具有抗雌激素功效的预测性生物标记物的测定的制作方法

具有抗雌激素功效的预测性生物标记物的测定的制作方法【专利摘要】本发明提供了与癌症中的抗雌激素敏感性相关的生物标记物、用于检测和定量所述生物标记物的方法以及用于治疗展现所述生物标记物的癌症患者的方法。所述生物标记物为在某些肿瘤细胞的核中发现的活化的雌激素受体聚集点(AEF)。所述方法提供了新信息来指导利用抗雌激素治疗患者的意图，从而允许选择可能对治疗作出反应的个别患者和患者群体。还提供了用于筛选抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物的AEF失活活性的方法。所述方法可用于鉴定其它AEF活性药物，包括抗雌激素，这些药物可以是用于根据本发明的方法治疗AEF阳性肿瘤的候选物。【专利说明】具有抗雌激素功效的预测性生物标记物的测定【
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】[0001]本发明涉及与癌症中的抗雌激素敏感性相关的生物标记物、用于检测和定量所述生物标记物的方法以及用于治疗展现所述生物标记物的癌症患者的方法。[0002]发明背景[0003]预后性和预测性生物标记物通常用于乳腺癌患者的临床管理，且其评估已经成为了强制性的治疗决策的基础。一种这样的生物标记物是雌激素受体（ER)，它是被雌激素活化以调控正常乳腺上皮细胞的生长和分化的核转录因子。雌激素还刺激表达ERa的肿瘤细胞的生长，且肿瘤中的ER表达对于乳腺癌患者来说是一个良好预后因素。然而，ERa表达也可高度预测对利用抗雌激素的治疗性干预的肿瘤敏感性。抗雌激素包括直接受体拮抗剂（例如它莫西芬（tamoxifen)和法唑德西（falzodex))和芳香酶抑制剂（例如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑（letrozole)和依西斯坦（exemestane))。在辅助情形中，抗雌激素代表了现可用于乳腺癌的最佳治疗。不幸的是，目前没有任何方法可用于精确预测所述辅助疗法针对特定患者的特定肿瘤的疗效，因为在复发之前无法辨别治疗失败。然而，已知在转移性情形中且当肿瘤表达ER时，这些癌症中仅50%对抗雌激素治疗起反应。这清楚地表明，尽管不存在受体预示着不存在效果，但仅表达ER的癌症子集将受益于抗雌激素治疗。[0004]在免疫组织化学测定中使用靶向受体的经标记抗体来评估肿瘤中的ERa表达，由此产生明显染色。典型地，利用直接显微镜可视化来评估福尔马林固定-石蜡包埋型肿瘤标本，且将经染色细胞的数目定量为总细胞的百分比。这种方法存在显著的阳性变化，且表达ERa的肿瘤可以含有几乎0到几乎100%的阳性细胞。尽管针对激素疗法的临床反应的可能性与ERa表达水平之间不存在实际相关性，但值得注意的是即使表达水平很低的肿瘤（例如1%至10%阳性细胞）也可能显示显著反应，而ERa阴性肿瘤基本上完全无反应。为此，一般使用1%阳性细胞这一临界值作为ERa阳性的界限。[0005]上述免疫组织化学测定仅提供对雌激素受体本身的定量。也就是说，这些测定不考虑该受体是否结合其在DNA中的配体，即雌激素受体元件（ERE)，或是否具有任何功能角色。因此，现有免疫组织化学测定不提供关于所检测的雌激素受体是否也被生物活化或转录活化的任何信息。同其它类固醇受体一样，雌激素受体主要存在于细胞核中。在不存在与ERE结合的情况下，雌激素受体被看作是免疫组织荧光测定中的扩散核染色。实验生物学中的学术研究已经报告了如雌激素受体等核受体在显微术可见的配体的存在下形成核聚集物或聚集点。这些亚核结构也可以称为斑点，且含有它们的核称为高斑点化的核。在配体结合后，受体移入亚核聚集物结构中以活化多种基因的转录。[0006]在观察雌激素受体聚集点的形成的研究中，最常用的方法采用以经绿色荧光蛋白（GFP)标记的ERa暂时性转染的细胞系。一种这样的市售测定为得自于ThermoScientific(BiolmageProducts，Lafayette,C0)的ERaRedistribuiion.K:Assay。这种测定是设计用来测定化合物调节核聚集点中的ERa累积的能力，其中使用GFP来监测位移。利用图像分析算法来检测并分析核聚集点，从而揭露经转染的雌激素受体受配体调控而移入亚核聚集点中。还使用免疫荧光检测了细胞系中的内源性受体的核分布，但很少有研究调查动物或人原生组织中的核受体分布。尽管这些类型的测定可用于阐明雌激素受体聚集点形成的可能的生物学机制，但这些测定不提供关于过程、雌激素受体聚集点形成如何发生或其在自然产生的癌症中与疾病的相关性的任何信息。对组织切片或细针穿刺抹片的免疫组织化学染色观测到的聚集点ER反应的报告实际上是癌组织中的不充分固定或染色异质性的假象。参见例如M.Nadji等，（2005)Am.J.Clin.Pathol.123:21-27。所述异质性癌组织的焦点染色可在低放大倍数下观测，且与亚核ER聚集点相反，不涉及特定分子结构。[0007]事实上，这一领域中的基本学术研究显示，可用模型系统不代表癌症的临床变化性。到2005年为止，已经开发了超过140种人乳腺癌细胞系，但其中仅约三分之一表达雌激素受体和/或雌激素受体。已经开发了约50种小鼠细胞系且仅少数表达雌激素受体或雌激素受体。相比之下，在临床情形中，75%的乳腺癌患者具有激素受体阳性肿瘤。这些统计资料说明体外模型系统在开发用于选择适用于个别乳腺癌患者的癌症治疗的改良型方法中的不适宜性。[0008]在自然产生的癌症中，在活化聚集点中与配体结合的ERa可能使数千个基因活化或失活。因此，已经建议可以通过开发可分析多基因预后性和预测性标签的测定来改良现用于鉴定ERa阳性乳腺癌患者和确定抗雌激素治疗是否适当的免疫组织化学测定。这种方法是基于以下假设：对激素疗法的反应在生物学上过于复杂而无法通过测量单一基因的表达（g卩，仅ERa的表达）来进行精确预测。（D.C.Allred，M〇dernPathology(2010)23,S52-S59)。然而，测定数千个基因以确定预测性型态或试图准确找出最相关的基因是一种高成本而又非常漫长的策略。另外，因为雌激素受体测定的目的主要在于确定哪些癌症可能对抗雌激素治疗有反应和哪些癌症无反应，所以个别基因的状态(即，被活化或受抑制）不可能与拮抗雌激素对癌症生物学的总体效应的临床目的有关。[0009]因此，需要改良型雌激素受体测定，包括ERα测定，所述测定可以更精确且更敏感地鉴定最可能对抗雌激素疗法起反应的乳腺癌患者。这样的测定更好地确定了哪些患者将受益于抗雌激素治疗。显然还需要提高鉴定雌激素受体阳性肿瘤的能力的方法，所述雌激素受体阳性肿瘤可能通过抗雌激素疗法而被最准确地靶向。更好地靶向有助于避免不必要的治疗且有助于开发更贴切的治疗策略。举例来说，如果事先知道抗雌激素在特定肿瘤中（确切地说，在依据常规方法得知的ERa阳性肿瘤中）无效，则将可避免不必要的治疗，且可以更快速地着手其它治疗选择，得到更好的预期结果。预测在特定肿瘤中的抗雌激素功效的能力还将允许及早选择如mTOR抑制剂（例如依维莫司（Everolimus))等协同治疗组合。[0010]还需要更精确且更敏感地预测抗雌激素治疗在个别乳腺癌患者中的功效的测定方法，因为目前还没有可在患者复发之前获知治疗失败的手段。代之以在诊断时预测潜在抗雌激素治疗失败的能力为决定进行现有的5年抗雌激素辅助疗法计划提供了巨大价值。因此，及早获知潜在抗雌激素治疗失败可以避免不必要地使患者处于如子宫内膜癌等治疗副作用的风险下，且支持在成功的机会更大时及早决定选择更适当的治疗策略。[0011]本发明满足了这些需要。与如ThermoScientificEstrogenReceptoralphaRedistribution?Assay等现有技术测定相反，本发明提供了对原发性肿瘤组织中的ER聚集点的分析，而不考虑ER配体或药物的存在。在一个方面，本文中所描述的示范性方法涉及指示异常的自然产生的肿瘤中的细胞核中的ER聚集点的存在可用于预测具有ER拮抗剂性质的抗雌激素在该患者中的功效。在另一个方面，现已发现临床上对组成性活化ER的表征是对抗雌激素治疗敏感的肿瘤和癌症的一个新的且可用的指标。发明概要[0012]申请人:已经确定，前述的在本领域中对于改善采用原发性乳腺癌组织样本的雌激素受体（包括ERCI)测定的需要可以通过能辨别雌激素受体有生物活性的癌症与存在雌激素受体但其无生物活性的癌症的免疫组织化学或细胞学测定来满足。这些测定检测癌细胞核中的ER聚集点或聚集物（生物学转录活性ER)的存在，所述ER聚集点或聚集物指示肿瘤ER阳性状态，相反，扩散核染色（无生物活性的ER)和/或无核染色指示ER阴性状态。生物活性ER的存在指示所存在的雌激素受体参与肿瘤生物学过程且因此为抗雌激素疗法的一个适当标靶。相比之下，雌激素受体的扩散核染色指示尽管肿瘤将依据常规方法而被视为ER阳性，但它由于受体的无生物活性状态而不可能对抗雌激素疗法敏感。[0013]因此，本发明提供了一种用于鉴定最可能受益于如它莫西芬、法唑德西、阿那曲唑、来曲唑和依西斯坦等雌激素治疗的ER阳性肿瘤子集的方法。已经在同质人造实验模型中研究了雌激素受体聚集点的形成。然而，各自然产生的肿瘤是不同的且各自然产生的肿瘤是异质的。先前没有认识到辨别表达呈生物活性形式（即，与聚集点或聚集物中的配体结合）的雌激素受体的肿瘤细胞与表达呈无生物活性的形式（不与配体结合且呈扩散核分布）的雌激素受体的肿瘤细胞的临床意义。被看作癌细胞核内的聚集点的生物活性（即，转录活性）雌激素受体的表达为抗雌激素干预和破环雌激素刺激的肿瘤细胞生长路径提供了潜在标靶。也就是说，在所述肿瘤细胞中，抗雌激素可能潜在地使活化的配体或其它异常活化的ER失活。相比之下，在免疫组织化学或细胞学评估下被看作扩散核染色的无转录活性的ER的表达将指示尽管肿瘤细胞中存在雌激素受体，但它不可能是抗雌激素干预的适当标靶。这种方法将为理解抗雌激素在乳腺癌中的治疗功效提供合理框架，因为大部分女性乳腺癌患者为绝经后患者，且将会预期不存在抗雌激素的生理影响。利用病理生物学背景鉴定那些表达异常活化的ER的肿瘤将为治疗提供直接而又似乎合理的理论基础。[0014]因此，肿瘤细胞中的ER聚集点可以充当生物标记物以用于选择适当治疗，包括决定在辅助疗法中是否采用抗雌激素。这个生物标记物的鉴定允许开发可以充当乳腺癌患者将受益于抗雌激素疗法的可能性的指标的测定。[0015]在第一实施方案中，诊断性测定是一种用于鉴定具有表达活化的ER的肿瘤（即，活化的ER聚集点或"AEF"）的患者的方法。这些患者比不表达活化的ER(典型地被看作扩散核染色）的患者更可能受益于利用抗雌激素的治疗。利用抗雌激素使AEF失活可以通过多种机制中的任一种来发生，包括在实质上不改变聚集点结构的情况下使聚集点解离并抑制聚集点活化。不表达活化的ER聚集点（AEF)的患者可以包括依据常规测定为雌激素受体阴性的那些患者，或依据常规测定为雌激素受体阳性的那些患者。我们相信，展现AEF的任何肿瘤都是利用所述抗雌激素的治疗的候选者，包括乳腺癌。[0016]在第二实施方案中，本发明涉及一种用于鉴定可用AEF活性药物治疗的肿瘤的体外方法，其包括：[0017]a)在适于抗雌激素受体抗体与所述癌细胞的核中的雌激素受体结合的条件下使从患者获得的癌细胞或含有癌细胞的组织标本暴露于所述抗体；以及[0018]b)检测所述抗体与所述核中的雌激素受体存在或不存在聚集点结合；[0019]其中所述存在聚集点结合指示所述肿瘤对利用所述AEF活性药物的治疗具有敏感性，且所述不存在聚集点结合指示所述肿瘤对利用所述AEF活性药物的治疗缺乏敏感性。[0020]在又一个实施方案中，以上方法还包括治疗对所述抗体与雌激素受体拮抗剂的聚集点结合呈阳性的患者。在另一个实施方案中，以上方法还包括治疗对所述抗体与芳香酶抑制剂的聚集点结合呈阳性的患者。[0021]在又一个实施方案中，在所述核中的所述抗体不存在扩散结合的情况下检测所述抗体的聚集点结合。[0022]在又一个实施方案中，除了所述核中的所述抗体的扩散结合以外，还检测所述抗体的聚集点结合。[0023]在又一个实施方案中，所述癌细胞是乳腺癌细胞，或所述原发性肿瘤组织标本是乳腺癌标本。[0024]在又一个实施方案中，利用荧光来检测存在或不存在聚集点结合。[0025]在又一个实施方案中，用如酶反应等比色反应来检测存在或不存在聚集点结合。[0026]在又一个实施方案中，所述方法还包括用定量或半定量方式检测存在或不存在聚集点结合。[0027]在第三实施方案中，本发明涉及一种用于治疗肿瘤的方法，其包括：[0028]a)在适于抗雌激素受体抗体与所述癌细胞的核中的雌激素受体结合的条件下使从患者获得的癌细胞或含有癌细胞的组织标本暴露于所述抗体；[0029]b)检测所述抗体与所述核中的雌激素受体存在或不存在聚集点结合；以及[0030]C)如果存在聚集点结合，则用AEF活性抗雌激素治疗所述患者。[0031]在又一个实施方案中，本发明涉及AEF活性抗雌激素在鉴定抗雌激素受体抗体与癌细胞核中的雌激素受体存在聚集点结合之后用于治疗肿瘤的用途。[0032]在前述实施方案中的任一者中，存在聚集点结合可以意指1%至UK)%』％至100%、25%至100%或50%至100%的癌细胞核展现聚集点结合。[0033]在前述实施方案中的任一者中，当存在聚集点结合时，可以对所述聚集点结合的强度或密度进行定量。[0034]在前述实施方案中的任一者中，AEF活性抗雌激素可以是受体拮抗剂或芳香酶抑制剂，或所关注的肿瘤可以是乳腺癌。[0035]在又一个实施方案中，本发明提供了一种用于筛选抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物的AEF失活活性的体外方法，其包括：[0036]a)提供癌细胞或含有癌细胞的肿瘤组织标本，其中所述癌细胞表达AEF的基线聚集点分布度且用抗雌激素受体抗体对所述AEF进行可检测染色；[0037]b)使所述癌细胞或所述肿瘤组织标本暴露于所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物；以及[0038]c)检测到所述AEF的聚集点分布度相对于基线有所降低作为所述抗肿瘤药物或药物候选物具有AEF失活活性的指示，或检测到所述AEF的聚集点分布度相对于基线无实质性降低作为所述抗肿瘤药物缺乏AEF失活活性的指示。[0039]在用于筛选抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物的AEF失活活性的方法的某些实施方案中，AEF的基线水平可以用展现AEF的细胞的百分比或每个细胞的AEF的平均数表示。AEF的可检测染色在暴露于所述药物或药物候选物之后有所下降则将表示为表达AEF的细胞的百分比相对于基线有所降低或每个细胞的AEF的平均数相对于基线有所减少。或者，可以使用AEF的平均尺寸有所减小来指示所述药物或药物候选物的AEF失活活性。[0040]在用于筛选抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物的AEF失活活性的方法的其它实施方案中，可以提供所述癌细胞作为表达基线水平的AEF的癌细胞系。或者，所述肿瘤组织标本可以是原生性组织样品或来源于活组织检查的组织。[0041]在上述实施方案中的任一者中，所检测的雌激素受体可以是ERα且所使用的抗雌激素受体抗体可以是抗ERa。[0042]附图简述[0043]图1说明实施例5的结果。该图显示使用常规方法的乳腺癌活组织检查的ER阳性百分比（y轴）与使用本发明方法的AEF状态（X轴）的相互关系。[0044]发明详述[0045]在描述本发明的若干个示范性实施方案之前，应了解，本发明不限于以下描述中所阐述的构建或过程步骤的细节。本发明能够具有其它实施方案且能够用多种方式实施或实现。[0046]在本说明书全文中，提到"一个实施方案"、"某些实施方案"、"一个或多个实施方案"或"某一实施方案"意指结合所述实施方案所描述的特定的特征、结构、材料或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因而，如"在一个或多个实施方案中"、"在某些实施方案中"、"在一个实施方案中"或"在某一实施方案中"等短语在本说明书各处出现未必是指本发明的同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定的特征、结构、材料或特性可以用任何合适的方式组合。[0047]如本文中所使用，术语"癌细胞"和"肿瘤细胞"一般可互换，并且是指可能存在于实体肿瘤中或可能在血液中循环的恶性细胞。实体肿瘤可能是原发性肿瘤或转移性肿瘤，且任何循环癌细胞都可能来源于任一实体肿瘤类型。出于本发明的目的（即，组织分析），可以使用原生活组织检查标本对实体肿瘤进行分析。或者，用于根据本发明的分析（即，细胞学分析）的癌症或肿瘤细胞可以通过细针穿刺实体肿瘤以及从血液中分离来获得。[0048]如本文中所使用，短语"治疗肿瘤"、"肿瘤的治疗"等意指抑制肿瘤细胞复制、抑制肿瘤扩散、减小肿瘤尺寸、减轻或减少体内的肿瘤细胞数目，或者改善或减轻由肿瘤引起的疾病症状。肿瘤包括癌症。如果死亡率和/或发病率有所下降，或者如可能由体内肿瘤细胞数目减少或肿瘤尺寸减小表明的疾病负担有所减轻，则认为治疗是治疗性的。[0049]如本文中所使用，术语"雌激素受体"包括二聚雌激素受体、ERa受体和ERi3受体。[0050]如本文中所使用，术语"AEF活性抗雌激素"及其相等形式是指展现出使细胞核中的活化ER聚集点（AEF)失活、溶解或解离的能力，从而表明其作用机制是经由细胞的ER活化路径来实现的抗雌激素药物。这些术语意在包括二聚雌激素受体以及ERa受体和ER3受体。[0051]术语"AEF阳性"、"ER聚集点阳性"、"活化的ER"、"呈功能状态的ER"等是指细胞核中存在雌激素受体聚集物。这些术语意在包括二聚雌激素受体以及ERa受体和ERi3受体。所述术语包括病理性活化的ER，S卩，不能被如雌二醇或它莫西芬等寻常生理激动剂活化的ER。AEF的鉴定暗示活化是通过异常机制进行。[0052]术语"聚集点分布度"是指样品中的AEF阳性细胞相对于总细胞的相对数目。聚集点分布度可以用定量或定性方式确定。在一个实施例中，聚集点分布度是用AEF阳性细胞的百分比，即，含有雌激素受体聚集物的细胞的百分比（定量）表示。在一个替代实施例中，聚集点分布度可以用如"很少"或"许多"等描述含有雌激素受体聚集物的细胞的数目的相对术语来表述（定性）。[0053]举例来说，使用如抗雌激素受体抗体等比色配体、酶配体或经过放射性标记的配体可以用来结合细胞核中的雌激素受体。聚集点分布度可以用定量方式确定，例如通过确定具有由与AEF缔合的经标记抗体发射的颜色强度、荧光或放射性而不是扩散染色图案的细胞的数目来实现。可以使用光学显微镜在适当放大倍数下或使用多种技术（包括但不限于DNA微阵列、蛋白质特性分析、放射性标记或用于测量ER聚集点的其它替代技术）将所述聚集点分布度与不含AEF阳性细胞或认为聚集点分布度低于下限阈值的对照样品相比较。[0054]术语"扩散图案"是指表明不存在聚集点分布的细粒状图案。[0055]术语"雌激素"是指模拟雌二醇的一些或所有作用的天然或合成雌激素物质，也称为雌激素受体调节剂（ERM)或选择性雌激素受体调节剂（SERM)。[0056]术语"抗雌激素"是指抑制促孕剂的形成、转运或作用或者使促孕剂失活的物质，包括但不限于氟维司群（fulvestrant)、它莫西芬、托瑞米芬（Toremifene)，及芳香酶抑制齐[J，如来曲唑、阿那曲唑、伏氯唑（Vorozole)、依西斯坦、福美司坦（Foremestane)和阿他美坦（Atemestane)。ERM或SERM可能具有一些抗雌激素性质，且取决于使用情形，可以视为抗雌激素或雌激素。[0057]"AEF活性药物"是解离AEF或减少细胞核中的AEF的数目、尺寸或染色强度的药物。在一个实施例中，AEF活性药物引起细胞中的A或AD染色图案转变成D染色图案。AEF活性药物包括抗雌激素和雌激素受体拮抗剂以及对AEF展现出活性但并非通过抗激素机制操作的药物。[0058]术语"抗体"是指能够特异性结合抗原的蛋白质且包括对其所针对的抗原具有特异性结合亲和力而对其它物质具有很小或不具有结合亲和力的任何物质或物质群组。总体来说，术语"抗体"包括多克隆抗体、单克隆抗体、来源于人或动物的抗体、人化抗体（例如来源于人的非结合部分、来源于动物的结合部分）及其片段。[0059]术语"抗ERa抗体"和"抗ERi3抗体"是指分别针对雌激素受体的α和β同种型的抗体。"抗ER抗体"一般是指能够结合ER的抗体。适于根据本文中的方面加以使用的特定抗体包括但不限于可得自于VentanaMedicalSystems(Tucson，AZ)的CONFIRMSP1抗ER单克隆抗体及可得自于LeicaBiosystems(BuffaloGrove，IL)的N0V0CASTRA抗ERa和抗ERP单克隆抗体。[0060]在一个方面，本发明提供一种利用抗雌激素抑制对生长抑制敏感的肿瘤生长的方法，其是通过确定从患者获得的和怀疑含有肿瘤细胞的细胞样品或组织中的细胞核中的抗ER抗体的聚集点结合度。如果聚集点分布度大于约5%，例如为约5%至100%、25%至100%或50%至100%，则给予患者抗雌激素以抑制肿瘤生长。潜在可用抗雌激素包括氟维司群（(7R，8R，9S，13S，14S，17S)-13-甲基-7-[9-(4,4,5,5,5-五氟戊基亚磺酰基）壬基]-6,7,8,9,11，12,14,15,16,17-十氢环戊并[a]菲-3,17-二醇）、它莫西芬（2-[4-[(Z)_l，2-二苯基丁-1-烯基]苯氧基]-N，N-二甲基乙胺）、托瑞米芬（2-[4-[(Z)-4-氯-1，2-二苯基丁-1-烯基]苯氧基]-N，N-二甲基乙胺）；芳香酶抑制剂，如来曲唑（4_[(4_氰基苯基）-(1，2,4_三唑-1-基）甲基]苯甲腈）、阿纳曲唑（2-[3-(2_氰基丙-2-基）-5-(1，2,4_三唑-1-基甲基）苯基]-2-甲基丙腈）、伏氯唑（Vorozole)(6-[(4_氯苯基）-(1，2,4-三唑-1-基）甲基]-1-甲基苯并三唑）、依西斯坦（(8R，9S,10R,13S,14S)-10,13-二甲基-6-亚甲基-7,8,9,11，12,14,15,16-八氢环戊并[a]菲-3,17-二酮）、福美司坦（(8R，9S，10R，13S，14S)-4-羟基-10,13-二甲基-2,6,7,8,9,11，12,14,15,16-十氢-1H-环戊并[a]菲-3,17-二酮）和阿他美坦((8民95，105，135，145)-1，10，13-三甲基-7,8,9，11，12，14，15，16-八氢-6!1-环戊并[&]菲-3,17-二酮））及其组合。[0061]在一个方面，本发明涉及一种用于鉴定可用AEF活性药物治疗的肿瘤的方法，其包括：[0062]a)在适于抗雌激素受体抗体与所述癌细胞的核中的雌激素受体结合的条件下使从患者获得的癌细胞或含有癌细胞的肿瘤组织标本暴露于所述抗体；以及[0063]b)检测所述抗体与所述核中的雌激素受体存在或不存在聚集点结合；[0064]其中所述存在聚集点结合指示所述肿瘤对利用所述AEF活性药物的治疗具有敏感性，且所述不存在聚集点结合指示所述肿瘤对利用所述AEF活性药物的治疗缺乏敏感性。[0065]前述聚集点ER结合测定提供了一种比现用常规ER测定更敏感且更具预示性的测试，且可以鉴定在常规ER测定中被分类为ER阴性的患者以及按常规为ER阳性的患者的聚集点ER结合。在常规ER测定中被分类为ER阴性的患者以及按常规为ER阳性的患者可能测试为聚集点ER核结合阳性，且因此被视为利用抗雌激素的治疗的候选者。按常规测试为ER阳性的患者不存在ER聚集点将解释抗雌激素在一些患者中无效这一表面上反常的结果。因此，本发明的测定方法使得激素治疗成为更多癌症患者的有效选择。[0066]根据本发明的任何聚集点结合测定中所分析的癌细胞可能包含在直接从患者处获取的肿瘤组织标本中。这些标本典型地称为原生活组织标本，且可能来源于原发性或转移性实体肿瘤（组织分析）。或者，根据本发明的任何聚集点结合测定中所分析的癌细胞可以是例如通过针穿刺肿瘤或通过从血液中分离癌细胞而获得的个别癌细胞或癌细胞小簇(细胞学分析）。细胞学分析具有若干个优点，包括对患者的具有较小侵入性且其提供对相关细胞腔隙的分析而不干扰周围组织构造。[0067]M.Nadji等（Am.J.Clin.Pathol.(2005)123:2卜27)和D.C.Allred(ModernPathology(2010)23:S52-S59)描述了适用于本发明的某些免疫组织化学方法。举例来说，用于分析的原发性肿瘤活组织检查组织标本可以制备成如常规ER测定领域中已知的癌组织石蜡切片。如果使用石蜡切片，则首先通过加热载玻片使石蜡熔融且用二甲苯脱蜡。然后在较低等级的乙醇中将载玻片复原且暴露于特异性结合ERa、ERi3或两者的抗体，优选为单克隆抗体。然后使用抗体结合检测领域中已知的任何一种方法来检测抗体结合。因为ERa是常用的乳腺癌生物标记物，故特异性结合ERa的抗体可能最适于本发明的方法。[0068]适用于本发明的某些细胞学方法包括应用于细针穿刺材料的免疫细胞化学法，例如，如N.H.Hafez等（J.EgyptianNat.CancerInst.(2010)22:217-225)所描述。穿刺细胞载玻片可以固定在醇中（例如95%异丙醇，10分钟到18小时）并且染色，以观察雌激素受体。经过固定的载玻片可以暴露于结合ERa、ERi3或两者的ER特异性一级抗体，优选为单克隆抗体。可以使用抗体结合检测领域中已知的任何一种方法来检测抗体结合。[0069]一种适于检测抗体与其标靶的结合的方法为比色测定，典型地为酶比色测定。一种所述方法采用过氧化物酶来产生在光学显微镜下可见的有色染色。使用过氧化氢阻断组织标本中的内源性过氧化物酶，且使用生物素阻断试剂阻断内源性生物素，随后与抗体一起孵育。在一个实施例中，一级抗体结合之后以经生物素标记的二级抗体靶向所述一级抗体。然后使用与过氧化物酶（典型地为辣根过氧化物酶（HRP))结合的亲和素或抗生蛋白链菌素检测二级抗体的结合。加入所述结合物以便使酶与抗体-标靶复合物结合。通过使显色底物3,3'-二氨基联苯胺（DAB)酶转变成ER定位位点处的棕色染色来观察ER。如果一级抗体是小鼠抗体，则其随后结合经生物素标记的抗小鼠免疫球蛋白。细胞或组织标本可以用固绿进行对比染色以增加过氧化物酶染色的可见性。[0070]或者，可以使用荧光法来检测结合ER-a、ER-i3或两者的抗体。在这种情况下，经过荧光标记的一级抗体可能结合ER标靶且直接在荧光显微镜下检测。然而，采用使未经标记的一级抗体与ER结合，随后使经过荧光标记的二级（例如抗小鼠免疫球蛋白）抗体与所述一级抗体结合的方法可以减少非特异性荧光。已知用于免疫细胞学或免疫组织化学测定的任何荧光标记都可以用于本发明的方法中，例如FITC。[0071]单克隆和多克隆抗体都可能可用于本发明的方法。合适的单克隆抗体的非详尽清单可购自SantaCruzBiotechnology,Inc.，包括抗ERa和抗β抗体（http://www.scbt.com/table_estrogen_receptor·html)〇[0072]典型地通过酌情在光学显微镜或荧光显微镜下观察经过染色的载玻片来检测抗体与ER的结合。放大倍数典型地为约40倍或50倍；然而，为了提高检测AEF的敏感性，可能需要在约80倍或100倍下评估载玻片以有助于研究亚核结构。如本领域中已知，可以根据需要调节放大倍数，以便更清楚地鉴定本文中所描述的各种ER表型。[0073]可以通过流式细胞术检测低于光学或荧光显微术阈值的阳性来评估依据显微术为表观阴性的样品。如果流式细胞术指示稀少阳性细胞，则可以使用高放大倍数显微术(100倍到400倍，或400倍到900倍，例如800倍）来研究亚核结构和鉴定AEF。然而，如果流式细胞术所检测的阳性细胞过于稀少以致于无法利用显微术可靠地检测以便分析AEF，则可以使用荧光活化的细胞分选仪（FACS)基于其荧光来分离阳性细胞与悬浮液中的细胞。由于此过程浓缩但不损坏阳性细胞，故实质上增加了随后的微观评估时成功观察AEF的可靠性和概率。[0074]个别肿瘤细胞核中存在或不存在AEF可以在光学或荧光显微镜下或通过任何其它适当手段（如荧光或比色测量）直观地检测。典型地，将使用直观检测手段。染色结果可以通过简单地注明存在或不存在AEF或通过计算阳性细胞的数目或百分比来进行定量。或者，可以对染色的特定特征进行定量。举例来说，检测可以包括注明呈AEF形式的聚集点结合是否伴随有扩散核染色、以数目或百分比定量阳性细胞和/或对AEF的强度或数目/密度进行定量。AEF的相对尺寸也可以用于表征、分类和定量。AEF密度的定量可以确定为每个细胞的平均聚集点数，或使用任意标度（例如"很少"、"中等"或"许多"）。强度可以使用任意标度（例如低/中等/高）或数值标度（如1到5)以类似方式确定。典型地，对患者的肿瘤组织的分析结果将与阳性和/或阴性对照相比较。[0075]当聚集点分布度为展现AEF的标本中的细胞的1%至100%、5%至100%、25%至100%或50%至100%时，将细胞或肿瘤组织标本判断为AEF阳性。由于AEF活性药物或抗雌激素的治疗功效还可能与AEF染色强度或与AEF的数目、尺寸或密度相关，故这些参数也可以用于确定肿瘤对用AEF活性药物或抗雌激素治疗的敏感性。总体来说，预期肿瘤对用AEF活性药物或抗雌激素治疗的敏感性将随细胞或肿瘤组织标本的细胞中的聚集点分布度(例如阳性细胞的数目或百分比增加、AEF强度增加和/或AEF的数目或尺寸增加）而增加。[0076]用于确定肿瘤对AEF活性药物或抗雌激素的敏感性的上述方法可能是人工方法(例如使用荧光显微镜直观检测），或其可能是对经过比色或荧光标记的细胞或组织标本进行快速扫描、检测和定量的自动化或半自动化使用方法。举例来说，可以开发完全自动化的扫描和分析系统且用于本发明。与需要人工选择欲分析的特定区域的InScapeKER/PR定量免疫组织化学（IHC)系统相反，针对细胞核中的AEF的本发明扫描和分析系统将旨在提供对抗原特异性免疫组织化学染色标本的自动化全标本扫描和分析。图像鉴定将产生整个染色组织切片的数字图像。然后，抗原特异性计算机算法将分析代表整个标本的数字图像的结果。为了用于本发明的方法，所述软件将辨别核中的聚集点与扩散背景染色，且基于逐个细胞或逐个细胞簇来测量突光强度和聚集点尺寸，在整个标本上对各细胞或细胞簇重复所述过程。这些自动化方法将通过执行不可能人工执行的功能来提高准确度，同时降低成本。全自动化还将使得所述测试可由非专业医疗中心来实现。[0077]用于确定肿瘤对AEF活性药物或抗雌激素的敏感性的本发明方法允许医学从业者鉴定更可能受益于所述治疗的肿瘤患者子集。也就是说，通过首先在诊断性方法中将肿瘤分类为AEF阳性或AEF阴性，医学从业者能够选择对患者来说最适当的治疗。因此，在另一个方面，本发明还提供了一种用于治疗患者的肿瘤的方法，其包括：[0078]a)在适于抗雌激素受体抗体与所述癌细胞的核中的雌激素受体结合的条件下使从患者获得的癌细胞或含有癌细胞的组织标本暴露于所述抗体；[0079]b)检测所述抗体与所述核中的雌激素受体存在或不存在聚集点结合；以及[0080]C)如果存在聚集点结合，则用AEF活性药物治疗所述患者。[0081]上文论述了检测细胞核中的聚集点分布度（包括抗体与雌激素受体存在或不存在聚集点结合）的细节。将基于AEF(当其存在时）的数目/百分比、强度、尺寸和/或密度来决定是否基于诊断性测定的结果对患者进行治疗。当诊断性测定中的聚集点分布度为癌细胞核的1%至100%、5%至100%、25%至100%或50%至100%时，可以作出用AEF活性药物或抗雌激素治疗患者的决定。总体来说，预期用AEF活性药物或抗雌激素治疗的功效将随阳性细胞的数目或百分比增加、AEF强度增加和/或肿瘤组织标本或癌细胞样品的细胞中的AEF数目或尺寸增加而增加。基于这些参数，医学从业者还可以确定治疗剂量、时程和时长。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及AEF活性抗雌激素用于治疗AEF阳性肿瘤的用途。[0082]根据上述方法鉴定或治疗的肿瘤可以包括存在AEF且AEF的存在可以确定的任何癌性或非癌性肿瘤。所分析或治疗的肿瘤组织或癌细胞可以从由以下各项组成的群组中选出：乳腺、前列腺、卵巢、子宫内膜、肺和子宫组织或细胞。所述癌症尤其包括乳腺癌。[0083]前述治疗方法的AEF活性药物或抗雌激素可以是能够使AEF失活（例如通过溶解或解离聚集物）的任何药物。所述药物包括ER拮抗剂和/或芳香酶抑制剂，但也包括能够使AEF失活（作为作用机制）的其它药物以供用于本发明。在某些方面，抗雌激素是从由以下各项组成的群组中选出：氟维司群、它莫西芬、托瑞米芬或芳香酶抑制剂，如来曲唑、阿那曲唑、伏氯唑、依西斯坦、福美司坦和阿他美坦，及其组合。[0084]在又一个方面，取决于所选抗雌激素或抗雌激素组合的效能、生物利用率和安全特性，AEF活性药物或抗雌激素是以10到约200mg/天的量给予具有AEF阳性肿瘤的患者。不受理论束缚，我们相信通过鉴定对利用抗雌激素治疗更敏感的肿瘤患者，可以使用较低的抗雌激素剂量，从而降低毒性副作用的风险。因而，约10到约200mg的较低剂量范围可以用于展现出大于5%AEF聚集点结合的患者。在一个方面，肿瘤中的ER的高AEF阳性分类由于高AEF阳性肿瘤中的活化度较高而可能导致给药方案与AEF阳性且扩散染色的细胞分类不同。相比之下，主要为扩散性的染色图案（指示未活化ER)将指示利用AEF活性药物或抗雌激素治疗的治疗不合理。[0085]在又一个方面，本发明提供了用于筛选抗肿瘤药物和抗肿瘤药物候选物使AEF失活的能力的方法。这些方法可用于鉴定其它AEF活性药物，包括抗雌激素，所述药物可以是供用于根据本发明的方法治疗AEF阳性肿瘤的候选物。因此，所述用于筛选抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物的AEF失活活性的方法包括：[0086]a)提供癌细胞或含有癌细胞的肿瘤组织标本，其中所述癌细胞表达AEF的基线聚集点分布度且所述AEF是利用抗雌激素受体抗体进行可检测染色；[0087]b)将所述细胞或肿瘤组织标本暴露于所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物；以及[0088]c)检测到所述AEF的聚集点分布度相对于所述AEF的基线聚集点分布度有所降低作为所述抗肿瘤药物或药物候选物具有AEF失活活性的指示，或检测到所述AEF的聚集点分布度相对于所述AEF的基线聚集点分布度无实质性降低作为所述抗肿瘤药物或药物候选物缺乏AEF失活活性的指示。[0089]在前述筛选方法的一个替代实施方案中，可以使用来自于同一肿瘤的两个表达AEF的肿瘤组织标本或两个表达AEF的癌细胞样品以供比较。在这个实施方案中，两个肿瘤组织标本或癌细胞样品都利用抗雌激素受体抗体进行AEF可检测染色，然后将所述标本或样品中的一个暴露于所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物，而另一个则不然。如果经过治疗的标本或样品中的AEF染色与未经过治疗的标本或样品相比有所降低，则所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物具有AEF失活活性。相反，如果经过治疗的标本或样品中的AEF染色与未经过治疗的标本或样品相比并未降低，则所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物不具有AEF失活活性。前述筛选方法将提供对已知的抗雌激素和还有待于发现的抗雌激素的作用机制的进一步理解。具有AEF活性（即，具有AEF失活活性）的抗雌激素将可能可用于使用本发明的方法在被鉴定为具有AEF阳性肿瘤的患者群体中治疗肿瘤。可能筛选为AEF活性的抗雌激素的实例包括管理机构批准使用的任何抗雌激素和开发中的任何未经批准的抗雌激素。[0090]如果抗肿瘤药物在上述筛选方法中对于AEF活性呈阴性，则缺乏使AEF失活的能力可以理解为指示所述抗肿瘤药物可能由于不同作用机制的互补性而与AEF活性抗雌激素一起有效用于组合疗法中。举例来说，AEF活性抗雌激素可以与不通过AEF灭活机制起作用的其它激素治疗（例如抗孕酮）组合使用，以便实现与任一单独药剂相比有所改良的治疗功效。或者，AEF活性抗雌激素可以与一种或多种对于AEF活性呈阴性的常规化学治疗剂组合用于筛选测定中，以实现与任一单独药剂（例如依维莫司（everolimus)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、TM1_D、抗HER2药物、贝伐单抗（bevacizumab)，或如紫杉醇（paclitaxel)、多西他赛（docetaxel)、紫杉烧（taxanes)、多柔比星（doxorubicin)、多柔比星脂质体、聚乙二醇化多柔比星脂质体、蒽环类、蒽二酮类、卡钼（carboplatin)、顺钼、5-FU、吉西他滨(gemcitabine)和环磷酰胺等药剂）相比有所改良的治疗功效。举例来说，依维莫司是一种指明与芳香酶抑制剂组合且未来可能指明基于ERF的mTor抑制剂。[0091]在又一个方面，检测核中AEF抗体的聚集点分布的存在可以用作先前用抗肿瘤药物治疗的患者的肿瘤（其已经变得对该药物具有抗性）仍对使AEF失活的抗雌激素敏感的指示。在一个方面，所述方法可能适于确定由先前的化学疗法引起的肿瘤化学抗性是否可以通过利用使AEF失活的抗雌激素的治疗加以逆转。所述化学抗性的逆转可能基于先前的化学疗法和使AEF失活的抗雌激素的不同作用机制。[0092]实施例1[0093]得自于患有乳腺癌（侵袭性导管癌）和子宫内膜癌的患者的肿瘤标本是选自OscarLambret癌症中心（Lille,France)解剖病理学部的档案室。患者先前已经提供了出于研究目的使用其组织的同意书。获得已经固定在4%福尔马林固定剂中且包埋在石蜡中的乳腺或子宫内膜肿瘤组织样品。[0094]对存档乳腺或子宫内膜肿瘤组织的3到4μπι切片进行免疫组织化学（IHC)。将所述切片脱石蜡，水合且在使用缓冲液（〇.〇5mol/LTris/HCl、0.15mol/LNaCl、0.05%Tween20，pH7.6，Dako，Denmark，编码S3006)中洗漆。在98°C水浴中利用Dako标祀修复液(改性柠檬酸盐缓冲液，PH6.1，Dako,Denmark，编码S1699)进行抗原修复20分钟。然后，在室温（RT)下用Dako过氧化物酶阻断溶液覆盖所述切片以阻断内源性过氧化物，持续5分钟（DakoEnVision?+/HRP小鼠（DAB+)试剂盒，Dako,Denmark,编码K4007)，洗漆，并且在室温下在湿润腔室中与一级抗体一起在适当最佳稀释度下孵育60分钟（表1)。用使用缓冲液洗漆5分钟后,在室温下使用Dako经标记聚合物（DakoEnVision?+/HRP小鼠(DAB+)试剂盒，Dako,Denmark,编码K4007)检测一级抗体结合，持续30分钟。然后在室温下将色原（DAB)与底物配料一起使用5到10分钟，并且用Gill的苏木精对切片进行轻微对比染色。[0095]通过在免疫组织化学染色程序中用同种型对照小鼠IgGl(表1)或仅用抗体稀释剂（洗涤缓冲液阴性对照）代替一级抗体来获得阴性对照。[0096]表1.用于免疫纟目织化学分析的抗体[0097]【权利要求】1.一种用于鉴定可用AEF活性药物或抗雌激素治疗的肿瘤的体外方法，所述方法包括：a)在适于抗雌激素受体抗体与所述癌细胞的核中的雌激素受体结合的条件下使从患者获得的癌细胞或含有癌细胞的肿瘤组织标本暴露于所述抗体；以及b)检测所述抗体与所述核中的雌激素受体存在或不存在聚集点结合；其中所述存在聚集点结合指示所述肿瘤对利用所述AEF活性药物或抗雌激素的治疗具有敏感性，且所述不存在聚集点结合指示所述肿瘤对利用所述AEF活性药物或抗雌激素的治疗缺乏敏感性。2.如权利要求1所述的方法，其还包括：检测所述抗体与所述核中的雌激素受体存在或不存在扩散结合。3.如权利要求1所述的方法，其中利用荧光来检测存在或不存在聚集点结合。4.如权利要求1所述的方法，其中用比色法来检测存在或不存在聚集点结合。5.如权利要求4所述的方法，其中使用过氧化物酶来检测存在或不存在聚集点结合。6.如权利要求1所述的方法，其中对存在或不存在聚集点结合进行定量。7.如权利要求6所述的方法，其中存在或不存在聚集点结合是用AEF阳性细胞的百分比来表示。8.如权利要求6所述的方法，其中存在或不存在聚集点结合是用活化的雌激素受体聚集点的相对强度或密度来表示。9.如权利要求1所述的方法，其还包括：如果存在聚集点结合，则用AEF活性药物或抗雌激素治疗所述患者。10.-种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括：a)在适于抗雌激素受体抗体与所述癌细胞的核中的雌激素受体结合的条件下使从患者获得的癌细胞或含有癌细胞的肿瘤组织标本暴露于所述抗体；b)检测所述抗体与所述核中的雌激素受体存在或不存在聚集点结合；以及c)如果存在聚集点结合，则用AEF活性药物治疗所述患者。11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌细胞中的AEF聚集点分布度为1%至100%、5%至100%、25%至100%或50%至100%。12.如权利要求10所述的方法，其中用ER拮抗剂治疗所述患者。13.如权利要求10所述的方法，其中用芳香酶抑制剂治疗所述患者。14.如权利要求10所述的方法，其中如果不存在聚集点结合，则用非AEF活性抗肿瘤药物治疗所述肿瘤。15.-种AEF活性药物的用途，其用于治疗先前被鉴定为AEF阳性的肿瘤。16.如权利要求15所述的用途，其中所述肿瘤的AEF阳性状态是在包括以下步骤的方法中确定：a)在适于抗雌激素受体抗体与所述癌细胞的核中的雌激素受体结合的条件下使从患者获得的癌细胞或含有癌细胞的肿瘤组织标本暴露于所述抗体；以及b)检测所述抗体与所述核中的雌激素受体存在或不存在聚集点结合；其中所述存在聚集点结合指示所述肿瘤对利用所述AEF活性药物的治疗具有敏感性，且所述不存在聚集点结合指示所述肿瘤对利用所述AEF活性药物的治疗缺乏敏感性。17.如权利要求16所述的用途，其中用ER拮抗剂治疗所述肿瘤。18.如权利要求16所述的用途，其中用芳香酶抑制剂治疗所述肿瘤。19.一种用于筛选抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物的AEF失活活性的方法，所述方法包括：a)提供癌细胞或含有癌细胞的肿瘤组织标本，其中所述癌细胞表达AEF的基线聚集点分布度且用抗雌激素受体抗体对所述AEF进行可检测染色；b)使所述细胞或组织标本暴露于所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物；以及c)检测到所述AEF的聚集点分布度相对于基线有所降低作为所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物具有AEF失活活性的指示，或检测到所述AEF的聚集点分布度相对于基线无实质性降低作为所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物候选物缺乏AEF失活活性的指示。20.如权利要求1、10、16和19中任一项所述的方法，其中所述抗雌激素受体抗体是抗ERa0【文档编号】G01N33/566GK104254779SQ201280065924【公开日】2014年12月31日申请日期:2012年11月1日优先权日:2011年11月4日【发明者】E·吉勒斯申请人:茵维韦斯有限公司