专利名称：ELISpot视神经脊髓炎诊断试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及E LISPot视神经脊髓炎诊断试剂盒及其应用，属于医学免疫学诊断技术领域，具体是关于通过运用ELISpot方法对视神经脊髓炎进行诊断的应用。
背景技术：
在已有技术中，视神经脊髓炎(Neuromyelitis Optica,NMO,又称Devic病)病因不明，临床表现多为双侧急性神经炎或球后视神经炎，以及在发生视神经炎的同时或前后发生的脊髓炎所引起的截瘫，病人视力多急剧下降或完全失明，眼底表现为视盘充血、水肿(视神经炎型)或正常眼底(球后视神经炎型)。此外，尚未有瞳孔光反射迟钝和消失、巨大的中心暗点或视野向心缩小灯改变，偶伴有眼外肌麻痹。本病死亡率约50%，多因呼吸肌麻痹或因继发肺及泌尿系统的感染死亡。但目前对这一疾病的检测多依赖于临床诊断，准确率受到主诊医生水平影响极大。水通道蛋白4(aquaporin_4, AQP-4)属于介导水跨膜转运的水通道蛋白家族成员之一，以极化形式集中分布于中枢神经系统脑毛细血管周边的星形胶质细胞足突或室管膜细胞表面。研究认为，AQP-4广泛存在于蛛网膜下腔、血管周围的胶质细胞、室管膜细胞以及渗透压感受器官，其可调节脑脊液及细胞液体积的功能。Kiening等研究发现，脑缺血72小时后AQP-4的表达与脑水肿成正比上升，而在AQP-4基因敲除鼠模型中脑水肿明显减轻。以上研究表明，AQP-4在脑组织水代谢调节中起关键作用，且参与了视神经脊髓炎的发病过程。最近研究表明，在视神经脊髓炎患者的血清中存在AQP-4的自身抗体，而在多发性硬铭症患者血清中则没有。2006年国际NMO诊断标准将抗AQP-4抗体的检测作为诊断NMO的核心支持条件后，对临床早期确诊ΝΜ0，以及和其它脱髓鞘疾病的鉴别诊断具有非常重要的临床指导意义。在运用15个氨基酸的多肽叠加依次进行AQP-4蛋白的免疫原性分析发现，AQP-4不同的肽段对T细胞的免疫原性不同，其中N端胞内区的22-36氨基酸，跨膜区的82-108/211-225/235-249氨基酸，胞外的139-153和C端胞内区的289-306氨基酸均具有较强的T细胞免疫原性。1983年建立的酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot,ELISpot)技术具有高度的敏感性和应用的广泛性，已成为免疫检测抗原特异性免疫反应的重要检测手段之一。本发明即是结合AQP-4抗原结构特点，构建出NMO效应T细胞特异的抗原多肽，利用ELISpot方法对NMO疾病进行诊断。
发明内容
本发明的目的是针对人AQP-4抗原结构的特点，把其免疫原性强的多肽片段(氨基酸23-36和135-155)连接成全新的氨基酸序列，形成多肽抗原，组成ELISpot诊断试剂盒，用于检测视神经脊髓炎患者外周血中分泌的特异性IL-4的T细胞，提高视神经脊髓炎检测的灵敏度和特异性，辅助视神经脊髓炎的诊断和鉴别诊断。
本发明的技术方案是一种可以用于视神经脊髓炎ELISpot法诊断的多肽片段，其氨基酸序列如下IMvAFKGVWTQAFWKCLVTP PSVVGGLGVTMVHGNLT。本发明的另一目的是提供视神经脊髓炎ELISpot诊断试剂盒，其中含有ELISpot检测板、IL-4捕获抗体、AQP-4多肽、生物素标记的IL-4检测抗体、亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸。下面将结合
和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
图I、本图是实施例的检测图谱示例图。实施例共分为3组，分别为健康人群对照组(Control组)、多发性硬化症疾病对照组(MS组)和视神经脊髓炎组(ΝΜ0组)。其中，A列为阴性对照孔，B列为多肽检测孔孔，C列为阳性对照孔。从图中可以看出，本发明涉及的多妝在本实施例中完全可以用于NMO疾病的诊断和鉴别诊断。 图2、本图为实施例检测结果的统计图。从图中可以看出，在20例NMO患者中使用本专利的检出17例，检出率为85% .
具体实施例方式运用本发明，对20例健康对照人群(Control组)、20例疾病对照人群(多发性硬化患者，MS组)和20例视神经脊髓炎患者(ΝΜ0组)进行鉴别诊断，从而初步判断本发明在视神经脊髓炎诊断中的特异性和敏感性，从而判断其临床意义。具体步骤如下(一)包被ELISpot滤膜板中加入I : 500倍稀释的IL-4捕获抗体，IOOul/孔，4°C过夜后，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，3min/次；每孔加入含5 %牛血清白蛋白的PBS，37 °C孵育2h，密封后，置4°C保存，I周内使用(二)检测取患者或健康人外周抗凝血4_5ml，常温保存，在6h内检测；在无菌操作条件下，用1640培养基按照I : I体积比稀释血液，混匀后加到I倍体积的淋巴细胞分离液表面，形成明显的界面，在室温下lOOOg，离心22min ；用无菌吸管，吸取分离层的外周血单个核细胞(PBMC)置一无菌离心管中，加入8ml无血清1640培养基,700g,离心7min ； 弃去上清培养基，加入6ml含有10 %小牛血清的1640培养基重悬细胞后，300g,离心 5min ；弃去上清后，加入500ul含有10%小牛血清的1640培养基，取IOul细胞悬液，力口A40ul台酚蓝混匀后，取IOul于血球计数板，在显微镜下计数，用1640完全培养基稀释细胞至5 X 106细胞/ml ；在上述包被的ELISpot孔中分别加入下列试剂50ul培养基(阴性对照)、50ull 1000的CD3抗体(阳性对照)、50ul50ug/ml的多肽(检测孔)；每孔加入IOOul的细胞悬液后，放入37°C，5% C02培养箱培养20小时；弃去培养基，用200 μ I的PBS洗涤5次；
每孔加入100 μ I的I : 300稀释的生物素标记的抗IL_4检测抗体，在室温下孵育2h后,每孔加入200 μ I的PBS洗漆5次；每孔中加入100 μ I用PBS稀释的I : 1000亲和素-碱性磷酸酶结合物,室温下反应30min后，用PBS洗5次，每次3min ；每孔加入100 μ I底物溶液氮蓝四唑和5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸，室温闭关放置15min，直到斑点出现，用自来水洗涤终止后晾干，检查斑点数，统计分析。结果判定如果阴性孔斑点素为0-5个斑点，检测孔斑点素减去阴性对照孔斑点数> 6判定为阳性；如果阴性对照孔斑点数> 6个斑点，测试孔斑点数必须> 2倍的阴性对照孔斑点数才判定为阳性。(三)结果根据上述判断，所有检测结果均可以判断其阴性或阳性结果(图1，图2)，初步认为运用本发明对于视神经脊髓炎诊断的特异性为95%，敏感性为85%。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限范围。
权利要求
1.一种视神经脊髓炎效应T细胞特异的多肽片段，其特征是对水通道蛋白4的氨基酸序列进行组合重排后得到，具有如下所示的氨基酸序列IMVAFKGVWTQAFWKCLVTPPSVVGGLGVTMVHGNLT。
2.—种视神经脊髓炎的ELISpot检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求I所述的多肽片段作为刺激抗原，可通过检测该多肽特异的T细胞来对视神经脊髓炎进行诊断。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，公开了一种视神经脊髓炎(NMO)效应T细胞特异的抗原多肽及NMO的诊断方法与运用。特征是通过对水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP-4)结构的拓扑构像分析，得出NMO效应T细胞特异的多肽片段，随后对相关多肽组合重排后的结构分析，筛选出能用于NMO疾病诊断的全新肽段。在ELISpot实验中，利用得到的肽段通过刺激NMO疾病中的效应T细胞分泌IL-4证实了该肽段在NMO疾病诊断中的可行性和科学价值。该方法特异性强，灵敏度高，操作简便，可发展成为诊断试剂盒用于临床检测NMO的诊断和鉴别诊断，为通过NMO的早期发现和治疗奠定了基础。
文档编号G01N33/543GK102898513SQ20121042603
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者徐俊, 赵树立, 程欣欣, 时建铨, 朱银伟, 张颖冬, 洪音 申请人:徐俊