吸水垫15。将胶体金标记的抗体用喷金划膜仪以2. 5mg/cm的量喷到聚酯膜结合垫上，如图I中18所示；按照从结合垫到吸水垫的方向，依次把按体积稀释300倍的荧光标记完全抗原和按体积稀释300倍的荧光标记BSA用喷金划膜仪以lmg/cm的量包被到层析膜(硝酸纤维素膜)上，分别作为检测线16和校准线17，并且在37°C烘箱烘两天。在底衬上顺次相互搭接样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫，得到的试纸板按要求切割成4_的试纸条。再装进塑料卡壳(塑料卡壳开有加样孔和检测孔，加样孔的位置位于样品吸收垫位置；检测孔的位置位于检测线和校准线所在区域)组成完整的免疫FERT试纸条。(5)样本前处理
取IOOml珠江猎德大桥水样，用滤纸初步过滤除去杂质之后取其中的50ml，用IOMNaOH和IOM盐酸调节pH值至7. O 7. 2，再加入O. 5 μ M螯合剂EDTA-Na2O. 5ml，反应10 15min。(6)试纸条的使用在浓度为50nM的EDTA-Na2水溶液中加入三氯化铬，分别配制如下浓度的标准溶液三价铬离子浓度为 800ng/ml, 400ng/ml, 200ng/ml, lOOng/ml, 50ng/ml, 25ng/ml,12. 5ng/ml, 6. 25ng/ml, 3. 125ng/ml, I. 5625ng/ml, Ong/ml 将前述配制的 11 种浓度的标准溶液60 μ I分别加到步骤(4)制备的免疫FERT试纸条的加样孔中，15min后通过计算检测线上荧光强度和校准线上荧光强度的比值，荧光(用如图2所示的荧光试纸条摄像仪拍 照后，用Image J软件分析T线的荧光强度Ft和C线的荧光强度F。，计算FT/F。)，绘制标准曲线。在样品检测时把经过前处理的水样加入到试纸卡的加样孔中，计算检测线和校准线上荧光强度的比值，再通过标准曲线就可以计算出水样中三价铬离子的浓度。本实验的灵敏度为6. 25ng/ml，在6. 25ng/ml到800ng/ml的检测范围内线性为y=0. 1192χ_0· 0432，R2=O. 9934。图2所示的荧光试纸条摄像仪的结构如下外壳I为由6块PVC板围闭得到的箱体结构，内部装有摄像仪3、两个LED灯源4、两个LED灯散热器2、两块用于过滤LED灯源发光波长的滤波片5 (滤波峰值为450nm)、一块用于过滤荧光物质发光波长的滤波片6 (滤波峰值为508nm)和进样槽7 ;其中，摄像仪3、两个LED灯源4和两个LED灯散热器2位于进样槽7的同一侧；两个LED灯源4为并联连接，每个LED灯源4和一个LED灯变压器连接；LED灯源为蓝光LED灯源，峰值波长为450 455nm ;每个LED灯源4旁边设置有一个LED灯散热器2,靠近LED灯散热器的外壳的侧壁上有若干个孔；在每个LED灯源4与进样槽7之间设置有一块滤波峰值为450nm的滤波片5 ;两个LED灯源4中间设置有摄像仪3，摄像仪3的镜头正对进样槽的中心，摄像仪3的镜头前装有滤波峰值为508nm的滤波片6 ;进样槽7与外壳I的底板为滑动连接关系，进样槽7和荧光试纸条接触的一面为黑色。(7)结果观察阳性结果为检测线和校准线出现荧光，阴性结果为只有校准线出现荧光；若校准线没有荧光，则该试纸条无效。该试纸条的灵敏度是Cr3+6. 25ng/ml,胶体金试纸条的灵敏度是5ng/ml。实施例2快速检测肉类食品中呋喃它酮代谢物(AMOZ)的基于能量共振转移的的荧光试纸条的制备和应用，包括如下步骤(I)荧光标记完全抗原CP-AMOZ-BSA的制备将100 μ I荧光乳胶微球(PS-G0200-010，苏州照康生物科技有限公司)加入到I. 5ml EP管中，再加入400 μ I三蒸水，混匀后超声波(36000赫兹)处理3分钟；接着加入浓度为100mg/ml的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)40 μ I和浓度为100mg/ml的EDC (碳二亚胺)60 μ 1，混匀后室温反应30分钟；10000 Xg离心两分钟，离心后收集沉淀物并且用500μ I三蒸水分散并且混匀；加入浓度为30mg/ml的完全抗原CP-AMOZ-BSA (颜露.吠喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的研究[D]博士论文.广州暨南大学生物工程学系，2011)10μ 1，混匀后室温避光反应2小时；加入质量百分比10%BSA(牛血清白蛋白)100μ 1，混匀后室温反应2小时；10000 Xg离心两分钟，离心后收集沉淀物并且用200 μ I复溶解液(pH值7. 2、0. OlM的PBS溶液中含质量百分比20%的海藻糖、质量百分比20%的蔗糖、体积百分比1%曲拉通X-100以及质量百分比2%的PEG (聚乙二醇)4000溶解，得到荧光标记完全抗原，4°C避光保存。(2)荧光标记BSA的制备将100 μ I荧光乳胶微球加入到I. 5ml EP管中，再加入400 μ I三蒸水，混匀后超声波(36000赫兹)处理3分钟；接着加入浓度为100mg/ml的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)40 μ I和浓度为100mg/ml的EDC (碳二亚胺)60 μ 1，混匀后室温反应30分钟；10000 Xg离心两分钟，离心后收集沉淀物用500 μ I三蒸水分散并且混匀；加入质量百分比10%BSA (牛血清白蛋白)100 μ 1，混匀后室温避光 反应2小时；10000Xg离心两分钟，离心后收集沉淀物并且用200 μ I复溶解液(pH值7. 2,0. OlM的PBS溶液中含质量百分比20%的海藻糖、质量百分比20%的蔗糖、体积百分比1%曲拉通X-100以及质量百分比2%的PEG (聚乙二醇)4000溶解，得到荧光标记BSA，4°C避光保存。(3)胶体金标记抗呋喃它酮代谢物抗体的制备A、胶体金的制备在250ml锥形瓶中装有IOOml三蒸水，将其放在磁力加热搅拌器上搅拌并加热至沸腾；准确加入2ml质量百分比1%的氯金酸后加入3ml质量百分比1%的二水合柠檬酸三钠，加热搅拌10分钟后停止加热继续搅拌10分钟；所制备的胶体金溶液冷却后，4°C保存备用。B、胶体金标记抗体的制备取步骤A制备好的胶体金溶液5mL，用O. 25M碳酸钾将胶体金溶液的pH值调节为8. O。边搅拌边加入100 μ I O. 04mg/ml的抗呋喃它酮代谢物抗体(颜露.吠喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的研究[D].广州暨南大学生物工程学系，2011)，搅拌30分钟；加入质量百分比10%BSA 550ml，搅拌30分钟；12000r/min离心15分钟，弃上清液，将沉淀物用240ml复溶解液(pH值7. 2、O. OlM的PBS溶液中含质量百分比20%的海藻糖、质量百分比20%的蔗糖、体积百分比1%曲拉通X-100以及质量百分比2%的PEG(聚乙二醇)4000)溶解，4°C保存备用。(4)免疫FERT试纸条的组装如图I所示，免疫FERT试纸条包括底衬11、以及附着在底衬上依次紧密相连的样品吸收垫12、结合垫13、层析膜14和吸水垫15。将胶体金标记的抗体用喷金划膜仪以2. 5mg/cm的量喷到聚酯结合垫上，如图I中18所示；按照从结合垫到吸水垫的方向，依次把按体积稀释300倍的荧光标记完全抗原和按体积稀释300倍的荧光标记BSA用喷金划膜仪以lmg/ml的量包被到层析膜(硝酸纤维素膜)上，分别作为检测线16和校准线17，并且在37°C烘箱烘两天。在底衬上顺次相互搭接样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫，得到的试纸板按要求切割成4_的试纸条。再装进塑料卡壳(塑料卡壳开有加样孔和检测孔，加样孔的位置位于样品吸收垫位置；检测孔的位置位于检测线和校准线所在区域)组成完整的免疫FERT试纸条。(5)样品前处理称取I. Og均质后的鸡肉组织样本，加入到4mL去离子水、O. 5mLlmol/L盐酸溶液和IOOyL 50mmol/L 4-CBA (对醛基苯甲酸)，用振荡器充分振荡2min。在37°C过夜孵育16h。接着加入5mL 0. lmol/L磷酸氢二钾溶液、0. 4ml lmol/L氢氧化钠溶液和5mL乙酸乙酯,用振荡器剧烈振荡30s,4000r/min离心lOmin。取2. 5mL乙酸乙酯相至IOmL干燥的玻璃试管中，于50 60°C氮气流下吹干。加入ImL正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加入ImL O. 01M、pH 7. 2的PBS，用涡旋仪涡动Imin充分混匀。4000r/min离心IOmin0除去上层有机相，取下层水相50 μ L用于分析。(6)将标准品 10ng/ml、5ng/ml、2. 5ng/ml、l. 25ng/ml、0. 625ng/ml、0. 3125ng/ml、0. 15625ng/ml的CP-AMOZ标准品(用0. 01M，PH7. 2的PBS溶解得到)滴加到加样孔中后，通过计算检测线上荧光强度和校准线上荧光强度的比值，绘制标准曲线。在样品检测时通过计算试纸条检测线和校准线上荧光强度的比值，通过标准曲线可以计算出检测物的浓度。本实验的灵敏度为O. 3125ng/ml。(7)结果观察阳性结果为检测线和校准线出现荧光，阴性结果为只有校准线出现荧光；若校准线没有荧光，则该试纸条无效。该试纸条的灵敏度是Cr3+O. 3ng/ml，胶体金试纸条的灵敏度是3ng/ml。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种基于能量共振转移的的荧光试纸条，包含底衬、样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连、且附着在底衬上；其特征在于结合垫上附着荧光受体标记的抗体；层析膜上设置检测线和校准线，检测线靠近结合垫，校准线靠近吸水垫；检测线上附着有荧光物质标记的抗原，校准线上附着有荧光物质标记的蛋白；荧光物质标记的抗原与荧光受体标记的抗体能通过抗原抗体反应特异性结合，突光物质标记的蛋白与突光受体标记的抗体不反应。
2.根据权利要求I所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条，其特征在于所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条还包含塑料外壳，塑料外壳包裹底衬和附着在底衬且依次紧密连接样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，塑料外壳上设置有加样孔和观察孔，加样孔位于样品吸收垫的位置，观察孔位于检测线和校准线区域。
3.根据权利要求I所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条，其特征在于所述的底衬为不透水物质；所述的样品吸收垫的材质为玻璃纤维；所述的结合垫的材质为聚酯膜或者玻璃纤维素膜；所述的层析膜的材质为硝酸纤维素膜；所述的吸水垫的材质为吸水纸。
4.根据权利要求I所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条，其特征在于 所述的荧光物质为荧光染料、荧光乳胶微球、镧系元素、量子点、发荧光的聚合物或荧光蛋白； 所述的荧光受体为胶体金纳米颗粒、银纳米颗粒或碳纳米颗粒； 所述的蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5.根据权利要求I所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条，其特征在于 所述的荧光受体标记的抗体通过如下方法制备得到将荧光受体与抗体混合，搅拌均匀；再加入牛血清白蛋白封闭即可； 所述的荧光物质标记的抗原通过如下方法制备得到通过N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的作用，将抗原与荧光物质进行偶联得到； 所述的荧光物质标记的蛋白通过如下方法制备得到通过N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的作用，将牛血清白蛋白与荧光物质进行偶联得到。
6.根据权利要求5所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条，其特征在于 所述的荧光受体标记的抗体通过如下方法制备得到 ①将荧光受体物质的pH调节为7.O 8. 2，边搅拌边加入抗体，搅拌反应； ②再加入牛血清白蛋白，搅拌反应；离心，沉淀物为荧光受体标记的抗体； 所述的荧光物质标记的抗原通过如下方法制备得到 (1)将荧光物质、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺混匀后反应；离心收集沉淀物，用三蒸水分散并且混匀； (2)接着加入抗原，混勾后避光反应； (3)再加入牛血清白蛋白，混匀后反应；离心后收集沉淀物，得到荧光物质标记的抗原；其中，荧光乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、碳二亚胺、抗原和牛血清白蛋白按质量比90 1004 6 0. 3 10 配比； 所述的荧光物质标记的蛋白更通过如下方法制备得到 (I)将荧光物质、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺混匀后反应；离心收集沉淀物，用三蒸水分散并且混匀；(II)接着加入蛋白，混匀后反应；离心后收集沉淀物，得到荧光物质标记的蛋白；其中，荧光乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、碳二亚胺和蛋白按质量比90 100 4 6 10配比。
7.根据权利要求6所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条，其特征在于 步骤①中所述的抗体为抗Cr-EDTA抗体或抗呋喃它酮代谢物抗体； 步骤①和步骤②中所述的搅拌反应的时间为25 35min ； 步骤(I)中所述的荧光物质为荧光乳胶微球； 步骤(I)中所述的反应的条件为20 30°C反应30min ； 步骤(2)中所述的避光反应的条件为20 30°C反应120min ； 步骤(2)中所述的抗原为完全抗原Cr-iEDTA-BSA或完全抗原CP-AMOZ-BSA ； 步骤(3)中所述的反应的条件为20 30°C反应120min ； 步骤(I)中所述的荧光物质为荧光乳胶微球； 步骤(I)中所述的反应的条件为20 30°C反应30min ； 步骤(II)中所述的蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白； 步骤(II)中所述的反应的条件为20 30°C反应120min。
8.权利要求I所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条的制备方法，其特征在于包含以下步骤 (1)将荧光受体标记的抗体分散在结合垫上； (2)将荧光物质标记的抗原A呈直线型附着在层析膜上，形成检测线；将荧光物质标记的蛋白呈直线型附着在层析膜上，形成校准线；检测线和校准线为平行关系； (3)在底衬上将样品吸收垫、步骤(I)得到的结合垫、步骤(2)得到的层析膜和吸水垫依次相互搭接，其中层析膜上的检测线靠近结合垫，校准线远离结合垫，靠近吸水垫；得到基于能量共振转移的的荧光试纸条。
9.根据权利要求8所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条的制备方法，其特征在于步骤(I)为用喷金划膜仪将荧光受体标记的抗体喷到结合垫上； 步骤(2)中所述的荧光物质标记的抗原通过喷金划膜仪包裹到层析膜上； 步骤(2)中所述的荧光物质标记的蛋白通过喷金划膜仪包裹到层析膜上。
10.权利要求I 7所述的基于能量共振转移的的荧光试纸条在检测领域中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基于能量共振转移的荧光试纸条及制备方法与应用。该荧光试纸条包含底衬、样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连、且附着在底衬上；其中，结合垫上附着荧光受体标记的抗体；层析膜上设置检测线和校准线，检测线靠近结合垫，校准线靠近吸水垫；检测线上附着有荧光物质标记的抗原，校准线上附着有荧光物质标记的蛋白；荧光物质标记的抗原与荧光受体标记的抗体能通过抗原抗体反应特异性结合，荧光物质标记的蛋白与荧光受体标记的抗体不反应。该荧光试纸条具有操作安全、简便、灵敏、低成本以及快速等优点，应用范围广，能够用于单项检测或者一检多项等快速检测项目。
文档编号G01N33/558GK102890155SQ20121033686
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者唐勇, 付强强 申请人:暨南大学