一种基于发光细菌检测单一兽药的方法
【专利摘要】本发明提供一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，包括以下几步：（1）用0.5mlNaCl无菌溶液将保存于-20℃的发光细菌冻干粉溶解，迅速转入100ml发光细菌培养液中，22℃下培养20h，连续培养3代后，取1ml菌液涂布于固体平板，22℃培养20h后，备用；（2）将步骤（1）中培养的发光细菌用5mlNaCl无菌溶液制成菌悬液，备用；（3）配置一系列浓度的兽药溶液2.0ml加入专用检测杯中，同时以2.0mlNaCl无菌溶液做空白对照，每个浓度梯度和空白均设3个重复，取10μL发光细菌的菌悬液分别加入样品和对照杯中，充分振荡均匀，15min后测定发光细菌的发光强度。本发明的检测结果完全能够满足对磺胺类兽药残留检测，该方法前处理简单、成本低廉且可对兽药等物质实现快速检测。
【专利说明】一种基于发光细菌检测单一兽药的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽药检测方法，具体而言，涉及一种基于发光细菌检测单一兽药的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着农牧业的发展，兽药、农药和添加剂的滥用造成畜产品有害物质残留严重超标，不仅给消费者身体健康带来潜在危害，还影响畜牧业发展，兽药残留的检测技术也越来越受到关注。目前，国内外多采用液相、液质联用等技术来检测兽药残留，但是这些技术存在操作复杂、时间长、检测成本较高等不足，而且不适宜在线检测。
[0003]为了解决上述问题，现在采用发光细菌检测法，采用发光细菌检测的前处理简单，成本低廉，对兽药的检测速度较快，同时也可对大气、土壤、水环境、食物等进行综合生物毒性评价。现在常用费氏弧菌作为毒性测试菌种，但是该类发光菌检测存在局限性，检测前需向淡水样品添加NaCl，而有些样品因为添加了 NaCl导致生物毒性发生改变，使检测结果不准确。
【发明内容】
[0004]本发明解决了现有技术中的不足，提供一种前处理简单、成本低廉且可快速检测兽药残留的方法。
[0005]本发明的技术方案为:一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，包括以下几步: (O发光细菌培养:用0.5mlNaCl无菌溶液将保存于_20°C的发光细菌冻干粉溶解，迅
速转入IOOml发光细菌培养液中，22°C下培养20h，连续培养3代后，取Iml菌液涂布于固体平板，22 °C培养20h后，备用；
(2)菌液制备:将步骤(I)中培养的发光细菌用5mlNaCl无菌溶液制成菌悬液，备用；
(3)配置一系列浓度的兽药溶液2.0ml加入专用检测杯中，同时以2.0mlNaCl无菌溶液做空白对照，每个浓度梯度和空白均设3个重复，取10 μ L发光细菌的菌悬液分别加入样品和对照杯中，充分振荡均匀，15min后测定发光细菌的发光强度。
[0006]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述发光细菌为明亮发光杆菌T3。
[0007]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，制备所述的发光细菌培养液的步骤如下:称取5g酵母膏、5g胰蛋白胨、30gNaCl、5gNa2HP、5gKH2P04、3g甘油、1000ml蒸懼水,混合均匀调节pH至7±0.5°C，在121°C下高压灭菌15min，制成发光细菌的培养液。
[0008]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述NaCl无菌溶液的浓度为30g/L。
[0009]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述菌悬液的OD值为0.8?1.0。
[0010]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述一系列浓度的兽药溶液为3000、300、30、3、0.3、0.03、0.003mg/L。
[0011]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述兽药为磺胺类的磺胺间甲氧嘧啶钠。[0012]本发明的解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果:
本发明的方法中，在常温下，不同浓度磺胺间甲氧嘧啶钠与明亮发光杆菌T3接触后，随着磺胺间甲氧嘧啶钠质量浓度降低，明亮发光杆菌T3相对发光强度增强，表明磺胺间甲氧嘧啶钠质量浓度降低，对明亮发光杆菌T3发光抑制性越弱。本发明的检测结果完全能够满足对磺胺类兽药残留检测，该方法前处理简单、成本低廉且可对兽药等物质实现快速检测。
【具体实施方式】
[0013]为了使本【技术领域】的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例
[0014](I)制备发光细菌培养液的步骤如下:称取5g酵母膏、5g胰蛋白胨、30gNaCl、5gNa2HP、5gKH2P04、3g甘油、1000ml蒸馏水，混合均匀调节pH至7±0.5°C，在121°C下高压灭菌15min，制成发光细菌的培养液。
[0015](2)发光细菌培养:用0.5ml30g/L NaCl无菌溶液将保存于_20°C的明亮发光杆菌T3冻干粉溶解，迅速转入IOOml发光细菌培养液中，22°C下培养20h，连续培养3代后，取Iml菌液涂布于固体平板,22°C培养20h后,备用。
[0016](3)菌液制备:将步骤(2)中培养的明亮发光杆菌T3用5mlNaCl无菌溶液制成OD值为0.8?1.0菌悬液，备用。
[0017](4)配置3000、300、30、3、0.3,0.03,0.003mg/L 一系列浓度的磺胺间甲氧嘧啶钠溶液2.0ml加入专用检测杯中，同时以2.0ml30g/L NaCl无菌溶液做空白对照，每个浓度梯度和空白均设3个重复，取IOyL明亮发光杆菌T3的菌悬液分别加入样品和对照杯中，充分振荡均匀，15min后测定明亮发光杆菌T3的发光强度。
[0018]检测结果
在常温下，明亮发光杆菌T3的菌悬液与一系列浓度磺胺间甲氧嘧啶钠溶液接触15min，测定明亮发光杆菌T3的发光强度，计算出相对广发强度。重复组的标准偏差低于10%。
[0019]3000、300、30、3、0.3,0.03,0.003mg/L 一系列浓度的磺胺间甲氧嘧啶钠溶液对应的相对发光强度分别为:0%、4%、27%、73%、89%、100%、100%。如结果所示，随着磺胺间甲氧嘧啶钠质量浓度降低，明亮发光杆菌T3相对发光强度增加，说明磺胺间甲氧嘧啶钠质量浓度越低，对明亮发光杆菌T3发光抑制性越弱。
[0020]相对发光强度(％)=样品发光强度X 100%/对照发光强度。
[0021]当磺胺间甲氧嘧啶钠的质量浓度低于0.lmg/L时，明亮发光杆菌T3相对发光强度在100%左右，说明低浓度磺胺间甲氧嘧啶钠对明亮发光杆菌T3无抑制作用。可以得出明亮发光杆菌T3检测磺胺间甲嘧啶钠最小检出限为lOOyg/L，满足对磺胺类兽药检测的要求。
[0022]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，其特征在于，包括以下几步: (O发光细菌培养:用0.5mlNaCl无菌溶液将保存于_20°C的发光细菌冻干粉溶解，迅速转入IOOml发光细菌培养液中，22°C下培养20h，连续培养3代后，取Iml菌液涂布于固体平板，22 °C培养20h后，备用； (2)菌液制备:将步骤(I)中培养的发光细菌用5mlNaCl无菌溶液制成菌悬液，备用； (3)配置一系列浓度的兽药溶液2.0ml加入专用检测杯中，同时以2.0mlNaCl无菌溶液做空白对照，每个浓度梯度和空白均设3个重复，取10 μ L发光细菌的菌悬液分别加入样品和对照杯中，充分振荡均匀，15min后测定发光细菌的发光强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，其特征在于，所述发光细菌为明亮发光杆菌T3。
3.根据权利要求1或2任一项所述的一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，其特征在于，制备所述的发光细菌培养液的步骤如下:称取5g酵母膏、5g胰蛋白胨、30gNaCl、5gNa2HP、5gKH2P04、3g甘油、1000ml蒸馏水，混合均匀调节pH至7±0.5°C，在121°C下高压灭菌15min，制成发光细菌的培养液。
4.根据权利要求1所述的一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，其特征在于，所述NaCl无菌溶液的浓度为30g/L。
5.根据权利要求1所述的一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，其特征在于，所述菌悬液的OD值为0.8?1.0。
6.根据权利要求1所述的一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，其特征在于，所述一系列浓度的兽药溶液为 3000、300、30、3、0.3,0.03,0.003mg/L。
7.根据权利要求6所述的一种基于发光细菌检测单一兽药的方法，其特征在于，所述兽药为磺胺类的磺胺间甲氧嘧啶钠。
【文档编号】G01N1/28GK103499568SQ201310456189
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】杨晶晶 申请人:苏州国环环境检测有限公司