专利名称：一种测定液中淀粉样前体蛋白的方法
技术领域：
本发明属于血液中蛋白测定技术领域，尤其涉及一种测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法。
背景技术：
生物标志物是一种生化过程的指示物，它可以是一种生化改变、某种遗传特性或者用影像学手段检测出的结构和功能上的变化，其所提供的信息在疾病预测、早期诊断、预后判断、药效评价、病程监测等方面具有重要的价值。利用目前存在的AD的生物标志物来检测AD，通常对身体都有一定的损伤，需要检测的目的标志物较多，操作繁琐，特异性和敏感度不够高，成本较高，而且现有的生物标志物还不能够鉴定那些具有潜在病理的将要发展为AD的患者。 中山大学基础临床教研室曾做过AD病人血液中APP基因mRNA测定比较方面的工作，mRNA表达成蛋白质还需要经过翻译，翻译后加工等步骤才能成为最终的产品一蛋白质。国外有个实验室曾研究了血小板中APP蛋白的表达，但其血小板的分离方法较为繁琐，最后还需比较不同种类的APP的亚型的比例，结果不是非常直观可靠。另有一个实验室也分析了血细胞中白细胞表达APP蛋白的情况，同样是分离步骤烦琐，结果不够直观明确。
发明内容
为了解决这个问题，本方案发明了一种测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法。血液的抗凝处理，血细胞的分离，细胞蛋白的提取方法，正确的蛋白定量的方法，以及这几种方法的组合，产生了可以测定血液中表达的APP(N-端)的方法；所用的检测抗体为美国公司生产的APP (N-端)抗体。本发明实施例是这样实现的，一种测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法，该方法包括以下步骤从常规手臂静脉抽血2_3ml至无菌的I : 9的枸橼酸钠抗凝管，后置_20°C冰箱保存；测定时，取Iml血液，IOOOOg离心3分钟，小心移去上清，保留沉淀物待用；细胞沉淀物加120ul蛋白抽提液，漩涡混合，置于冰上静止20min，12000g离心3
分钟，取上清；进行Western免疫印迹实验，并观察结果，病情的严重程度与条带的浓淡成正比。进一步，Western免疫印迹实验的方法,该方法包括200ug蛋白进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，以蛋白电泳转移仪将产物转至PVDF膜上，室温下封闭2h;TBST溶液漂洗PVDF膜两遍；加入兔抗APP (N-端)的一抗缓冲液，室温孵育Ih ；移去一抗，用TBST溶液洗涤3次；加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗缓冲液，室温下孵育Ih ；
移去二抗缓冲液，TBST溶液洗涤3次；NBT/BCIP储存液显色试剂盒进行显色，扫描仪取像，以人P-actin蛋白作为内参。本发明提供的测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法，血液的抗凝处理，血细胞的分离，细胞蛋白的提取方法，正确的蛋白定量的方法，以及这几种方法的组合，产生了可以测定血液中表达的APP(N-端)的方法；所用的检测抗体为美国公司生产的APP(N-端)抗体，国内外目前尚无研究机构或个人用此抗体发表文章；用该发明方法可以简便，快速，无创伤，低费用地判定是否得了早老性痴呆，结果显著，与对照相比条带明显，极易判断，同样的方法与结果国内外尚无报道，处于国际相关领域的领先水平。本方案使鉴别AD和非AD的方法变得简单，经济可靠，检测方便，操作相对简单，能够较快速的获得实验结果，实验结果明了，便于分析；取材容易，仅通过常规手臂静脉抽血，对身体几乎没有创伤；提高了鉴别AD和非AD的方法的特异性和敏感度；有利于深入开展新的AD血液生物标记物的研究。
图I是本发明实施例提供的测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法的流程图；图2是本发明实施例提供的Western免疫印迹实验流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。图I示出了本发明实施案例提供的测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法，该方法包括在步骤SlOl中，病人及正常人常规手臂静脉抽血2_3ml至无菌的I : 9的枸橼酸钠抗凝管，后置-20°C冰箱保存；在步骤S102中，测定时，取Iml血液，IOOOOg离心3分钟，小心移去上清，保留沉淀物待用；在步骤S103中，细胞沉淀物加120ul蛋白抽提液，漩涡混合，至于冰上静止20min，12000g离心3分钟，取上清；在步骤S104中，进行Western免疫印迹实验，并观察结果，病情的严重程度与条带的浓淡成正比。图2示出了本发明实施案例提供的做Western免疫印迹实验的方法，该方法包括在步骤S1041中，200ug蛋白进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，以蛋白电泳转移仪将产物转至PVDF膜上，室温下封闭2h ；在步骤S1042中，TBST溶液漂洗PVDF膜两遍；加入兔抗APP (N-端)的一抗缓冲液，室温孵育Ih ；在步骤S1043中，移去一抗，用TBST溶液洗涤3次；加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗缓冲液，室温下孵育Ih;
在步骤S1044中，移去二抗缓冲液，TBST溶液洗涤3次；在步骤S1045中，NBT/BCIP储存液显色试剂盒进行显色，扫描仪取像，以人& -actin蛋白作为内参。在病人及正常人常规手臂静脉抽血2_3ml至无菌的I : 9的枸橼酸钠抗凝管，后置-200C冰箱保存；测定时，取Iml血液，IOOOOg离心3分钟，小心移去上清，保留沉淀物待用；细胞沉淀物加120ul蛋白抽提液，漩涡混合，至于冰上静止20min，12000g离心3分钟，取上清；进行Western免疫印迹实验，并观察结果，病情的严重程度与条带的浓淡成正比。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 从手臂静脉抽血2-3ml至无菌的I : 9的枸橼酸钠抗凝管，后置-20°C冰箱保存； 测定时，取Iml血液，IOOOOg离心3分钟，小心移去上清，保留沉淀物待用； 细胞沉淀物加120ul蛋白抽提液，漩涡混合，置于冰上静止20min，12000g离心3分钟，取上清； 进行Western免疫印迹实验，并观察结果，病情的严重程度与条带的浓淡成正比。
2.如权利要求I所述的测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法，其特征在于，Western免疫印迹实验的方法,该方法包括 200ug蛋白进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，以蛋白电泳转移仪将产物转至PVDF膜上，室温下封闭2h ； TBST溶液漂洗PVDF膜两遍；加入兔抗APP (N-端)的一抗缓冲液，室温孵育Ih ； 移去一抗，用TBST溶液洗涤3次；加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗缓冲液，室温下孵育Ih; 移去二抗缓冲液，TBST溶液洗涤3次； NBT/BCIP储存液显色试剂盒进行显色，扫描仪取像，以人β -actin蛋白作为内参。
全文摘要
本发明公开了一种测定血液中淀粉样前体蛋白(APP)的方法，首先手臂静脉抽血2-3ml至无菌的1∶9的枸橼酸钠抗凝管，后置-20℃冰箱保存；测定时，取1ml血液，10000g离心3分钟，小心移去上清，保留沉淀物待用；细胞沉淀物加120ul蛋白抽提液，漩涡混合，置于冰上静止20min，12000g离心3分钟，取上清；进行Western免疫印迹实验，并观察结果。本方法使鉴别AD和非AD的方法变得简单，经济可靠，检测方便，操作相对简单，能够较快速的获得实验结果，实验结果明了，便于分析；取材容易，仅通过常规手臂静脉抽血，对身体几乎没有创伤；提高了鉴别AD和非AD的方法的特异性和敏感度；有利于进一步深入开展新的AD血液生物标记物的研究。
文档编号G01N21/78GK102967711SQ20121044870
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者吴金美, 李锡海, 王雪芳, 于明, 赵康仁, 钱进军, 高琳, 夏海平 申请人:江苏科技大学