人血清淀粉样蛋白a检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种 人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 血清淀粉样蛋白A(serumamyloidAprotein，SAA)是一种急性时相反应蛋白， 属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12 000。在急性时相反应中，经IL-1、 IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度 的100-1000倍，但半衰期短，只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白A与高密度脂蛋白（HDL) 有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。血清淀粉样蛋白A-个特别重要的特性 是其降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾 病中这是一种严重的并发症。正常人血清SAA浓度平均值为2. 33mg/L，SAA浓度的测定对 于肾移植急性排异反应的诊断比血清Cr更为敏感，在排除感染的情况下，SAA的异常的升 高对肾移植急性排异反应具有很大的诊断价值。
[0003] 与C反应蛋白（CRP)类似，血清淀粉样蛋白A的含量浓度是反映感染性疾病早 期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是，血清淀粉样 蛋白A检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患 者）以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比C反应蛋白更确凿。研究发 现，在患炎性关节炎的案例中，血清淀粉样蛋白A与疾病活动性的关系最密切。同时检测 C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A能提高对感染的诊断灵敏度。对于淀粉样蛋白A淀粉样 变性患者，以将血清淀粉样蛋白A水平回复至正常为宗旨的治疗，能改善病情。
[0004] 现有的SAA检测方法主要是酶联免疫法，由于酶联免疫测定周期长，不能在自动 生化分析仪上使用，不适合急诊的快速检测，是SAA检测试剂盒普及的弊端，而胶乳增强免 疫比浊法操作简单，经济，可以在绝大多数医院的自动生化分析仪上使用，特别是急诊能实 现快速定量检测，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后， 形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物含 量。
[0005] 而血清淀粉样蛋白A抗体包被到胶乳上，一般可以采用物理吸附法和化学偶联 法，采用物理吸附法得到的致敏胶乳颗粒稳定性较化学偶联法要差，抗体容易从胶乳颗粒 上脱落下来；而且用物理吸附法得到的胶乳，有可能受到类风湿性因子（RF)和嗜异性抗 体的干扰，IgM、IgG型RF可以与包被在胶乳上的抗体的Fc段直接结合，从而导致检测结 果假阳性或假阴性升高。目前采用的化学偶联法多为随机偶联法，因随机偶联的抗体随机 偶联到抗体不同部位，将导致抗体损失结合力；所以，完全随机偶联会损失抗体大部分结合 力，增加了抗体用量和生产成本。同时，若将上述方法得到的致敏胶乳颗粒用于检测试剂盒 中，会造成特异性差、准确性低、抗干扰能力弱或生产成本高的缺陷。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗 干扰能力强及生产成本低的人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒。
[0007] 本发明的技术方案为：一种人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒， 所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2,所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是 用血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中。
[0008] 本发明上述试剂盒中R1和R2的容积比为4:1。
[0009] 本发明所述的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、 甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸 氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸（MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液 中的一种或几种。
[0010] 本发明上述试剂盒中R1所用的缓冲液与配置R2所用的缓冲液只要为上面的缓 冲液中的一种任意搭配均可。
[0011]本发明上面所述的聚苯乙烯胶乳颗粒（该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品）， 其平均粒径在0.01~1.5μm(10~1500nm)之间，粒径小于0.01μm时，胶乳颗粒聚 集产生的光密度变化太小，结果很难达到试验敏感度要求，在制备试剂的时候，需要花费 过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于 1. 5μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的光密度变化超过了检测限，结果 很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。 胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变。所选择的颗粒粒径最好是介于0.05~ 0·5μηι(50 ~500nm)之间。
[0012] 本发明上面所述的抗体包括但不限于多克隆抗体及单克隆抗体。
[0013] 本发明所述的试剂R2是用血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于 适当的缓冲液中组成，该试剂R2的制备步骤包括： (1) 胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒（胶乳）中加入乙基二甲基 胺丙基碳化二亚胺（EDAC)，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳 颗粒； (2) 抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基； (3) 抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤（1)激活的胶乳颗粒和步骤（2)氧化的抗体混 合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳 微球即血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适量的缓冲液中。 本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为：步骤（1)中乙基二甲基胺丙基碳化二 亚胺：胶乳（带有羧基的胶乳颗粒原料）=0.5~5 : 100 (重量比）；己二酸二酰 肼：胶乳（带有羧基的胶乳颗粒原料）=50~250 : 100 (重量比）；步骤（2)中高 碘酸钠：胶乳（带有羧基的胶乳颗粒原料）=0.5~3 : 100 (重量比）；步骤（3) 中抗体：激活的胶乳颗粒=2~22 : 100 (重量比），葡萄糖：激活的胶乳颗粒=(25 ~50) : 100。加入的是原料胶乳，可以改成抗体：胶乳，都是重量比。
[0014]本发明所述胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒， 与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物 形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，血清中的血清淀粉样蛋白A与结合在胶乳颗粒表面的抗血清淀粉样蛋白A抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗 粒形成聚集；在546nm，700nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出血清淀粉样蛋白A 的含量。
[0015] 本发明的优点和有益效果： 1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产 成本低的优点。
[0016] 2.本发明SAA试剂盒采用的检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法解决了市 场现有酶联免疫方法SAA试剂盒的急诊不适用性，使得S