抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途和试剂盒的制作方法

抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疾病检测试剂盒，该试剂盒包括：人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的载体、作为二抗的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG、作为对照的抗Tif1-γ抗体阳性和抗NXP2抗体阳性的阳性对照品；人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。本发明还提供了抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途，所述抗原组包括Tif1-γ抗原和NXP2抗原，所述疾病为皮肌炎合并肿瘤。本发明提供的疾病检测试剂盒，通过检测患者体内TIF1-γ抗体和抗NXP2抗体的存在，能够高特异性地诊断皮肌炎合并肿瘤，能够用于皮肌炎合并肿瘤的早期诊断，具有广阔的应用前景。
【专利说明】抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途和试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种用于检测疾病的试剂盒和抗原组在 制备诊断疾病的试剂盒中的用途。

【背景技术】
[0002] 特发性炎症性肌病（idiopathic inflammatoiT myopathy, IIM)是一组W骨骼肌 受累为主要表现形式的获得性的异质性疾病，主要包括多发性肌炎（polymyositis,PM)、皮 肌炎（dermatomyositis, DM)和包涵体肌炎（inclusion body myositis, IBM) 3 种类型。临 床实践中观察到IIM合并恶性肿瘤（cancer-associated myositis,CAM)的病例并不少见， 既往国内外的研究显示IIM患者并发肿瘤的风险为6% -70%，其中，DM合并肿瘤的发生率 明显高于PM。合并肿瘤的IIM治疗更困难，死亡率高，是影响患者预后的重要因素，早期发 现肿瘤，积极治疗是改善患者预后的关键。目前，临床上用于肿瘤的筛查方法如肿瘤标记 物、CT、MRI、PET-CT等，它们或是敏感性和特异性差，无法做到早期诊断，或是价格昂贵，不 适合用作筛查的手段。因此，临床上至今尚无简便、实用、敏感而又特异的指标能够早期诊 断和预测肿瘤的发生。
[000引因此，急需开发一种高度敏感及特异的能够用于诊断特发性炎性肌病（IIM)合并 肿瘤的试剂盒。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中没有能够预测及高效诊断特发性炎性肌病患 者伴发恶性肿瘤的筛查手段的缺点，提供一种敏感及高特异性的能够用于诊断特发性炎性 肌病（IIM)合并肿瘤的试剂盒。
[0005] 转录中介因子 a / y (transcriptional intermediary factorl-a / y，TIF1-a / y)是近年来新发现的TIFl家族成员之一，它们是一种与肿瘤相关的自身抗原。TiFl-a可 W通过其N端的RING结构域泛素化P53蛋白，降解该蛋白，从而使其在细胞中的表达水平 降低。TIFl-y抑制转化生长因子（transforming growth factor-目，TGF-目）信号传导通 路上的重要蛋白Smad4,在多种实体瘤的发病中起重要作用。核基质蛋白2 (anti-nuclear matrix protein2, NXP2)参与了活化肿瘤抑制基因p53的过程。
[0006] 本发明的发明人经过多年研究发现在肌炎患者体内可检测到抗TiFl-y抗体，尤 其多见于皮肌炎合并肿瘤患者，因此，通过检测肌炎患者体内TiFl-y抗体的存在能够对 皮肌炎值M)合并肿瘤具有很好的诊断及预测价值；通过在此领域的持续研究，本发明的发 明人进一步发现在部分肌炎患者体内还可W检测到核基质蛋白2(anti-nuclear matrix protein2, NXP2)，通过检测肌炎患者体内NXP2抗体的存在也能够对皮肌炎值M)合并肿瘤 具有很好的诊断及预测价值；发明人更梅喜的发现，当通过将检测肌炎患者体内TiFl-y 抗体的存在和检测肌炎患者体内NXP2抗体的存在联合起来的同时，在患者体内同时检测 至IjTifl-a抗体和TiFl-y抗体时，经后续病理实验证实具有更高的阳性预测值，能够更好 地对患皮肌炎值M)合并肿瘤的患者进行早期诊断和预测。
[0007] 基于本发明发明人的上述发现，本发明提供了一种疾病检测试剂盒，该试剂盒包 括：包被有人IgG、Tif 1- Y抗原和NXP2抗原的载体、作为二抗的碱性磯酸酶标记的羊抗人 IgG、作为对照的抗Tin-Y抗体阳性和抗NXP2抗体同时阳性的阳性对照品；人IgG、所述 Tif 1- Y抗原和所述NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。
[0008] 本发明还提供了抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途，其中，所述抗原组包 括Tif 1- Y抗原和NXP2抗原，优选地包括Tif 1- a抗原、Tif 1- Y抗原和NXP2抗原；所述 疾病为皮肌炎合并肿瘤。
[0009] 本发明提供的疾病检测试剂盒，通过将检测肌炎患者体内TiFl-y抗体的存在和 检测肌炎患者体内NXP2抗体的存在联合起来，经后续病理实验证实能够更好地对患皮肌 炎值M)合并肿瘤的患者进行早期诊断，具有广阔的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0010] 图1所示电泳图谱是含有3401bp目的Tifl-y基因长度的DNA片段的典型电泳 图谱。
[0011] 图2是洗脱下来的Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型的电泳图。
[0012] 图3是抗TIFl-y抗体W及抗FLAG抗体鉴定Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型的蛋 白杂交图。
[001引图4是含有2832bp目的NXP2基因长度的DNA片段的典型电泳图。
[0014] 图5为洗脱的NXP2-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
[0015] 图6为抗NXP2抗体W及抗FLAG抗体鉴定NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交 图。
[0016] 图7为含有3068bp目的Tifl-a基因长度的DNA片段的典型电泳图。
[0017] 图8为洗脱的Tifl-a -FLAG融合蛋白的典型电泳图。
[0018] 图9为抗Tifl-a抗体W及抗FLAG抗体鉴定Tifl-a-FLAG融合蛋白的典型的蛋 白杂交图。
[0019] 图10为检测实施例1的R0C曲线结果图。

【具体实施方式】
[0020] 本发明提供了一种疾病检测试剂盒，其中，该试剂盒包括：包被有人IgG、Tifl-y 抗原和NXP2抗原的载体、作为二抗的碱性磯酸酶标记的羊抗人IgG、作为对照的抗Tif 1- y 抗原的抗体阳性血清和抗NXP2抗原的抗体阳性血清；人IgG、所述Tifl-y抗原和所述 NXP2抗原分别包被在所述载体的不同区域。
[0021] 根据本发明，所述Tifl-y抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0022] 所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDN0. 2所示。
[0023] 根据本发明，所述Tif 1- Y抗原可W通过转基因表达的方式得到，通过转基因技 术来表达目的基因蛋白的方法为本领域技术人员所公知，例如可W通过W下步骤进行表达 和纯化：
[0024] (一）取对数期K562细胞，经典Trizol法提取总RNA，再用Promega逆转录试剂 盒逆转录为cDNA。
[00巧](二）根据Gene ID ;51592所示的序列，用Primers. 0设计引物，上游引物加入酶 切位点Sgf I，下游引物加入酶切位点Mlu I，通过PCR扩增出Tifl-y基因，反应条件为： 模板98C变性2min，再按W下参数反应共35个循环；94°C预变性2min、94°C变性45s、54°C 退火30s、72°C延伸140s、34个循环；最后一个循环72°C、延伸5min，PCR反应产物用lOg/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过PCR获得了含有34(Ubp目的基因长度的DM片段。图1所示 的电泳图谱是含有3401bp目的基因长度的DNA片段的典型电泳图谱。
[0026] 引物Tin-y-Tl;5，-TAGCGATCGCCATGGCGGAAAACAAAGG-3'（沈QIDN0.4)
[0027] Tifl-y-T2 ;5, -CGCACGCGTCTTTATATGTACTGGTCTCTCAT-3,（SEQ ID NO. 5)
[002引 （H )DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
[0029] (四）建立Sgf I和Mlu I双酶切体系，37 °C下过夜酶切PCR产物和 PCMV6-AC-IRES-GFP质粒（带FLAG标签），带FLAG标签的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1。
[0030] 用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后产物，W插入目的片段和质粒载体5 : 1的比 例于16C下T4连接酶催化连接反应5小时。
[0031] (五）采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞，将连接反应的 产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态，接种于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培养 过夜，次日挑取单克隆接入5ml液体含lOOmg/L氨予青霉素LB培养基培养，取1ml菌液送 北京生工公司测序，其余菌液保存于4C。
[0032] (六）将重组质粒的序列鉴定结果进行分析，将插入片段与目的基因序列完全一 致且读码框正确的重组质粒，从菌液中提取出来，采用Lipofectamine2000转染肥K293T细 胞。首先确定G418筛选浓度：按照每孔100个细胞的密度将肥K293T细胞接种到96孔板 中培养，将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中，每个浓 度设3个复孔，观察10-14山使细胞全部死亡的最低G418浓度（lOOOmg/L)，即作为转染后 的筛选浓度。将正常生长的肥K293T细胞接种到6孔板中，2化后待其汇合度达到70-80% 时，使用Lipofectamine2000进行转染；37°C、50血/L C〇2培养箱中培养，转染后化更换含 有100血/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养；2化后按照1 : 4的比例将细胞传代至 新的6孔板中培养；传代后2化，待细胞贴壁后即更换含有lOOOmg/L G418的筛选培养基进 行筛选。稳定转染细胞的单克隆化：加压筛选过程中，每隔2d更换1次培养液，加压后4-7d 后显微镜下可见细胞大量死亡，持续加压至细胞不再死亡，且W团簇的形式生长时即可认 为是阳性细胞，继续加压至阳性克隆铺满6孔板，消化至培养瓶中扩大培养，待到阳性细胞 长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作：预先对96孔板除第 一排之外的所有孔加入100 y L培养液，接着将混合克隆稀释至1X 1〇6个/I，按200 y L/孔 接种于96孔板的第一排，从中吸取100 y L细胞液接种于第二排，混匀后，从第二排中吸取 100 y L接种于第立排，直至第八排，最后一排均丢弃100 y L细胞液，待细胞贴壁生长后，倒 置显微镜下观察，标记只含有1个细胞的培养孔，每天记录细胞生长情况，10?15d后，即可 挑选单克隆细胞株。
[0033] (走）挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化；用预冷的PBS(50mM，抑值7. 2)洗细胞 2 次，W l〇6/ml 的浓度加入细胞裂解液（50mM Tris-肥l(pH 值 8. 0)，150mM NaCl，0. 5% NP-40, ImM PMSFO. 1% DTT，IX蛋白酶抑制剂），重息细胞，冰上赔育30min，12000rpm低温 离也8min，留上清用于聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离也后的上清与经预处理的树 月旨（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴摇床上结合2小时，然后装入层析柱 中，用4C预冷的洗涂缓冲液（TB巧洗涂20倍树脂体积，然后用6ml的洗脱缓冲液化1M甘 氨酸（P册.5))竞争洗脱Tif 1- Y -FLAG融合蛋白，分别入6个含有20 y L的IMTris (P服.0) EP管中，-2(TC保存。图2是洗脱下来的Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
[0034](八）将纯化后的蛋白进行8%聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳，60V30min，120V90min， 半干转至PVDF膜上，转膜条件为15V110min，赔育一抗分别为鼠抗人Tifl-y抗体，抗FLAG 抗体，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，E化发光液显色。图3是抗TIFl-y抗体W及抗FLAG抗体 鉴定Tifl-Y-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
[00巧]根据本发明，所述NXP2抗原可W通过转基因表达的方式得到，通过转基因技术来 表达目的基因蛋白的方法为本领域技术人员所公知，例如：
[0036] (一）取对数期K562细胞，经典Trizol法提取总RNA，再用Promega逆转录试剂 盒逆转录为cDNA。
[0037] (二）根据Gene ID ;23515所示的核巧酸序列，用Primers. 0设计引物，上游引物 加入酶切位点Sgf I，下游引物加入酶切位点Mlu I，通过PCR扩增出NXP2基因，反应条件 为；模板98C变性2min，再按W下参数反应共35个循环；94°C预变性2min、94°C变性45s、 56°C退火30s、72°C延伸110s、34个循环；最后一个循环72°C延伸5min，PCR反应产物用 lOg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过PCR获得了含有2832bp目的基因长度的DNA片段。图4 是含有2832bp目的基因长度的DNA片段的典型电泳图。
[0038] 引物 NXP2-T1 ;5, -TAGCGATCGCCATGGCGGCGCAGCCACCCCG-3'（沈Q ID NO. 6)
[0039] NXP2-T2 ;5, -CGCACGCGAGTACTACTGATTTCACTCATTTGTT-3'（SEQ ID NO. 7)
[0040] ( H )DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
[00川（四）建立Sgf I和Mlu I双酶切体系，37 °C下过夜酶切PCR产物和 PCMV6-AC-IRES-GFP质粒（带FLAG标签），带FLAG标签的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。 [004引用DM凝胶回收试剂盒回收酶切后产物，W插入目的片段和质粒载体5 : 1的比 例于16C下T4连接酶催化连接反应5小时。
[0043] (五）采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞，将连接反应的 产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态，接种于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培养 过夜，次日挑取单克隆接入5ml液体含lOOmg/L氨予青霉素LB培养基培养，取1ml菌液送 北京生工公司测序，其余菌液保存于4C。
[0044] (六）将重组质粒的序列鉴定结果进行分析，将插入片段与目的基因序列完全一 致且读码框正确的重组质粒，从菌液中提取出来，采用Lipofectamine2000转染肥K293T细 胞。首先确定G418筛选浓度：按照每孔100个细胞的密度将肥K293T细胞接种到96孔板 中培养，将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中，每个浓 度设3个复孔，观察10-14山使细胞全部死亡的最低G418浓度（lOOOmg/L)，即作为转染后 的筛选浓度。将正常生长的肥K293T细胞接种到6孔板中，2化后待其汇合度达到70-80% 时使用Lipofectamine2000进行转染；37°C、50血/L C02培养箱中培养，转染后化更换含 有100血/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养；2化后按照1 : 4的比例将细胞传代至 新的6孔板中培养；传代后2化，待细胞贴壁后即更换含有lOOOmg/L G418的筛选培养基进 行筛选。稳定转染细胞的单克隆化：加压筛选过程中，每隔2d更换1次培养液，加压后4-7d 后显微镜下可见细胞大量死亡，持续加压至细胞不再死亡，且W团簇的形式生长时即可认 为是阳性细胞，继续加压至阳性克隆铺满6孔板，消化至培养瓶中扩大培养，待到阳性细胞 长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作；预先对96孔板除第 一排之外的所有孔加入100 y L培养液，接着将混合克隆稀释至1X 1〇6个/I，按200 y L/孔 接种于96孔板的第一排，从中吸取100 y L细胞液接种于第二排，混匀后，从第二排中吸取 100 y L接种于第立排，直至第八排，最后一排均丢弃100 y L细胞液，待细胞贴壁生长后，倒 置显微镜下观察，标记只含有1个细胞的培养孔，每天记录细胞生长情况，l〇-15d后，即可 挑选单克隆细胞株。
[0045] (走）挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化；用预冷的PBS(50mM，抑值7.2)洗细胞 2次，W l〇6/ml的浓度加入细胞裂解液（50mM Tris-肥l(pH值8. 0)，150mM化C1，0. 5% NP-40, ImM PMSFO. 1% DTT，IX蛋白酶抑制剂），重息细胞，冰上赔育30min，12000rpm低温 离也8min，留上清用于聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离也后的上清与经预处理的树 月旨（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴摇床上结合2小时，然后装入层析柱 中，用4°C预冷的洗涂缓冲液（TB巧洗涂20倍树脂体积，然后用6ml的洗脱缓冲液化1M甘 氨酸（P册.5))竞争洗脱NXP2-FLAG融合蛋白，分别入6个含有20yL的lMTris(p服.0化P 管中，-2(TC保存。图5为洗脱的NXP2-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
[0046] (八）将纯化后的蛋白进行8%聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳，60V30min，120V90min， 半干转至PVDF膜上，转膜条件为15V100min，赔育一抗分别为鼠抗人NXP2抗体，抗FLAG抗 体，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，ECL发光液显色。图6为抗NXP2抗体W及抗FLAG抗体鉴定 NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
[0047] 根据本发明，优选情况下，其中，所述载体上还包被有Tifl-a抗原；所述阳性对 照品还呈现抗Tifl-a抗体阳性；所述Tifl-a抗原、人IgG、所述Tifl-y抗原和所述NXP2 抗原分别包被在所述载体的不同区域。在该优选情况下，在患者体内同时检测到Tifl-a 抗体、TiFl-y抗体和NXP2抗体时，经后续病理实验证实能够更好地对患皮肌炎值M)合并 肿瘤的患者进行早期诊断。
[0048] 根据本发明，所述Tifl-a抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0049] 根据本发明，所述Tifl-a抗原可W通过转基因表达的方式得到，通过转基因技 术来表达目的基因蛋白的方法为本领域技术人员所公知，例如可W通过W下步骤进行表达 和纯化：
[0050] (一）取对数期K562细胞，经典Trizol法提取总RNA，再用Promega逆转录试剂 盒逆转录为cDNA。
[00川（二）根据Gene ID ;8805所示的序列，用Primers. 0设计引物，上游引物加入酶 切位点Sgf I，下游引物加入酶切位点Mlu I，通过PCR扩增出Tifl-y基因，反应条件为： 模板98C变性2min，再按W下参数反应共35个循环；94°C预变性2min、94°C变性45s、54°C 退火30s、72°C延伸130s、34个循环；最后一个循环72°C、延伸5min，PCR反应产物用lOg/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过PCR获得了含有3068bp目的基因长度的DM片段。图7所示 的电泳图谱是含有3068bp目的基因长度的DNA片段的典型电泳图谱。
[0052]引物1^-〇-1'1;5，-146〔641'〔6〇：4166466166〔661664-3'（沈9 10側.8)
[005引 Tifl-a-T2 ;5, -CGCAC GCGTTTTAAGCAACTGG CGTTCTTCAAG-3'（SEQ ID NO. 9)
[0054] ( H )DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
[00对（四）建立Sgf I和Mlu I双酶切体系，37 °C下过夜酶切PCR产物和 PCMV6-AC-IRES-GFP质粒（带FLAG标签），带FLAG标签的氨基酸序列为SEQ ID NO. 3。
[005引用DM凝胶回收试剂盒回收酶切后产物，W插入目的片段和质粒载体5 : 1的比 例于16C下T4连接酶催化连接反应5小时。
[0057] (五）采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞，将连接反应的 产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态，接种于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培养 过夜，次日挑取单克隆接入5ml液体含lOOmg/L氨予青霉素LB培养基培养，取1ml菌液送 北京生工公司测序，其余菌液保存于4C。
[0058] (六）将重组质粒的序列鉴定结果进行分析，将插入片段与目的基因序列完全一 致且读码框正确的重组质粒，从菌液中提取出来，采用Lipofectamine2000转染肥K293T细 胞。首先确定G418筛选浓度：按照每孔100个细胞的密度将肥K293T细胞接种到96孔板 中培养，将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中，每个浓 度设3个复孔，观察10-14山使细胞全部死亡的最低G418浓度（lOOOmg/L)，即作为转染后 的筛选浓度。将正常生长的肥K293T细胞接种到6孔板中，2化后待其汇合度达到70-80% 时，使用Lipofectamine2000进行转染；37°C、50血/L C〇2培养箱中培养，转染后化更换含 有100血/L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养；2化后按照1 : 4的比例将细胞传代至 新的6孔板中培养；传代后2化，待细胞贴壁后即更换含有lOOOmg/L G418的筛选培养基进 行筛选。稳定转染细胞的单克隆化：加压筛选过程中，每隔2d更换1次培养液，加压后4-7d 后显微镜下可见细胞大量死亡，持续加压至细胞不再死亡，且W团簇的形式生长时即可认 为是阳性细胞，继续加压至阳性克隆铺满6孔板，消化至培养瓶中扩大培养，待到阳性细胞 长满培养瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作：预先对96孔板除第 一排之外的所有孔加入100 y L培养液，接着将混合克隆稀释至1X 1〇6个/I，按200 y L/孔 接种于96孔板的第一排，从中吸取100 y L细胞液接种于第二排，混匀后，从第二排中吸取 100 y L接种于第立排，直至第八排，最后一排均丢弃100 y L细胞液，待细胞贴壁生长后，倒 置显微镜下观察，标记只含有1个细胞的培养孔，每天记录细胞生长情况，10?15d后，即可 挑选单克隆细胞株。
[0059] (走）挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化；用预冷的PBS(50mM，抑值7. 2)洗细胞 2 次，W l〇6/ml 的浓度加入细胞裂解液（50mM Tris-肥l(pH 值 8. 0)，150mM NaCl，0. 5% NP-40, ImM PMSFO. 1% DTT，IX蛋白酶抑制剂），重息细胞，冰上赔育30min，12000rpm低温 离也8min，留上清用于聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离也后的上清与经预处理的树 月旨（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴摇床上结合2小时，然后装入层析柱 中，用4C预冷的洗涂缓冲液（TB巧洗涂20倍树脂体积，然后用6ml的洗脱缓冲液化1M甘 氨酸（P册.5))竞争洗脱Tif 1- a -FLAG融合蛋白，分别入6个含有20 y L的IMTris (P服.0) EP管中，-2(TC保存。图8是洗脱下来的Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型电泳图。
[0060] (八）将纯化后的蛋白进行8%聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳，60V30min，120V90min， 半干转至PVDF膜上，转膜条件为15V110min，赔育一抗分别为鼠抗人Tin-a抗体，抗FLAG 抗体，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，E化发光液显色。图9是抗TIFl-a抗体W及抗FLAG抗体 鉴定Tin-a -FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
[0061] 根据本发明，所述包被有人IgG、Tin-Y抗原和NXP2抗原的载体可W通过将人 IgG、Tif 1- a抗原、Tif 1- Y抗原和NXP2抗原包被在载体上得到，优选情况下，所述载体上 还包被有Tin-a抗原，所述载体可W为免疫试剂盒领域常用的各种载体，例如，硝酸纤维 膜（NC膜）。将抗原包被在载体上的方法可W为各种常规的用于将抗原包被于载体上的方 法，例如，可W通过W下方法制备；将长方形的NC膜（购自Millipore公司）粘贴在带有粘 性的PVC底板（上海金标生物科技有限公司）中间，放置在划膜仪（上海金标生物科技有 限公司，歷3010单维往复划膜仪）既定的位置上，划膜仪上设有多个加液粟，按照划膜仪的 说明书，向第一个加液粟中灌注液体状的人源的免疫球蛋白（IgG)，第二个加液粟中灌注液 体状的Tif 1-a抗原（优选情况下），第H个加液粟中灌注液体状的Tif 1-Y抗原，第四个 加液粟中灌注液体状的NXP2抗原。启动划膜仪，加液粟开始匀速移动并在硝酸纤维膜中划 线，并依次形成功能质控带W及Tifl-a抗原带（优选情况下）、Tifl-y抗原带和NXP2抗 原带。将硝酸纤维素膜浸泡入含2% BSA的磯酸盐缓冲液中1小时，将整个PVC板在37C 干燥箱中干燥1小时，随后，根据需要用ZQ微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公 司）沿着与各个抗原带垂直的方向上将硝酸纤维素膜裁剪，得到包被有人IgG、Tifl-a抗 原（优选情况下）、Tif 1- Y抗原和NXP2抗原的载体，密封，4°C保存。
[0062] 所述作为对照的抗Tifl-a抗体阳性（优选情况下）、抗Tifl-y抗体阳性和 抗NXP2抗体阳性的阳性对照品可W通过从抗Tifl- a抗体阳性、抗Tifl- Y抗体阳性和 抗NXP2抗体阳性患者血清中提取而得到，例如，取抗Tifl-a抗体与抗Tifl-y抗体同 时阳性的5ml患者血清与抗NXP2抗体阳性的5ml患者血清混合后，与等量的生理盐水混 合，逐滴中性饱和硫酸馈，使其饱和度为50%，室温放置1小时后，离也取沉淀。沉淀用 20ml生理盐水溶解后，逐滴中性饱和硫酸馈，使其饱和度为33%，室温放置1小时后，离也 取沉淀。沉淀用少量生理盐水溶解，即为上述IgG粗制品，然后将IgG粗制品通过重力型 se地adex脱盐柱（上海生工生物工程有限公司，货号BSP090)脱盐，并替换为标准缓冲液 (Southernbiotech，货号0230-01)，最终蛋白浓度约为15mg/ml。得到的阳性对照品通过免 疫印迹法进行验证，方法同前述转基因表达Tifl-a抗原、Tifl-y抗原和NXP2抗原的第 八步骤。
[0063] 所述作为二抗的碱性磯酸酶标记的羊抗人IgG W及人源的IgG可W通过商购得 至Ij，例如Abeam公司生产的油50507货号的碱性磯酸酶标记的羊抗人IgG和Sigma公司生 产的56834货号的人源的IgG。
[0064] 根据本发明，本发明提供的疾病检测试剂盒的使用方法可W包括：
[0065] ( -）使用样本缓冲液分别将患者的血液样本和作为对照的抗Tifl-a抗体 阳性阳性（优选情况下）、抗Tifl-y抗抗体阳性与抗NXP2抗体阳性的阳性对照品， 按照1 : 50-200的比例稀释；使用样本缓冲液将碱性磯酸酶标记的羊抗人IgG,按照 1 : 15000-30000的比例稀释；所述样本缓冲液的种类和组成为本领域技术人员所公知，可 W为免疫检测中各种常规的缓冲液。优选地，本发明提供的疾病检测试剂盒中还包括用作 样本缓冲液的15-25体积％羊血清的磯酸盐缓冲液。更优选地，本发明提供的疾病检测试 剂盒中还包括用作温育设备的温育盘，该温育盘的结构为本领域技术人员所公知，只要能 够用于免疫学检测的温育即可，例如购自Bio-rad公司的温育盘。
[0066] (二）取出包被有人IgG、Tifl-a抗原（优选情况下）、Tifl-y抗原和NXP2 抗原的载体，放入温育设备中，在温育设备中加入样本缓冲液，使液面覆盖包被有人IgG、 Tifl-a抗原（优选情况下）、Tifl-y抗原和NXP2抗原的载体，于室温在摇床上温育5-10 分钟后，除去温育设备中的液体后，加入步骤（一）中经稀释后的患者血清样本，在摇床上 室温温育20-40分钟。
[0067] (H)温育设备中的液体去除掉，在摇床上用清洗缓冲液将步骤（二）中处理后的 包被有人IgG、Tifl-a抗原（优选情况下）、Tifl-y抗原和NXP2抗原的载体清洗3-5次， 每次5-10分钟，所述清洗缓冲液的种类和组成为本领域技术人员所公知，可W为各种用于 免疫学检测的清洗缓冲液。优选情况下，本发明提供的疾病检测试剂盒还可W包括用作清 洗缓冲液的含0. 4-0. 6体积％的吐温20的磯酸盐缓冲液。
[0068] (四）将温育设备中的清洗缓冲液去除掉，加入步骤（一）中经稀释的碱性磯酸酶 标记的羊抗人IgG，于摇床上室温温育20-40分钟。
[0069] (五）将温育设备中的液体去除掉，在摇床上用清洗缓冲液清洗3-5次，每次5-10 分钟。
[0070] (六）将温育设备中的清洗缓冲液去除掉，加入底物液，于摇床上室温温育 5-10分钟，所述底物液的种类和组成为本领域技术人员所公知，可W为各种用于免疫学 检测的底物液。优选情况下，本发明提供的疾病检测试剂盒还可W包括用作底物液的 5-漠-4-氯-3-巧隙基-磯酸盐和四哇硝基蓝（购自Millipore公司；货号203790)。
[0071] (走）将位于设备中的液体吸去，用蒸觸水清洗3-5次，每次1-5分钟，吸水纸吸干 后判断结果。
[0072] 检测结果的判断：
[0073] ( -）通过与上文记载相同的方法进行检测，不同的是使用作为对照的抗Tifl-a 抗体阳性（优选情况下）、抗Tif 1- Y抗体阳性与抗NXP2抗体阳性的阳性对照品替换患者 的血清样本；
[0074] (二）功能质控带出现强的颜色反应说明实验操作正确；
[00巧](H)除功能质控带显色外无其他显色条带判断为阴性；针对Tifl-a抗原带出 现紫色条带即判读为抗Tifl-a抗体阳性（优选情况下）；针对Tif 1-Y抗原带出现紫色 条带即判读为抗Tif 1- y抗体阳性；针对NXP2抗原带出现紫色条带即判读为抗NXP2抗体 阳性。
[0076] 本发明还提供了抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途，其中，所述抗原组包 括Tif 1-Y抗原和NXP2抗原，优选情况下，所述抗原组包括Tifl-a抗原、Tif 1-Y抗原和 NXP2抗原，所述疾病为皮肌炎合并肿瘤。
[0077] 根据本发明，所述Tin- Y抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0078] 其中，所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0079] 其中，所述Tifl-a抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO. 3所示。
[0080] 下面通过实施例的方式对本发明进行更加详细的说明。
[00引]实施例1
[0082] (A)Tifl-y 抗原的制备：
[008引（一）取对数期K562细胞（购自ATCC，货号C化-243)，经典Trizol法提取总RNA， 再用Promega逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
[0084](二）使用上述 cDNA 作为扩增模板，使用由 Tif 1- Y -TU5'-TAGCGATCGCCATGGCGG MAACAMGG-3，，SEQ ID NO. 4)和 Tin - y -T2 (5，-CGCACGCGTCTTTATATGTACTGGTCTCTCAT-3，， SEQ ID NO. 5)组成的引物对，通过PCR扩增出Tifl-y基因，反应条件为：模板98°C变性 2min，再按W下参数反应共35个循环；94°C预变性2min、94°C变性45s、54°C退火30s、72°C 延伸140s、34个循环；最后一个循环72°C、延伸5min，PCR反应产物用lOg/L琼脂糖凝胶电 泳鉴定，鉴定结果如图1所示。
[00财 （H )DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
[0086] (四）建立Sgf I和Mlu I双酶切体系，37 °C下过夜酶切PCR产物和 PCMV6-AC-IRES-GFP 质粒（购自 Origene 公司，货号 PS100027,带 FLAG 标签），用 DNA 凝胶 回收试剂盒回收酶切后产物，W插入目的片段和质粒载体5 : 1的比例于16C下T4连接酶 催化连接反应5小时。
[0087] (五）采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞，将连接反应的 产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态，接种于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培养 过夜，次日挑取单克隆接入5ml液体含lOOmg/L氨予青霉素LB培养基培养，取1ml菌液送 北京生工公司测序，其余菌液保存于4C。
[0088] (六）将重组质粒的序列鉴定结果进行分析，将插入片段与目的基因序列完全一 致且读码框正确的重组质粒，从菌液中提取出来，采用Lipofectamine2000转染肥K293T细 胞。首先确定G418筛选浓度：按照每孔100个细胞的密度将肥K293T细胞接种到96孔板 中培养，将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中，每个浓 度设3个复孔，观察lOd，使细胞全部死亡的最低G418浓度（lOOOmg/L)，即作为转染后的筛 选浓度。将正常生长的肥K293T细胞接种到6孔板中，2化后待其汇合度达到75%时，使用 Lipofectamine2000进行转染；37°C、50mL/L〔化培养箱中培养，转染后化更换含有lOOmL/ L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养；2化后按照1 : 4的比例将细胞传代至新的6孔 板中培养；传代后2化，待细胞贴壁后即更换含有lOOOmg/L G418的筛选培养基进行筛选。 稳定转染细胞的单克隆化；加压筛选过程中，每隔2d更换1次培养液，加压后5d后显微镜 下可见细胞大量死亡，持续加压至细胞不再死亡，且W团簇的形式生长时即可认为是阳性 细胞，继续加压至阳性克隆铺满6孔板，消化至培养瓶中扩大培养，待到阳性细胞长满培养 瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作：预先对96孔板除第一排之外 的所有孔加入100 y L培养液，接着将混合克隆稀释至1 X 1〇6个/I，按200 y L/孔接种于96 孔板的第一排，从中吸取100 y L细胞液接种于第二排，混匀后，从第二排中吸取100 y L接 种于第立排，直至第八排，最后一排均丢弃100 y L细胞液，待细胞贴壁生长后，倒置显微镜 下观察，标记只含有1个细胞的培养孔，每天记录细胞生长情况，15d后，即可挑选单克隆细 胞株。
[008引（走）挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化；用预冷的PBS(50mM，抑值7.。洗细胞2 次，W lOVml的浓度加入细胞裂解液巧OmM Tris-肥1 (抑值8. 0)，150mM化C1，0. 5体积％ NP-40, ImM PMSF，0. 1体积％ DTT)，重息细胞，冰上赔育30min，12000巧m低温离也8min，留 上清用于聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离也后的上清与经预处理的树脂（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴摇床上结合2小时，然后装入层析柱中，用4°C预冷的 洗涂缓冲液（TB巧洗涂20倍树脂体积，然后用6ml的洗脱缓冲液化IM甘氨酸（pH3. 5)) 竞争洗脱Tif 1- Y -FLAG融合蛋白，分别入6个含有20 y L的IMTris (P服.0化P管中，-2(TC 保存。图2是洗脱下来的Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型的电泳图。
[0090] (八）将纯化后的蛋白进行8%聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳，60V30min，120V90min， 半干转至PVDF膜上，转膜条件为15V110min，赔育一抗分别为鼠抗人Tifl-y抗体，抗FLAG 抗体，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，E化发光液显色。图3是抗TIFl-y抗体W及抗FLAG抗体 鉴定Tifl-Y-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
[0091] 根据图3的结果W及质粒测序结果可知，Tifl-y-FLAG融合蛋白的氨基酸序列为 据沈Q IDN0. 1。
[0092] 炬)NXP2抗原的制备：
[0093] (一）取对数期K562细胞（与上文相同），经典Trizol法提取总RNA，再用Promega 逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
[0094] (二）使用上述 cDNA 作为扩增模板，使用由 NXP2-TU5' -TAGCGATCGCCATGGCGGCGC AGCCACCCCG-3，，沈Q ID NO. 6)和 NXP2-T2 巧，-CGCACGCGAGTACTACTGATTTCACTCATTTGTT-3，， SEQ ID N0.7)组成的引物对NXP2基因，反应条件为：模板98C变性2min，再按W下参数反 应共35个循环；94°C预变性2min、94°C变性45s、56°C退火30s、72°C延伸110s、34个循环； 最后一个循环72C延伸5min，PCR反应产物用lOg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果如图4 所示。
[009引 （H )DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
[0096] (四）建立Sgf I和Mlu I双酶切体系，37 °C下过夜酶切PCR产物和 PCMV6-AC-IRES-GFP 质粒（购自 Origene 公司，货号 PS100027,带 FLAG 标签），用 DNA 凝胶 回收试剂盒回收酶切后产物，W插入目的片段和质粒载体5 : 1的比例于16C下T4连接酶 催化连接反应5小时。
[0097] (五）采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞，将连接反应的 产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态，接种于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37°C培养 过夜，次日挑取单克隆接入5ml液体含lOOmg/L氨予青霉素LB培养基培养，取1ml菌液送 北京生工公司测序，其余菌液保存于4C。
[0098] (六）将重组质粒的序列鉴定结果进行分析，将插入片段与目的基因序列完全一 致且读码框正确的重组质粒，从菌液中提取出来，采用Lipofectamine2000转染肥K293T细 胞。首先确定G418筛选浓度：按照每孔100个细胞的密度将肥K293T细胞接种到96孔板 中培养，将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中，每个浓 度设3个复孔，观察lOd，使细胞全部死亡的最低G418浓度（lOOOmg/L)，即作为转染后的筛 选浓度。将正常生长的肥K293T细胞接种到6孔板中，2化后待其汇合度达到75 %时使用 Lipofectamine2000进行转染；37°C、50mL/L C02培养箱中培养，转染后化更换含有lOOmL/ L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养；2化后按照1 : 4的比例将细胞传代至新的6孔 板中培养；传代后2化，待细胞贴壁后即更换含有lOOOmg/L G418的筛选培养基进行筛选。 稳定转染细胞的单克隆化；加压筛选过程中，每隔2d更换1次培养液，加压后5d后显微镜 下可见细胞大量死亡，持续加压至细胞不再死亡，且W团簇的形式生长时即可认为是阳性 细胞，继续加压至阳性克隆铺满6孔板，消化至培养瓶中扩大培养，待到阳性细胞长满培养 瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作：预先对96孔板除第一排之外 的所有孔加入100 y L培养液，接着将混合克隆稀释至1 X 1〇6个/I，按200 y L/孔接种于96 孔板的第一排，从中吸取100 y L细胞液接种于第二排，混匀后，从第二排中吸取100 y L接 种于第立排，直至第八排，最后一排均丢弃100 y L细胞液，待细胞贴壁生长后，倒置显微镜 下观察，标记只含有1个细胞的培养孔，每天记录细胞生长情况，15d后，即可挑选单克隆细 胞株。
[009引（走）挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化；用预冷的PBS(50mM，抑值7.。洗细胞2 次，^1071111的浓度加入细胞裂解液巧01111化13-肥1(抑值8.0)，1501111化(：1，0.5%体积 NP-40, ImM PMSF，0. 1体积％ DTT)，重息细胞，冰上赔育30min，12000巧m低温离也8min，留 上清用于聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离也后的上清与经预处理的树脂（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴摇床上结合2小时，然后装入层析柱中，用4°C预冷的 洗涂缓冲液（TB巧洗涂20倍树脂体积，然后用6ml的洗脱缓冲液化1M甘氨酸（pH3. 5)) 竞争洗脱NXP2-FLAG融合蛋白，分别入6个含有20y L的lMTris(p服.0化P管中，-2(TC保 存。图5是洗脱下来的NXP2-FLAG融合蛋白的典型的电泳图。
[0100] (八）将纯化后的蛋白进行8%聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳，60V30min，120V90min， 半干转至PVDF膜上，转膜条件为15V100min，赔育一抗分别为鼠抗人NXP2抗体，抗FLAG抗 体，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，ECL发光液显色。图6为抗NXP2抗体W及抗FLAG抗体鉴定 NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
[0101] 根据图6的结果W及质粒测序结果可知，NXP2-FLAG融合蛋白的氨基酸序列为据 沈Q IDN0. 2。
[0102] (C)Tifl-a 抗原的制备：
[0103] (一）取对数期K562细胞（购自ATCC，货号C化-243)，经典Trizol法提取总RNA， 再用Promega逆转录试剂盒逆转录为cDNA。
[0104] (二）使用上述cDNA作为扩增模板，使用由Tif 1- a -TU5' -TAGCGATCGCCA TGGAGGTGGCGGTGGA-3，，SEQ ID NO. 8)和 Tifl-a-T2(5，-CGCAC GCGTTTTAAGCAACTGG CGTTCTTCAAG-3'，SEQ ID NO. 9)组成的引物对，通过PCR扩增出Tifl-y基因，反应条件为： 模板98C变性2min，再按W下参数反应共35个循环；94°C预变性2min、94°C变性45s、54°C 退火30s、72°C延伸130s、34个循环；最后一个循环72°C、延伸5min，PCR反应产物用lOg/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果如图7所示。
[0105] ( H ) DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段
[0106] (四）建立Sgf I和Mlu I双酶切体系，37 °C下过夜酶切PCR产物和 PCMV6-AC-IRES-GFP 质粒（购自 Origene 公司，货号 PS100027,带 FLAG 标签），用 DNA 凝胶 回收试剂盒回收酶切后产物，W插入目的片段和质粒载体5 : 1的比例于16C下T4连接酶 催化连接反应5小时。
[0107] (五）采用Inoue方法制备Rosetta-gami B大肠杆菌感受态细胞，将连接反应的 产物转化Rosetta-gami B大肠杆菌感受态，接种于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培养 过夜，次日挑取单克隆接入5ml液体含lOOmg/L氨予青霉素LB培养基培养，取1ml菌液送 北京生工公司测序，其余菌液保存于4C。
[010引（六）将重组质粒的序列鉴定结果进行分析，将插入片段与目的基因序列完全一 致且读码框正确的重组质粒，从菌液中提取出来，采用Lipofectamine2000转染肥K293T细 胞。首先确定G418筛选浓度：按照每孔100个细胞的密度将肥K293T细胞接种到96孔板 中培养，将G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的浓度梯度加入到孔中，每个浓 度设3个复孔，观察lOd，使细胞全部死亡的最低G418浓度（lOOOmg/L)，即作为转染后的筛 选浓度。将正常生长的肥K293T细胞接种到6孔板中，2化后待其汇合度达到75%时，使用 Lipofectamine2000进行转染；37°C、50mL/L〔化培养箱中培养，转染后化更换含有lOOmL/ L新生牛血清的DMEM-H培养液继续培养；2化后按照1 : 4的比例将细胞传代至新的6孔 板中培养；传代后2化，待细胞贴壁后即更换含有lOOOmg/L G418的筛选培养基进行筛选。 稳定转染细胞的单克隆化；加压筛选过程中，每隔2d更换1次培养液，加压后5d后显微镜 下可见细胞大量死亡，持续加压至细胞不再死亡，且W团簇的形式生长时即可认为是阳性 细胞，继续加压至阳性克隆铺满6孔板，消化至培养瓶中扩大培养，待到阳性细胞长满培养 瓶即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作；预先对96孔板除第一排之外 的所有孔加入100 y L培养液，接着将混合克隆稀释至1 X 106个/I，按200 y L/孔接种于96 孔板的第一排，从中吸取100 y L细胞液接种于第二排，混匀后，从第二排中吸取100 y L接 种于第立排，直至第八排，最后一排均丢弃100 y L细胞液，待细胞贴壁生长后，倒置显微镜 下观察，标记只含有1个细胞的培养孔，每天记录细胞生长情况，15d后，即可挑选单克隆细 胞株。
[010引（走）挑取单克隆扩增后提取蛋白纯化；用预冷的PBS(50mM，抑值7.。洗细胞2 次，W lOVml的浓度加入细胞裂解液（50mM Tris-肥1 (抑值8. 0)，150mM化C1，0. 5体积％ NP-40, ImM PMSF，0. 1体积％ DTT)，重息细胞，冰上赔育30min，12000巧m低温离也8min，留 上清用于聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳和纯化。将离也后的上清与经预处理的树脂（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴摇床上结合2小时，然后装入层析柱中，用4°C预冷的 洗涂缓冲液（TB巧洗涂20倍树脂体积，然后用6ml的洗脱缓冲液化1M甘氨酸（pH3. 5)) 竞争洗脱Tif 1- a -FLAG融合蛋白，分别入6个含有20 y L的IMTris (P服.0化P管中，-2(TC 保存。图8是洗脱下来的Tifl-a -FLAG融合蛋白的典型的电泳图。
[0110] (八）将纯化后的蛋白进行8%聚丙帰醜胺凝胶蛋白电泳，60V30min，120V90min， 半干转至PVDF膜上，转膜条件为15V110min，赔育一抗分别为鼠抗人Tin-a抗体，抗FLAG 抗体，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，E化发光液显色。图9是抗TIFl-a抗体W及抗FLAG抗体 鉴定Tifl-a -FLAG融合蛋白的典型的蛋白杂交图。
[0111] 根据图9的结果W及质粒测序结果可知，Tifl-a-FLAG融合蛋白的氨基酸序列为 据沈Q IDN0. 3。
[011引 值）包被有人IgG、Tifl-a抗原、Tifl-y抗原和NXP2抗原的载体的制备：
[0113] 将硝酸纤维膜（Millipore公司，商品名；HF120)放置在划膜仪（上海金标生物科 技有限公司，歷3010单维往复划膜仪）既定的位置上，划膜仪上设有多个加液粟，按照划 膜仪的说明书，向第一个加液粟中灌注浓度为5mg/ml人源的免疫球蛋白（IgG)，第二个加 液粟中灌注步骤（A)中得到的Tifl-a抗原（用磯酸缓冲液（pH7. 4)将步骤（A)得到的 Tifl-y抗原稀释至5mg/ml)、第H个加液粟中灌注步骤（A)中得到的Tifl-y抗原（用磯 酸缓冲液（pH7. 4)将步骤（A)得到的Tifl-y抗原稀释至5mg/ml)、第四个加液粟中灌注 步骤炬）中得到的NXP2抗原（用磯酸缓冲液（PH7.4)将步骤炬）得到的NXP2抗原稀释至 5mg/ml)。启动划膜仪，加液粟开始匀速移动并在硝酸纤维膜中划线，划膜仪的速度为1 y 1/ cm,并依次形成功能指控带W及Tifl-y抗原带和NXP2抗原带。随后，沿着与各个抗原带 垂直的方向上将硝酸纤维素膜裁剪为4mm宽的试纸条，得到包被有人IgG、Tifl-a抗原、 Tifl- y抗原和NXP2抗原的载体，将切好的试纸条与干燥剂封装在铅铅袋内保存在4°C待 用。
[0114] 巧）抗Tifl-a抗体阳性、抗Tifl-y抗体阳性和抗NXP2抗体阳性的阳性对照 品的制备；取抗Tifl-a抗体与抗Tifl-Y抗体同时阳性的5ml患者血清与抗NXP2抗体 阳性的5ml患者血清混合后，与等量的生理盐水混合，逐滴中性饱和硫酸馈，使其饱和度为 50%，室温放置1小时后，离也取沉淀。沉淀用20ml生理盐水溶解后，逐滴中性饱和硫酸馈， 使其饱和度为33%，室温放置1小时后，离也取沉淀。沉淀用少量生理盐水溶解，即为上述 IgG粗制品，然后将IgG粗制品通过重力型se地adex脱盐柱（上海生工生物工程有限公司， 货号BSP090)脱盐，并替换为标准缓冲液（Southernbiotech，货号0230-01)，最终蛋白浓度 约为15mg/ml。得到的阳性对照品通过免疫印迹法进行验证，阳性对照品为抗Tifl-a抗体 阳性、抗Ti f 1 - Y抗体阳性和抗NXP2抗体阳性。
[0115] (巧疾病检测试剂盒的制备：
[0116] 将步骤值）制得的包被有人IgG、Tifl-a抗原、Tifl-y抗原和NXP2抗原的载体、 步骤巧）制得的抗TIF1-a抗体、抗Tifl-y抗体和抗NXP2抗体阳性的阳性对照品，及作 为二抗的碱性磯酸酶标记的羊抗人IgG (同上），组合在一起制得疾病检测试剂盒1。
[0117] 实施例2
[0118] 根据与实施例1相同的方法制备疾病检测试剂盒2,不同在于该试剂盒中还包括： 用作样本缓冲液的20体积％羊血清的磯酸盐缓冲液、用作清洗缓冲液的含0. 5体积％的吐 温20的磯酸盐缓冲液、用作底物液的5-漠-4-氯-3-剛巧基-磯酸盐和四哇硝基蓝（购 自Millipore公司；货号203790)、W及购自Bio-rad公司的温育盘。
[011引检测实施例1
[0120] (A)患者
[0121] 特发性炎性肌病（IIM)组：选取患者211例，其中男性64例，女性147例，年龄6? 82岁，平均（47 + 17)岁，病程0. 5?218月，平均（24 + 39)月，其中多肌炎（polymyositis, PM) 55例，皮肌炎（dermatomyositis，DM) 156例。对所有患者进行随访，平均随访 (4. 5 + 2. 6)年。PM中单纯PM为52例，PM合并肿瘤3例。DM中包括经典皮肌炎（Classic dermatomyositis'CDM) 123例，无肌病性皮肌炎（Clinical amyopathic dermatomyositis, CADM)11 例，儿童皮肌炎（Juvenile dermatomyositis, JDM)8 例，DM 合并肿瘤 14 例。PM, CDM及JDM患者均符合Bohan/Peter诊断标准，且JDM的发病年龄小于18岁，CADM患者符合 Sontheimer?诊断标准（即有典型皮肌炎皮肤病变或皮肌炎样皮肤病变，但无肌病表现， 时间超过6个月W上）。肌炎合并肿瘤患者中对于恶性肿瘤的诊断均依据相应的临床诊断 标准。
[0122] 其他结缔组织病组；系统性红斑狼疮（SL巧患者70例，男性14例，女性56例，年 龄16?76岁，平均（46 + 17)岁。类风湿关节炎（RA)患者60例，男性16例，女性44例， 年龄25?85岁，平均（53 + 17)岁。干燥综合征做）患者46例，男性16例，女性30例， 年龄20?82岁，平均（49 + 16)岁。硬皮病（SSc)患者14例，男性4例，女性10例，年龄 20?72岁，平均（41 + 16)岁。均符合相应的疾病诊断分类标准，且各组年龄分布上与特发 性炎性肌病（IIM)组差异无统计学意义（P > 0. 05)。
[0123] 健康对照组；选取年龄、性别相匹配的健康正常人共40例，其中男性12例，女性 28例，年龄18?71岁，平均年龄（47 + 16)岁。
[0124] 炬）检测
[0125] 获得上述3组患者的血清，并按照1 : 100的比例使用样本缓冲液（含20体积％ 羊血清的磯酸盐缓冲液）稀释，得到待测血清样品。
[0126] 通过实施例1建立的试剂盒检测上述3组患者的血清样品，211例特发性炎性肌 病（IIM)组患者中抗TIFl-y W及抗NXP2抗体水平，发现共有28例患者抗TIFl-y抗体 阳性，且均为DM患者，阳性率为13. 3%。共有8例患者抗NXP-2抗体阳性，其中PM患者为 2例，DM患者为6例，阳性率为3. 8%，其他结缔组织病（SLE，RA，SS，SSc)及健康对照组的 抗TIFl-y W及抗NXP2抗体阳性率均为0%。研究发现上述两种抗体均独立存在，并且不 同时存在于相同患者中。
[0127] DM组中抗TIF1- Y抗体阳性的血清共28例，总阳性率为17. 9 %，其中单纯DM组共 13例，阳性率为10. 6% ;CADM组共4例，阳性率为36. 4% JDM组共2例，阳性率为25%，DM 合并肿瘤组共9例，阳性率为64. 3%。PM组中血清抗TIFl-y抗体均阴性。DM组中抗NXP2 阳性的血清共6例，总阳性率为3. 8%，其中单纯DM组共1例，阳性率为0. 8% ;CADM组共0 例，阳性率为0% JDM组共2例，阳性率为25%，DM合并肿瘤组共3例，阳性率为21. 4%。 PM组中血清抗NXP2抗体为2例，均为单纯PM。
[0128] 如上所述，抗TIFl-y抗体阳性诊断DM合并肿瘤的敏感性为64. 3%，特异性为 86. 6 %。阳性预测值为32. 1 %，阴性预测值为96. 1 %，而抗NXP2抗体阳性诊断DM合并肿 瘤的敏感性为21. 4%，特异性为97. 9%，阳性预测值为50. 0%，阴性预测值为92. 7%。
[0129] 采用并联试验诊断DM合并肿瘤，即抗TIFl-y抗体与抗NXP2抗体中任何一种抗 体阳性即诊断DM合并肿瘤阳性（联合诊断组），其敏感性和特异性分别为85. 7%，84. 5%， 阳性预测值与阴性预测值分别为35. 3%，98. 4%，利用R0C曲线下面积对上述3种方法 诊断DM合并肿瘤的绩效进行评价，对应的曲线下面积分别为0.76,0. 60,0. 85,且单纯抗 TIF1-Y抗体阳性组，单纯抗NXP2抗体阳性组与联合诊断组相较差异具有显著性，联合诊 断具有更高的诊断绩效，结果见图10。
[0130] 由此说明，使用本发明的包含所述Tifl-y抗原和所述NXP2抗原的试剂盒，通过 将检测肌炎患者体内TiFl- Y抗体的存在和检测肌炎患者体内NXP2抗体的存在联合起来， 经后续病理实验证实能够更好地对患皮肌炎值M)合并肿瘤的患者进行早期诊断。
[0131] 此外，研究还发现共有7例患者抗TIFl-a抗体与抗TIFl-y抗体同时阳性，8例 患者血清中仅单独存在抗TIFl-a抗体。DM组中抗TIFl-a抗体阳性的血清共11例，总 阳性率为7. 1 %，其中单纯DM组共4例，阳性率为3. 3% ;CADM组共1例，阳性率为9. 1 % ; JDM组共0例，阳性率为0%，DM合并肿瘤组共6例，阳性率为42.9%。PM组中抗TIFl-a 抗体共4例，总阳性率为7. 3%，为单纯PM患者。进一步分析后发现抗TIFl-a抗体与抗 TIFl-y抗体同时阳性组合并肿瘤的发生率显著高于单纯抗TIFl-y抗体阳性组与单纯抗 NXP2阳性组，差异有统计学意义（P < 0. 05)。采用串联试验诊断DM合并肿瘤，即抗TIF1- a 与抗TIFl-y抗体同时阳性才诊断为DM合并肿瘤阳性，其敏感性和特异性分别为42. 9%和 99. 3%，阳性预测值与阴性预测值为85. 7%和94. 6%。
[0132] 由此说明，若抗TIFl-y抗体与抗NXP2抗体中任何一种抗体阳性，可提高皮肌炎 合并恶性肿瘤的诊出率，在优选情况下，抗TIFl-a抗体与抗TIFl-y抗体同时阳性具有更 高的阳性预测值，尤其需要对该部分患者是否合并恶性肿瘤进行密切筛查和随访，因此抗 TIF1-a抗体、抗TIFl-y抗体和抗NXP2抗体的同时检测对皮肌炎患者合并恶性肿瘤具有 很高的诊断价值。
【权利要求】
1. 一种疾病检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：包被有人igG、Tin-y抗原和 NXP2抗原的载体、作为二抗的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG、作为对照的抗Tin- Y抗体阳 性和抗NXP2抗体阳性的阳性对照品；人IgG、所述Tif 1- Y抗原和所述NXP2抗原分别包被 在所述载体的不同区域。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述Tifl-Y抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述载体上还包被有Tifl-a抗原；所述 Tifl-a抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述阳性对照品还呈现抗Tifl-a抗体 阳性；所述Tifl-a抗原、人IgG、所述Tifl-Y抗原和所述NXP2抗原分别包被在所述载体 的不同区域。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包括：用作样本缓冲液的15-25体 积％的羊血清的磷酸盐缓冲液；用作清洗缓冲液的含〇. 4-0. 6体积％的吐温20的磷酸盐缓 冲液；和，用作底物液的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐和四唑硝基蓝。
5. 根据权利要求1或4所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包括：用于孵育硝酸纤维膜， 抗原抗体反应的温育盘。
6. 根据权利要求1或3所述的试剂盒，其中，所述阳性对照品通过从抗体阳性的患者血 清中提取制备。
7. 根据权利要求1或6所述的试剂盒，其中，所述载体为硝酸纤维膜。
8. 抗原组在制备诊断疾病的试剂盒中的用途，其中，所述抗原组包括Tifl-Y抗原和 NXP2抗原，优选地所述抗原组包括Tifl-a抗原、Tifl-Y抗原和NXP2抗原；所述疾病为皮 肌炎合并肿瘤。
9. 根据权利要求8所述的用途，其中，所述Tifl-y抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示；所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
10. 根据权利要求8或9所述的用途，其中，所述Tifl-a抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
【文档编号】G01N33/544GK104422763SQ201310373063
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】卢昕, 王国春, 杨阚波, 彭清林, 舒晓明 申请人:中日友好医院