专利名称：一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
华法林为香豆素类口服抗凝药，是临床上常用的抗凝药物，华法林通过抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的扩大和延展，抑制在血栓的基础上形成新的血栓，抑制血栓脱落和栓塞的发生，有利于血栓的清除。临床上主要用于治疗房颤、心瓣膜修复术、再发性的中风、深静脉血栓以及肺动脉栓塞。但是华法林治疗窗窄、剂量个体差异大，在其治疗的开始阶段，大约有12%的患者发生出血性事件，其中2%发生致死性出血。研究表明，人群对华法林的个体差异与单核苷酸多态性(SNP)密切相关。其中华法林靶标VKORCl(维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位I)和参与华法林代谢的CYP2C9 (细胞色素P450酶2C9)以及CYP4F2、CALU和GGCX等基因的遗传多态性与患者的有效剂量和致出血剂量密切相关。对上述基因多态性的诊断能改善华法林抗凝的安全性，减少抗凝初期剂量滴定时间，以求尽快达到治疗水平的INR (internationalnormalizedratio,国际标准化比值)。现有的用于指导华法林用药相关基因的诊断方法主要为基因芯片、荧光定量PCR。(I)基因芯片利用目标DNA与支持物上所固 定的密集的寡核苷酸探针阵列进行等位基因特异性反应，根据反应后信号的有无和强弱确定SNP位点。基因芯片通量高，但普遍准确度不够，易出现假阳性。(2)荧光定量PCR方法通过设计特异性的探针可以准确得出样品基因型，操作简单、快速。但其通量较低，每次反应仅能检测单个位点，对于上述基因的相关SNP位点需要进行多个反应的检测，成本过高，不利于市场应用。同时，目前的这些检测方法仅局限于检测VKORCl和CYP2C9两个基因上的3至4个SNP位点，信息涵盖面不够，指导性不足。Gen0meLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记,在同一个EP管中同时分析多个基因的的等位基因型,能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下优点:1、高通量:本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测30种腹泻病毒，30个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。2、准确性强:GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；3、敏感性高，结果重复性好:GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超闻灵敏度；4、方法简便，使用经济:GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；5、精确定量、灵活性强:可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。6、易于实现自动化:就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报
告目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、准确度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒，包括超纯水(ddH20)，X溶液，10XPCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，所述的PCR引物包括以下5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如下表I所示:表I
权利要求
1.一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒，包括超纯水，X溶液，IOXPCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的PCR引物包括以下5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如下表所示:
2.根据权利要求1所述的一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于:所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA ;反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
3.根据权利要求1所述的一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照品为为上述5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的指导华法林用药的多重基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤: (1)采集样本并提取核酸 采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品的分离培养物，从分离培养物中提取核酸； (2)以提取的核酸为模板进行PCR反应 取DNA样品2 μ L，10 XPCR缓冲液2 μ L，25mM的氯化镁3.4 μ L，PCR引物溶液2 μ L，DNA聚合酶0.6 μ L，X溶液2 μ L，超纯水10 μ L混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件:95° C2分钟；94° C30秒钟，55° C30秒钟，70° Cl分钟，循环35次；70° Cl分钟；4° C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增弓I物序列为AGGTGACACTATAGAATA ；反向扩增弓I物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1 N0.32所示； (4)GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品取PCR产物0.1-1 μ L，Beckman GeXP系统配套的上样缓冲液38.75 μ L，DNAMarker0.5 μ L,矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品,将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得指导华法林用药相关基因的SNP位点的等位基因型。
全文摘要
本发明公开了一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法，包括超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，特点是PCR引物包括5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如SEQ ID NO.1～NO.32所示；其检测包括采集样本并提取核酸的步骤；以提取的核酸为模板进行PCR反应的步骤；最后GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品的步骤，优点是特异性强、准确性高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。
文档编号G01N27/447GK103074438SQ20131003331
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者南丽, 颜进, 吴勇 申请人:海尔施生物医药股份有限公司