一种大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条，涉及生物检测【技术领域】，包括有支撑被衬，该支撑被衬上依次粘贴有包被膜、标记垫和样品垫，在所述支撑被衬的手持端粘贴有吸水垫；所述标记垫包被有抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体，所述包被膜上前部设有检测线，所述包被膜上后部设有质控线，所述检测线包被有抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体，所述质控线包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗体，与现有技术相比，本发明的试纸条操作简便，不需要本领域的专业人员和专业设备仪器，能满足不同层次人员和部门的需要，尤其是基层单位的需要，并且具有快速、准确、灵敏、特异、价格低廉等优点。
【专利说明】—种大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物监测【技术领域】，尤其是一种用于快速检测大片形吸虫病的免疫层析快速检测试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002]大片形吸虫(Fasciola gigantica)是一种寄生于人畜的重要寄生虫,在家畜中主要危害牛羊，感染牛后能引起急性或慢性的肝炎和胆管炎，导致全身性的中毒现象和营养障碍，使牛免役力降低，肉奶产量减少，品质下降，严重感染时，还可引起大批死亡，给畜牧业、农业都带来巨大的经济损失；大片形吸虫感染也可以引起人的严重寄生虫病，如2011年我国云南宾川爆发人群大片形吸虫病，由于缺乏有效的诊断检测方法，造成重大疫情，共有20多人感染发病。因此，对该病的防治要依赖有效的检测诊断方法。目前该病常用的检测、诊断方法主要有:(I)传统的粪便虫卵检查法，该法简便、不需要昂贵仪器设备，但检出率低，且不能进行早期诊断；(2)分子生物学检测方法，如聚合酶链反应法，该法灵敏度高，但需要特殊昂贵的仪器，操作复杂、容易出现假阳性结果；(3)免疫学检测方法，如酶联免疫吸附测定法。目前国内报道的大片形吸虫病的酶联免疫吸附测定法多为检测抗体的方法，但该法不能区分现症感染和既往感染，因此不能对疫病做出准确的诊断，同时该法还需要借助特殊的仪器如酶标仪才能进行检测。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条及其制备方法，它可以解决现有的用于检测和诊断大片形吸虫病的设备价格昂贵、操作复杂的问题。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明的大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条的技术方案是:包括有支撑被衬，该支撑被衬上依次粘贴有包被膜、标记垫和样品垫，在所述支撑被衬的手持端粘贴有吸水垫；所述标记垫包被有抗大片形吸虫ES (分泌排泄)抗原的7D1单克隆抗体，所述包被膜上前部设有检测线，所述包被膜上后部设有质控线，所述检测线包被有抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体，所述质控线包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗体。7D1单克隆抗体和7D4单克隆抗体的制备方法见:《抗大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定》，南方农业学报2012年43卷第9期。
[0005]上述技术方案中，更具体的方案可以是:所述样品垫由玻璃纤维膜制成，所述标记垫由聚酯纤维膜制成，所述包被膜为硝酸纤维素膜，所述吸水垫为粗纤维吸水纸，所述支撑被衬为聚氯乙烯板。
[0006]进一步的:所述标记垫包被的7D1单克隆抗体为胶体金标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体。
[0007]本发明的大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条的制备方法为A、包被膜(4)的制备:
a.用硝酸纤维素膜制成包被膜(4)，并在包被膜(4)上同一面靠近标记垫(3)端设置有检测线(T)，另一端设置有质控线(C)；
b.将抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体稀释至包被浓度为0.15 mg/mL -0.50mg/mL,按包被量为每垫0.5 μ L -5 μ L得到检测包被液，并将其包被在检测线(T)上，该检测线(T)能够识别大片吸虫ES抗原；
c.将兔抗小鼠免疫球蛋白抗体稀释至0.10 mg/mL -0.50 mg/mL的浓度，按包被量为每垫0.5 μ L -5 μ L得到质控包被液，并将其包被在质控线(C)上，干燥，密封保存即得包被膜⑷；
B、标记垫(3)的制备:
a.对抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体进行胶体金的制备和单克隆抗体标记；
b.将胶体金和单克隆抗标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体1:5稀释后，以每垫5 μ L-25 μ L的量喷点在标记垫进行包被，然后将标记垫干燥、密封保存即得标记垫
(3)；
所述抗大片形吸虫的ES抗原的7D1单克隆抗体能特异识别大片形吸虫ES抗原；
C、样品垫(2)的制备:用玻璃纤维膜制成样品垫(2)；
D、将包被膜(4)、标记垫(3)、样品垫(2)依次从下往上搭接好后粘贴在支撑衬板(I)上，最后将吸水垫(5)搭接包被膜(4)上，即得到大片形吸虫免疫层析快速检测纸条。
胶体金的制备和单克隆抗标记方法参考文献:《水牛伊氏锥虫病免疫胶体金试纸条的研制及初步应用》，畜牧兽医学报2011年42卷第7期。
[0008]进一步的:D步骤中将标记垫烘干的温度为36° C_38° C，E步骤中干燥的温度为36。C-38。Co
[0009]进一步的:B步骤中将兔子进行小鼠免疫球蛋白抗体的免疫方法是，把质量浓度为lmg/mL的小鼠免疫球蛋白与弗氏完全佐剂按1:0.5-1.5比例混匀，按0.5ml_2.0ml /只兔子的剂量对兔子进行脚掌皮下注射免疫；6_8天后，用质量浓度为2mg/ml的小鼠IgG与弗氏不完全佐剂按1:0.5-1.5比例混匀，以0.5ml-2.0ml/只兔子的剂量对上述兔子进行胭淋巴结注射二次免疫；9-11天后，按二次免疫的方法加强免疫一次。
[0010]由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比，具有如下有益效果:
1、由于本试纸条含有两种大片形吸虫ES抗原识别抗体，即7D1单克隆抗体和7D4单克隆抗体，而且这两种单克隆抗体是我们从制备的多个单克隆抗体中筛选鉴定出来的，因而使用本发明所述试剂条检测大片吸虫特异性效果更好。
[0011]2、使用本试纸条进行大片形吸虫感染的检测，无需特殊检测仪器设备，具有检测费用低，操作简便、快速等优点。
[0012]3、使用本试纸条进行大片形吸虫感染的检测，无需专业技术人员操作也可以完成测试，具有使用范围广，尤其适合广大基层单位现场检测使用。
[0013]4、与常用的间接酶联免疫吸附法相比，使用本试纸条进行大片形吸虫感染的检测，能直接作出是否感染大片形吸虫的判断，还可用于临床大片吸虫治疗效果的评价。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明的检测试纸条的结构示意图。I为支撑被衬，1-1为支撑被衬的手持端，2为样品垫,3为标记垫,4为包被膜,5为吸水垫，T为检测线，C为质控线。【具体实施方式】
[0015]以下结合附图实例，对本发明作进一步详述，以下实施例是为了更好的理解本发明，不对本发明的内容和保护范围构成限制:
如图1所示的本检测试纸条，它包括有支撑被衬1，该支撑被衬上依次粘贴有包被膜4、标记垫3和样品垫2，在支撑被衬I的手持端1-1粘贴有吸水垫5 ;所述标记垫3包被有抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体，所述包被膜(4)上前部设有检测线T，所述包被膜4上后部设有质控线C，所述检测线T包被有抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体，质控线C包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗体。
[0016]所述的玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、硝酸纤维素膜(NC膜)、粗纤维吸水纸和聚氯乙烯板购自上海金标生物科技有限公司。
[0017]实施例1-4中涉及的材料来源和制备方法如下:
A、按常规方法制备抗大片形吸虫ES抗原单克隆抗体，所述抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体和抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体本质上为蛋白质,能特异识别大片形吸虫ES抗原。该常规方法来至公开文献:《抗大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体的制备及生物学活性的鉴定》，南方农业学报2012年43卷第9期；
B、兔抗小鼠免疫球蛋白抗体的制备:把质量浓度为lmg/mL的小鼠免疫球蛋白与弗氏完全佐剂1:1混匀，按Iml/只兔子的剂量对兔子进行脚掌皮下注射免疫；7天后，用质量浓度为2mg/ml的小鼠IgG与弗氏不完全佐剂1:1混匀，以0.5 mL/只兔子的剂量对上述兔子进行胭淋巴结注射二次免疫；10天后，按二次免疫的方法加强免疫一次，免疫后，定期耳静脉采血测定血清效价，血清效价到达后，心脏采血，分离血清；采用常规的辛酸一饱和硫酸铵法初步纯化纯后，再用portion G蛋白柱进一步纯化；当用常规的琼脂扩散试验测定的兔抗小鼠免疫球蛋白二抗效价为1:104，用BCA蛋白浓度试剂盒测定兔抗小鼠免疫球蛋白二抗浓度为1.22 mg/ml时，兔抗小鼠免疫球蛋白抗体的制备完成，4°C冰箱保存待用；
C、按常规方法进行胶体金的制备和单克隆抗标记，常规方法参照文献:《水牛伊氏锥虫病免疫胶体金试纸条的研制与应用》，畜牧兽医学报2011年42卷第7期；
D、将上述C步骤制得的胶体金和标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体1:5稀释后，以每垫12.L的量喷点在标记垫进行包被，然后将标记垫37°C烘干、密封保存；
E、将抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体稀释至包被浓度为0.26 mg/mL，按包被量为每垫1.5 y L包被至包被膜的检测线；兔抗小鼠免疫球蛋白抗体稀释至0.30 mg/mL的浓度，按包被量为每垫1.5 ii L包被至包被膜的C线，37°C干燥，密封保存；
F、将样品垫、标记垫、包被膜、吸水垫依次搭接粘贴在支撑衬板上，即得到本大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条。
[0018]上述步骤中，BCA法蛋白浓度试剂盒购自南京碧云天生物公司；
弗氏完全佐剂:Sigma公司；
弗氏不完全佐剂:Sigma公司；
Protein G蛋白柱:上海嵘崴达实业有限公司；
硫酸铵:国药公司；
辛酸:Sigma公司产品； 其他化学试剂均为国产分析纯试剂；
稀释液配制(PH 7.2 0.0lmol/L PB缓冲溶液)；
称取 Na2HP0412H20 0.2579g, NaH2P042H20 0.0437g 加双蒸水至 IOOmL 调整 PH 值至
7.2，0.22 μ m微孔滤膜过滤，4°C保存备用。
[0019]实施例1:
将按上述方法制备的胶体金标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体1:5稀释后，以每垫12.5μ L的量喷点在标记垫进行包被，然后将标记垫37°C烘干、密封保存。
[0020]将抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体稀释至0.26 mg/mL的浓度，按1.5 μ L的量包被至包被膜的检测线T ;兔抗小鼠免疫球蛋白抗体稀释至0.30 mg/mL的浓度，按
1.5 μ L的量包被至包被膜的质控线C，37°C干燥，密封保存
将样品垫2、标记垫3、包被膜4、吸水垫5依次搭接粘贴在PVC材料制成的支撑衬板上，大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条即制备完成。
[0021]本发明所述大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条，检测标本为粪液、血清、胆汁、乳液，使用本发明试纸条进行大片形吸虫检测时，取液体样本液60-80 μ L直接滴加到样品垫2上，样本液中的靶标物质即大片形吸虫ES抗原，在纤维层毛细作用下沿着试纸条从沾液端向支撑被衬的手持端1-1移动，待其移动经过标记垫3时，大片形吸虫ES抗原即与标记垫3上包被的胶体金标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体结合,并继续向包被膜纤维层移动，当这种抗原抗体结合物移动经过包被膜检测线T时，与检测线T上包被的抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体的特异性结合，导致胶体金在检测线T上聚集，使检测线T显色，其余胶体金标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体继续向前迁移，迁移到质控线C时由于胶体金标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体能与质控线C上包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体特异性结合，因此，胶体金在质控线C上聚集，使质控线C显色，即检测线T和质控线C同时显色，表明待检样本液为阳性。如果待检样本液没有大片形吸虫ES抗原，那么，待检样本液迁移至检测线T时，待检样本液没有与检测线T上包被的胶体金标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体结合的成分，从而导致胶体金不会聚集在检测线T上，因此检测线T不会显色，但是质控线C上仍然显色，即此时仅有质控线C显色，表明待检样本液为阴性。检测结果可在5-10钟内做出判断。
[0022]实施例2
对大片形吸虫ES抗原的检测灵敏度的验证测定。按照实施例1所述的检测大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条制备方法制备试纸条。大片形吸虫ES抗原纯化后，用紫外分光光度计测定抗原浓度为 0.94gm/mL，将抗原按 1:200、1:400、1:800，1:1600、1:3200、1:6400、1:12800进行倍比稀释后用试纸条检测，每个稀释度使用三根试纸条检测，并设平行对照，结果见表1.表I 试纸条检测灵敏度测试结果
抗原稀释倍数 200 400 800 1600 3200 6400 12800 抗原浓度(μ g) 47.00 2.35 1.18 0.59 0.29— 一
T线 显色 显色 显色 显色 显色 不显色不显色
C线 显色 显色 显色 显色 显色 显色 显色
从表I的结果可以看出，所述试纸条能检测到大片形吸虫ES抗原的稀释比例为1:3200，即所述试纸条检测大片吸虫ES抗原的最低检测浓度为0.29 u g/ml，证明所述试纸条具有较高的加测灵敏度。
[0023]实施例3
对大片形吸虫ES抗原的特异性验证测定。按照实施例1所述的检测大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条制备方法制备试纸条，用大片吸虫ES抗原，胰扩盘吸虫抗原、前后盘吸虫抗原、弓形虫抗原、伊氏锥虫抗原做特异性试验，并做阴性对照，结果见表2。
[0024]表2 试纸条特异性检测结果
抗原大片形吸虫ES抗原胰扩盘吸虫抗原前后盘吸虫抗原弓形
虫抗原伊氏锥虫抗原
检测线T 显色不显色不显色不显色不显色 质控线C 显色显色显色显色显色
从表2的结果可以看出，只有在检测大片性吸虫ES抗原时，试纸条上的检测线T和质控线C才同时显色为，而检测其他抗原时只有质控线C显色。
[0025]证明用所述的检测大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条检测弓形虫抗原，旋毛虫抗原，巴贝斯焦虫抗原，衣原体抗原时，不与这些抗原发生交叉反应，说明所述的检测大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条具有良好的检测特异性。
[0026]实施例4
临床样本大片形吸虫ES抗原的检测。按照实施例1所述的检测大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条制备方法制备试纸条。在广西南宁地区采集新鲜水牛粪样做为检测样本。样本处理方法:新鲜粪与灭菌双蒸水比1:1(5§+51111)，加入双蒸水后摇匀，30001r/min离心，取上清于_20°C冰箱保存备用。检测时设阳性对照和阴性对照，各样本取60-80 u L样本液直接滴加到各试纸条样品垫3上，5-10min后观察结果，检测线T、质控线C均显色，表示阳性；只有质控线C显色，表示阴性；若只有检测线T显色或没有显示条带，为无效结果。共检测了 334头份样本，在对照成立的前提下，结果试纸条检出阳性129份，临床样本阳性率为 38.62%。
[0027]实施例5
步骤一、制备兔抗小鼠免疫球蛋白抗体:把质量浓度为lmg/mL的小鼠免疫球蛋白与弗氏完全佐剂按1:0.5-1.5比例混匀，按0.5ml-2.0ml /只兔子的剂量对兔子进行脚掌皮下注射免疫；6_8天后，用质量浓度为2mg/ml的小鼠IgG与弗氏不完全佐剂按1:0.5-1.5比例混匀，以0.5ml-2.0ml/只兔子的剂量对上述兔子进行胭淋巴结注射二次免疫；9_11天后，按二次免疫的方法加强免疫一次，免疫后，定期耳静脉采血测定血清效价，血清效价到达后，心脏米血，分尚血清；米用常规的羊酸一饱和硫酸铵法初步纯化纯后，再用portionG蛋白柱进一步纯化；当用常规的琼脂扩散试验测定的兔抗小鼠免疫球蛋白二抗效价为1:104，用BCA蛋白浓度试剂盒测定兔抗小鼠免疫球蛋白二抗浓度为1.22 mg/ml时，兔抗小鼠免疫球蛋白抗体的制备完成，在4°C的条件下保存待用。
[0028]步骤二、然后将兔抗小鼠免疫球蛋白抗体包被在质控线C上，将抗大片形吸虫ES(分泌排泄)抗原的7D4单克朗抗体包被在检测线T上；将质控线C和检测线T分别包被在包被膜4的两端，质控线C和检测线T均能识别大片吸虫ES抗原；
步骤三、以常规的方法进行胶体金的制备和单克隆抗标记； 步骤四、将胶体金和单克隆抗标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体1:5稀释后，以每垫5 μ L-25 μ L的量喷点在标记垫进行包被,然后将标记垫干燥、密封保存,所述抗大片形吸虫的ES抗原的7D1单克隆抗体能特异识别大片形吸虫ES抗原；
步骤五、将玻璃纤维膜制成的样品垫2、聚酯纤维膜制成的标记垫3、硝酸纤维膜制成的包被膜4、粗纤维吸水纸制成的吸水垫5依次搭接粘贴在支撑衬板I上，即得到本大片形吸虫免疫层析快速检测纸条。
[0029]实施例6
步骤Α、包被膜4的制备:
a.用硝酸纤维素膜制成包被膜4，并在包被膜4上同一面靠近标记垫3端设置有检测线T，另一端设置有质控线C ;
b.将抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体稀释至包被浓度为0.15 mg/mL,按包被量为每垫0.5 μ L得到检测包被液，并将其包被在检测线T上，该检测线T能够识别大片吸虫ES抗原；
c.将兔抗小鼠免疫球蛋白抗体稀释至0.10 mg/mL的浓度，按包被量为每垫0.5 μ L得到质控包被液，并将其包被在质控线C上，干燥，密封保存即得包被膜4 ；
步骤B、标记垫3的制备:
a.对抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体进行胶体金的制备和单克隆抗体标记；
b.将胶体金和单克隆抗标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体1:5稀释后，以每垫5μ L的量喷点在标记垫进行包被，然后将标记垫干燥、密封保存即得标记垫3 ；
所述抗大片形吸虫的ES抗原的7D1单克隆抗体能特异识别大片形吸虫ES抗原；
步骤C、样品垫2的制备:
用玻璃纤维膜制成样品垫2 ；
步骤D、将各部件组合成为大片形吸虫免疫层析快速检测纸条:
将包被膜4、标记垫3、样品垫2依次从下往上搭接好后粘贴在支撑衬板I上，最后将吸水垫5搭接包被膜4上，即得到大片形吸虫免疫层析快速检测纸条。
[0030]实施例7
步骤Α、包被膜4的制备:
a.用硝酸纤维素膜制成包被膜4，并在包被膜4上同一面靠近标记垫3端设置有检测线T，另一端设置有质控线C ;
b.将抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体稀释至包被浓度为0.50 mg/mL,按包被量为每垫5 μ L得到检测包被液，并将其包被在检测线T上，该检测线T能够识别大片吸虫ES抗原；
c.将兔抗小鼠免疫球蛋白抗体稀释至0.50 mg/mL的浓度，按包被量为每垫5 μ L得到质控包被液，并将其包被在质控线C上，干燥，密封保存即得包被膜4 ；
步骤B、标记垫3的制备:
a.对抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体进行胶体金的制备和单克隆抗体标记；
b.将胶体金和单克隆抗标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体1:5稀释后，以每垫5 μ L-25 μ L的量喷点在标记垫进行包被，然后将标记垫干燥、密封保存即得标记垫3 ；
所述抗大片形吸虫的ES抗原的7D1单克隆抗体能特异识别大片形吸虫ES抗原； 步骤C、样品垫2的制备:
用玻璃纤维膜制成样品垫2 ；
步骤D、将各部件组合成为大片形吸虫免疫层析快速检测纸条:
将包被膜4、标记垫3、样品垫2依次从下往上搭接好后粘贴在支撑衬板I上，最后将吸水垫5搭接包被膜4上，即得到大片形吸虫免疫层析快速检测纸条。
[0031]实施例8
步骤A、包被膜4的制备:
a.用硝酸纤维素膜制成包被膜4，并在包被膜4上同一面靠近标记垫3端设置有检测线T，另一端设置有质控线C ;
b.将抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体稀释至包被浓度为0.30 mg/mL,按包被量为每垫2.5 y L得到检测包被液，并将其包被在检测线T上，该检测线T能够识别大片吸虫ES抗原；
c.将兔抗小鼠免疫球蛋白抗体稀释至0.30mg/mL的浓度，按包被量为每垫2.5 ii L得到质控包被液，并将其包被在质控线C上，干燥，密封保存即得包被膜4 ；
步骤B、标记垫3的制备:
a.对抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体进行胶体金的制备和单克隆抗体标记；
b.将胶体金和单克隆抗标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体1:5稀释后，以每垫5 V- L-25 V- L的量喷点在标记垫进行包被，然后将标记垫干燥、密封保存即得标记垫3 ；
所述抗大片形吸虫的ES抗原的7D1单克隆抗体能特异识别大片形吸虫ES抗原；
步骤C、样品垫2的制备:
用玻璃纤维膜制成样品垫2 ；
步骤D、将各部件组合成为大片形吸虫免疫层析快速检测纸条:
将包被膜4、标记垫3、样品垫2依次从下往上搭接好后粘贴在支撑衬板I上，最后将吸水垫5搭接包被膜4上，即得到大片形吸虫免疫层析快速检测纸条。
[0032]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条，其特征在于:包括有支撑被衬(I)，该支撑被衬上依次粘贴有包被膜(4)、标记垫(3)和样品垫(2)，在所述支撑被衬(I)的手持端(1-1)粘贴有吸水垫(5);所述标记垫(3)包被有抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体，所述包被膜(4)上前部设有检测线(T)，所述包被膜(4)上后部设有质控线(C)，所述检测线(T)包被有抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体，所述质控线(C)包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗体。
2.根据权利要求1所述的大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条，其特征在于:所述样品垫(2)由玻璃纤维膜制成，所述标记垫(3)由聚酯纤维膜制成，所述包被膜(4)为硝酸纤维素膜，所述吸水垫(5)为粗纤维吸水纸，所述支撑被衬为聚氯乙烯板。
3.根据权利要求1或2所述的大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条，其特征在于:所述标记垫(3)包被的7D1单克隆抗体为胶体金标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体。
4.权利要求1-3所述的大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条的制备方法，其特征在于其制备步骤如下: A、包被膜(4)的制备； a.由硝酸纤维素膜制成包被膜(4)上同一面的两端分别设置有检测线(T)和质控线(C)； b.检测线(T)设置在包被膜(4)的一端，检测线(T)上包被有大片吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体，能够识别大片吸虫ES抗原； c.质控线(C)设置在包被膜(4)的另一端，质控线(C)包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗体； d.将抗大片形吸虫ES抗原的7D4单克隆抗体稀释至包被浓度为0.15 mg/mL -0.50mg/mL,按包被量为每垫0.5 ii L -5 ii L包被至包被膜的检测线(T)上；兔抗小鼠免疫球蛋白抗体稀释至0.10 mg/mL -0.50 mg/mL的浓度,按包被量为每垫0.5 y L -5 u L包被至包被膜的质控线(C)上，干燥，密封保存； B、标记垫(3)的制备； a.以常规的方法进行胶体金的制备和单克隆抗标记； b.将胶体金和单克隆抗标记的抗大片形吸虫ES抗原的7D1单克隆抗体1:5稀释后，以每垫L-25ii L的量喷点在标记垫进行包被,然后将标记垫干燥、密封保存,所述抗大片形吸虫的ES抗原的7D1单克隆抗体能特异识别大片形吸虫ES抗原； C、样品垫(2)的制备； 样品垫(2)由玻璃纤维膜制成； D、将样品垫(2)、标记垫(3 )、包被膜(4 )、吸水垫(5 )依次搭接粘贴在支撑衬板(I)上，即得到本大片形吸虫免疫层析快速检测纸条。
5.根据权利要求4所述的大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条的制备方法，其特征在于: D步骤中将标记垫烘干的温度为36° C-38° C，E步骤中干燥的温度为36° C_38° C。
6.根据权利要求1或4或5所述的大片形吸虫免疫层析快速检测试纸条的制备方法，其特征在于:兔抗小鼠免疫球蛋白抗体的制备方法是，把质量浓度为lmg/mL的小鼠免疫球蛋白与弗氏完全佐剂按1:0.5-1.5比例混匀，按0.5ml-2.0ml /只兔子的剂量对兔子进行脚掌皮下注射免疫；6_8天后，用质量浓度为2mg/ml的小鼠IgG与弗氏不完全佐剂按1:0.5-1.5比例混匀，以0.5ml-2.0ml/只兔子的剂量对上述兔子进行胭淋巴结注射二次免疫；9-11天后，按二次免疫的方法加强免疫一次，免疫后，定期耳静脉采血测定血清效价，血清效价到达后，心脏采血，分离血清；采用常规的辛酸一饱和硫酸铵法初步纯化纯后，再用portion G蛋白柱进一步纯化；当用常规的琼脂扩散试验测定的兔抗小鼠免疫球蛋白二抗效价为1:104，用BCA蛋白浓度试剂盒测定兔抗小鼠免疫球蛋白二抗浓度为1.22 mg/ml时，兔抗小鼠免疫 球蛋白抗体的制备完成，在4°C的条件下保存待用。
【文档编号】G01N33/577GK103454418SQ201310252654
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年6月24日 优先权日:2013年6月24日
【发明者】陈汉忠, 王华俊, 李义平 申请人:广西大学