专利名称：一种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物纳米材料及技术领域，尤其涉及一种简单有效的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒及其制备方法。
背景技术：
近年来,普鲁士蓝纳米颗粒(Prussian blue nanoparticles, PBNPs)在模拟酶领域受到了广泛的关注，由于具备较低的氧化还原电位和良好的电子转移能力，PBNPs被认为是一种高性能的人工模拟酶。 铁蛋白(ferritin)是一种由24个亚基自组装形成的直径为12nm的球形蛋白，内腔直径8nm左右,储存着铁的水合氧化物纳米颗粒。它是一种天然的纳米结构，具有特殊的生物功能。虽然人类、马、牛蛙和细菌等的铁蛋白在一级结构上有很大的差异，但是本质上它们拥有相同的体系结构，所以其他机体的铁蛋白应该和人类的铁蛋白具有相同的功能。研究发现，很多肿瘤细胞表面大量表达铁蛋白特异性受体，从而通过铁蛋白受体一铁蛋白的结合介导对铁蛋白的内吞作用。有报道指出，重链铁蛋白(HFt)的受体是转铁蛋白受体I(Transferrin receptor-1,TfRl),在肿瘤组织中，TfRl的表达量远远高于健康组织及癌周组织，这保证了肿瘤组织对铁的摄取，对肿瘤的发生、发展及代谢具有重要意义。各种天然的铁蛋白(含铁)和重组铁蛋白(无铁)已经被使用作为模板来合成各种纳米颗粒，如磁性Fe3O4纳米颗粒、半导体CdS量子点、Au原子团簇、CoPt合金纳米颗粒,等等。制备方法一般先要通过还原溶解方法去除天然的铁蛋白内的氧化铁核，或直接利用空的重组铁蛋白壳作为模板。目前主要的合成途径有两种(1)铁蛋白加载途径；(2)铁蛋白分解-组装途径。途径I是将一种反应物通过扩散填充入铁蛋白壳内，去除游离的反应物后，再加入另外一种反应物进行反应，从而在蛋白壳内形成纳米颗粒；多次重复上述步骤以增大蛋白壳内颗粒的尺寸，以满足需要；最后进行纯化除去游离的剩余反应物。途径2在铁蛋白内填充反应物的方法是，将铁蛋白壳在酸性条件下解聚，使24个亚基分散，并与反应物混合，通过调节PH到7. 5^8. 5再使24个亚基重新组装成铁蛋白，同时将反应物包含到蛋白壳内，然后按照前一种方法与另外一种反应物反应。这种方法更适合于填充较大的反应物。上述两种方法较为复杂，都需要利用重组的空腔铁蛋白或先将天然铁蛋白的内核去除，还需要不断地交替进行反应物之间的反应以达到所需的纳米颗粒尺寸，其中第二种方法借助铁蛋白在低PH下解聚来实现反应物的填充，填充量有限，因此制备方法效率低，难以放大生产，并造成获得的最终产物稳定性较差，尺寸难于控制，生物表面活性受到影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供产物稳定、尺寸均一且活性好的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒，并进一步提供一种过程简单的制备方法和用途。为实现上述目的，本发明可采用的技术方案是
—种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒,亚铁氰化钾穿过铁蛋白表面的蛋白质亚基之间的通道并与铁蛋白内核表面的三价铁离子反应生成普鲁士蓝，随后所述普鲁士蓝附着于该内核表面形成。在优选地实施例中，所述普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的等电点为4飞，外周尺寸为10-12纳米。本发明进一步提供了一种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，它包括以下步骤，步骤一、取一定量的铁蛋白，用ρΗ=2. (Γ4. 5的酸性溶液稀释并混合均匀，得到铁蛋白溶液；取一定量的亚铁氰化钾，用PH=L 5^4. 5的酸性溶液稀释并混合均匀，得到亚铁氰化钾溶液；在该步骤中，制取铁蛋白溶液或亚铁氰化钾溶液的顺序是任意的；步骤二、取一定体积的所述亚铁氰化钾溶液加入到一定体积的所述铁蛋白溶液中或取一定体积的所述铁蛋白溶液加入到所述亚铁氰化钾溶液中，混合均匀，在l°c 70°C之 间的某一温度下进行恒温反应，其中，在混合后的溶液中，以铁元素的浓度计，亚铁氰化钾与铁蛋白的摩尔比为O. 5^1. 25 ；步骤三、在反应1(Γ30小时之后，取出溶液，在pH = 2. (Γ4. 5的酸性溶液中用透析袋进行透析，每隔4 10小时更换一次溶液，透析2飞次；步骤四、取出透析过的溶液，用离心机500(Tl0000r/min的速度离心5 20min,将
得到的最终溶液，放置在恒温容器中保存，所述恒温容器的温度设定为TC至10°C之间的
某一温度O优选地，在所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法中在所述步骤二中，将混合后的溶液在l°c至13°c之间的某一温度下进行恒温反应。优选地，在所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法中在所述步骤二中，将混合后的溶液在4±0. 5 °C之间的某一温度下进行恒温反应。优选地，在所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法中在所述步骤一或步骤三中，所述酸性溶液的pH = 3±0. I。优选地，在所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法中在所述步骤五中，将最终溶液放置在恒温容器中保存，恒温容器的温度设定为3°C 4. 5°C之间的某一温度。优选地，在所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法中所述铁蛋白为马脾铁蛋白。优选地，在所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法中在步骤二中，以铁元素的浓度计，亚铁氰化钾与铁蛋白的摩尔比为O. 75^1. O。本发明所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒在制备诊断肿瘤药剂中的应用。
本发明所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法简单有效，得到的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒尺寸小(10-12nm)、单分散，以蓝色透明水溶液形式保存，稳定性好；得到的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒具有高的类过氧化物酶活性，可催化常用的过氧化物酶底物反应，该纳米颗粒具有铁蛋白的表面特性和好的生物相容性，表面易于修饰和功能化。应当认识到，本发明以上各方面中的特征可以在本发明的范围内自由组合，而并不受其顺序的限制一只要组合后的技术方案落在本发明的实质精神内。
下面将结合附图及实施例对本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒及制备方法作进一步说明，附图中图Ia是铁蛋白纳米颗粒的结构示意图。图Ib是本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的结构示意图。图2a是本发明的未染色的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的透射电镜照片图2b是本发明普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的高分辨率的TEM图；
图2c是本发明的用2%磷钨酸负染的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的电镜照片;图3是本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图。图4a是本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒催化TMB的类过氧化物酶活性图；图4b是本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒催化ABTS的类过氧化物酶活性图；图5a是本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒在底物为TMB时的类过氧化物酶活性和PH的关系图；图5b是本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒在底物为ABTS时的类过氧化物酶活性和PH的关系图；图5c是本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒类过氧化物酶活性随温度的变化关系图；图5d是本发明的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒类过氧化物酶活性随自身浓度的变化关系图；图6是本发明的在不同pH条件下合成的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；图7a至7d是不同亚铁氰化钾/马脾铁蛋白以铁浓度计摩尔比条件下合成普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的透射电镜照片，其中，图7a至图7d的亚铁氰化钾/马脾铁蛋白摩尔比(以铁元素浓度计)分别为O. 5,0. 75，I. O, I. 25 ；图8是本发明在不同亚铁氰化钾/马脾铁蛋白摩尔比(以铁元素浓度计)条件下合成普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的紫外可见吸收光谱。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读本发明之后，本领域的技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请的权利要求所限定的范围。如图Ia和图Ib所示，是铁蛋白颗粒和经普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的结构不意图。图Ia是反应之如的铁蛋白颗粒2的结构不意图，在该图中，铁蛋白内核21被亚基22包裹。图Ib显示的是获得的铁蛋白颗粒1，从中可见普鲁士蓝颗粒3沉淀在铁蛋白内核11上，亚基12环绕在内核周围。以铁蛋白为合成模板，通过在酸性条件下亚铁氰化钾通过蛋白亚基之间的孔道在铁蛋白内核氧化铁颗粒上的沉积(附着)，实现单分散的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米结构制备。在这里，沉积或附着表示普鲁士蓝和铁蛋白内核之间的位置关系，两者之间通过物理的作用(包括疏水、亲水作用，以及分子之间的其他作用)和化学的作用(化学键，包括配位键、离子键)结合。通过上述物理、化学作用力使亚铁氰化钾与铁蛋白内核形成的普鲁士蓝和铁蛋白内核形成一种特定的结构和位置关系。转到图2a至图2c，为普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的透射电镜照片。其中2a图为未染色的PB-Ft (普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒)，从中可以看到普鲁士蓝修饰的内核氧化铁颗粒，平均尺寸约为7nm ;图2b为高分辨TEM (透射电镜)图，可以看到经过修饰后的不完整内核晶格结构；图2c为用2%磷钨酸负染的PB-Ft纳米颗粒，可以清楚地观察到铁蛋白的完整蛋白质外壳。接着描述图3，是普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图。马脾铁蛋白(HoSF)在280nm处有蛋白质的特征吸收峰，而PB-Ft纳米颗粒在280nm处有蛋白质的特征吸收峰，且在710nm左右有普鲁士蓝特征吸收峰。 转到图4a至图4b，是普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒催化不同的过氧化物酶底物时的类过氧化物酶活性测量结果。图4a中，以TMB为显色底物，对照组和HoSF组几乎未显示颜色变化，而PB-Ft纳米颗粒组在IOmin内有明显的吸光度的上升,说明PB-Ft纳米颗粒可以有效地催化H2O2氧化底物TMB显色。图4b中以ABTS为显色底物，对照组几乎没有发生颜色变化，HoSF组有较弱的吸光度上升，而PB-Ft纳米颗粒组在IOmin内有明显的吸光度的上升，说明PB-Ft纳米颗粒可以有效地催化H2O2氧化底物ABTS显色。其中，TMB为3，3’，5，5’ -四甲基联苯，ABTS为2，2’ - 二氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，二者均为过氧化物酶显色底物。转到图5a至图5d，分别是普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒类过氧化物酶活性的随pH、温度和自身浓度的测量结果关系图。从图5a和图5b中可见PB-Ft纳米颗粒的催化活性表现了较强的PH依赖性。当以TMB为底物时，PB-Ft纳米颗粒的催化活性在pH为3时最大，PH小于2或大于4时，催化活性很低，当pH大于4时，催化活性均处于一个较低的水平。在图5b中可见，当底物为ABST时，PB-Ft纳米颗粒的催化活性随着pH的升高急剧下降，当pH大于4时,反应活性一直处于较低的水平。从图5c中可见,PB-Ft纳米颗粒的催化活性随着温度的升高不断提高，到60°C左右达到最高，随后反应活性稍有下降。从图5d中可见PB-Ft纳米颗粒的催化活性与PB-Ft纳米颗粒的浓度从I μ g/mL升高至7 μ g/mL范围内呈线性相关，其催化底物发生显色反应的吸光度变化满足线性方程y=0. 0796x+0. 3727，其中 R2=O. 9896。图6是本发明的在不同pH条件(线条61、62和63所示)下合成的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；从图中可知，PB-Ft纳米颗粒在280nm处和700nm处有特征吸收峰。转到图7a至7d，是不同亚铁氰化钾/马脾铁蛋白以铁浓度计摩尔比条件下合成普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的透射电镜照片，其中，图7a至图7d的亚铁氰化钾/马脾铁蛋白摩尔比(以铁元素浓度计)分别为O. 5,0. 75，I. O, I. 25。从照片中可见，随着亚铁氰化钾的浓度比例的不断增加，铁蛋白内核中的普鲁士蓝颗粒的沉积量也不断提高，到1.0时基本达到饱和。实验发现亚铁氰化钾/马脾铁蛋白以铁元素浓度计的摩尔比O. 5^1. 25为适宜的反应范围，亚铁氰化钾/马脾铁蛋白以铁浓度计的摩尔比低于O. 5生成的普鲁士蓝过少从而类酶活性过低，亚铁氰化钾/马脾铁蛋白以铁浓度计的摩尔比高于I. 25则有较多游离的普鲁士蓝生成，影响产品的纯度。结果表明在上述条件下均可获得形貌完好、尺寸均一的纳米颗粒。最后描述图8，是不同亚铁氰化钾/马脾铁蛋白以铁浓度计摩尔比为O. 5,0. 75、I. O、I. 25 (分别无81-84线条所示)条件下合成的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的紫外可见吸收光谱。随着铁氰化钾/马脾铁蛋白摩尔比的增高，普鲁士蓝在710nm处吸收值增高，说明修饰上去的普鲁士蓝增多。实施例I一种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备流程先取940 μ g马脾铁蛋白，用20mLpH 3. O的HCl溶液稀释，摇晃使得其充分混合(Fe3+的浓度约为I. 8mM);再称取190mg 亚铁氰化钾，用pH=3. O的盐酸溶液定容到250mL (亚铁氰化钾浓度约为I. 8mM)，取150μ L加入到第一步的马脾铁蛋白溶液中，充分混合。该溶液中，以铁元素浓度计，亚铁氰化钾/马脾铁蛋白摩尔比为O. 75 ;将上述溶液充分混合之后转入到4°C冰箱中过夜反应；24小时之后，取出反应溶液，用规格13K的透析袋在pH 3. O的HCl溶液中进行透析，7小时换一次溶液，透析4遍；取出透析完的溶液,用离心机7000r/min的速度离心15min以去除可能沉淀的一些聚集体，所得到的蓝色透亮溶液即普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒，放置在4°C冰箱中保存。实施例2-8一种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备流程，如下所示改变反应pH条件，实施例2-8中的pH值分别为2. O、2. 5、2. 8、2. 9、3. O、3. I、3. 2、3. 5进行制备，具体如下先取940 μ g 马脾铁蛋白，分别用 20mL 的 ρΗ=2· 0、2· 5、2· 8、2· 9、3· 1、3· 2、3· 5 的HCl溶液稀释，摇晃使得其充分混合(Fe3+的浓度约为I. 8mM);再称取190mg亚铁氰化钾，分别用ρΗ=2. 0、2· 5、2· 8、2· 9、3· 1、3· 2、3· 5的盐酸溶液定容到250mL (亚铁氰化钾浓度约为1.8mM)，取150 μ L加入到第一步的马脾铁蛋白溶液中，充分混合。该溶液中亚铁氰化钾/马脾铁蛋白以铁浓度计摩尔比为O. 75 ;将上述溶液充分混合之后转入到4°C冰箱中过夜反应；24小时之后，取出反应溶液，用规格13K的透析袋在pH 3. O的HCl溶液中进行透析，7小时换一次溶液，透析4遍；取出透析完的溶液，用离心机7000r/min的速度离心15min以去除可能沉淀的一些聚集体。实验中所述pH=2. 9^3. I为适宜的反应范围，pH低于2. 9生成的产物稳定性较差，PH高于3. I则无蓝色普鲁士蓝生成。实施例9-16一种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备流程，如下所示实施例9-16中的亚铁氰化钾/马脾铁蛋白的摩尔比(以铁元素的浓度计)分别为 O. 25、0· 5、0· 75、1· 0、1· 25、1· 5、1· 75、2· O。制备过程为先取 940 μ g 马脾铁蛋白，用20mLpH=3. O的HCl溶液稀释，摇晃使得其充分混合(Fe3+的浓度约为I. 8mM);再称取190mg亚铁氰化钾，用pH=3. O的盐酸溶液定容到250mL (亚铁氰化钾浓度约为I. 8mM),分别取 50μ L、100y L、150y L、200y L、250y L、300y L、350y L、400y L 加入到第一步的马脾铁蛋白溶液中，充分混合。该溶液中亚铁氰化钾/马脾铁蛋白以铁元素浓度计摩尔比分别为O. 25,0. 5,0. 75、I. O、I. 25、I. 5、I. 75,2. O ;将上述溶液充分混合之后转入到4°C冰箱中过夜反应；24小时之后，取出反应溶液，用规格13K的透析袋在pH 3. O的HCl溶液中进行透析，7小时换一次溶液，透析4遍；取出透析完的溶液，用离心机7000r/min的速度离心15min以去除可能沉淀的一些聚集体。实施例17-22先取940 μ g马脾铁蛋白，用20mLpH 3. O的HCl溶液稀释，摇晃使得其充分混合(Fe3+的浓度约为I. 8mM);再称取190mg亚铁氰化钾，用pH=3. O的盐酸溶液定容到250mL(亚铁氰化钾浓度约为I. 8mM)，取150 μ L加入到第一步的马脾铁蛋白溶液中，充分混合。该溶液中，以铁元素浓度计，亚铁氰化钾/马脾铁蛋白摩尔比约为O. 75 ;将上述溶液充分混合之后转入到2°〇、31、41、81、131、371、601和70°C的恒温容器中反应；24小时之后，取出反应溶液，用规格13K的透析袋在pH 3. O的HCl溶液中进行透析，7小时换一次溶液，透析 4遍；取出透析完的溶液，用离心机7000r/min的速度离心15min以去除可能沉淀的一些聚集体，所得到的蓝色透亮溶液即普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒，放置在4°C冰箱中保存。需要说明的是，在上述实施例1-16中，技术人员可以根据实际需要改变某些参数，例如马脾铁蛋白和亚铁氰化钾的重量、酸性溶液的体积，以及马脾铁蛋白和亚铁氰化钾的浓度，实质上只需要调节亚铁氰化钾/马脾铁蛋白的摩尔比在一定的范围即可，其中亚铁氰化钾/马脾铁蛋白的摩尔比是以铁元素浓度计的，即混合后的溶液中亚铁氰化钾的铁元素和铁蛋白中的铁元素的浓度比。另外，技术人员还可以根据上述实施例对透析和离心的条件进行优化。需要注意的是，离心速度不能过高，以防止修饰后的铁蛋白被沉淀而分离出去。技术人员还可以选择其他动物的铁蛋白进行上述实验，本发明采用马脾铁蛋白具有原料来源广、成本较低的优点。在上述实施例中，采用盐酸来产生酸性溶液，在其他实施例中，技术人员也可以采用硝酸、硫酸等有机酸或醋酸等无机酸来实现。上述普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒可以用来制备用于肿瘤诊断的药物，例如用作肿瘤组织免疫组织化学(IHC)检测的探针。经试验验证上述探针对食管癌、胃癌和乳腺癌的灵敏度可以达到96%以上。表I是普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的米氏动力学参数测量结果。Fe3O4纳米粒子是当前研究得较多的一种纳米粒子模拟酶，平均粒径也在IOnm左右。PB-Ft纳米颗粒的kcat值比Fe3O4高两个数量级，说明PB-Ft纳米颗粒的催化能力比Fe3O4纳米粒子强得多。
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发明人发展了一种新的基于天然铁蛋白模板的合成方法，无需去除内部氧化铁核，而是利用亚铁氰化钾在氧化铁核表面的沉积反应，进行有效普鲁士蓝修饰和功能实现，巧妙地将普鲁士蓝的高的类过氧化物酶活性和铁蛋白本身的生物特性结合起来，从而实现单分散和生物相容性纳米颗粒的制备，并克服了无法直接将普鲁士蓝颗粒沉淀在 铁蛋白内核中的技术难点。通过铁蛋白模板法来合成普鲁士蓝纳米颗粒，一方面由于粒子比较小，具有很大的比表面积，有望得到较高的酶活性，另一方面复合物可以具备铁蛋白的蛋白质活性，且和机体具有很好相容性，有望得到更广的生物应用范围。
权利要求
1.一种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒，其特征在于，亚铁氰化钾穿过铁蛋白表面的蛋白质亚基之间的通道并与铁蛋白内核表面的三价铁离子反应生成普鲁士蓝，随后所述普鲁士蓝附着于该铁蛋白内核表面形成。
2.根据权利要求I所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的等电点为4飞，外周尺寸为1(T12纳米。
3.—种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤， 步骤一、取一定量的铁蛋白，用pH=2. (T4. 5的酸性溶液稀释并混合均匀，得到铁蛋白溶液；取一定量的亚铁氰化钾，用PH=L 5^4. 5的酸性溶液稀释并混合均匀，得到亚铁氰化钾溶液； 步骤二、取一定体积的所述亚铁氰化钾溶液加入到一定体积的所述铁蛋白溶液中或取一定体积的所述铁蛋白溶液加入到所述亚铁氰化钾溶液中，混合均匀，在1°C 70°C之间的某一温度下进行恒温反应，其中，在混合后的溶液中，以铁元素的浓度计，亚铁氰化钾与铁蛋白的摩尔比为0. 5^1.25 ； 步骤三、在反应1(T30小时之后，取出溶液，在pH = 2. (T4. 5的酸性溶液中用透析袋进行透析，每隔4 10小时更换一次溶液，透析2飞次； 步骤四、取出透析过的溶液，用离心机500(Tl0000r/min的速度离心5 20min,将得到的最终溶液，放置在恒温容器中保存，所述恒温容器的温度设定为TC至10°C之间的某一温度。
4.根据权利要求3所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤二中，将混合后的溶液在1°C至13°C之间的某一温度下进行恒温反应。
5.根据权利要求3所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤二中，将混合后的溶液在4±0. 5 °C之间的某一温度下进行恒温反应。
6.根据权利要求3至5任一项所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤一或步骤三中，所述酸性溶液的pH = 3±0. I。
7.根据权利要求3至5任一项所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤五中，将最终溶液放置在恒温容器中保存，恒温容器的温度设定为3 0C 4.5 °C之间的某一温度。
8.根据权利要求3至5任一项所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述铁蛋白为马脾铁蛋白。
9.根据权利要求3至5任一项所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤二中，以铁元素的浓度计，亚铁氰化钾与铁蛋白的摩尔比为0. 75^1. O。
10.权利要求I所述的普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒在制备诊断肿瘤药剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种普鲁士蓝修饰的铁蛋白纳米颗粒及其制备方法，它由亚铁氰化钾穿过铁蛋白表面的蛋白质亚基之间的通道并与铁蛋白内核表面的三价铁离子反应，随后附着于该内核表面形成。该铁蛋白纳米颗粒的制备方法包括如下步骤制备铁蛋白和亚铁氰化钾的溶液，将上述溶液混合，并在一定条件下反应，经透析、离心后，获得最终产品。本发明的铁蛋白纳米颗粒具有尺寸小，稳定性好和生物活性高的优点。
文档编号G01N33/574GK102964445SQ201210444339
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者张宇, 张薇, 马明, 顾宁, 王建国 申请人:东南大学, 南京东纳生物科技有限公司