一种基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法
【专利摘要】本发明是一种基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法，该方法利用了水溶性聚合物对DNA链构象变化敏感，以及核酸适配体具有特异性结合能力等特点，设计了一种基于水溶性共轭聚合物/核酸适配体的超分子检测平台。当溶液中不存在凝血酶或存在其他非特异性蛋白时，这两段序列不能形成G-四链体结构，复合物与聚合物的之间的距离较近，从而能与聚合物发生有效的能量转移；当溶液中存在凝血酶时，凝血酶将诱导这两段序列形成G-四链体结构，增加了复合物与聚合物的之间的距离，从而不能发生有效的能量转移。本发明方法简便、快速、具有较高的灵敏度和选择性，在凝血酶检测方面具有重要的意义。
【专利说明】一种基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感及分析领域，特别涉及一种利用拆分适配体和水溶性共轭聚合物检测凝血酶的荧光检测方法。
【背景技术】
[0002]凝血酶是一种由凝血酶前体(血浆中的必要成分)形成的蛋白质水解酶，能催化纤维蛋白原变成纤维蛋白而促使血液凝固。凝血酶的检测对临床疾病的诊断、病程发展、预后以及疗效的监测和评估等都具有较重要的意义。
[0003]由于凝血早期产生的凝血酶很快被体内的抗凝物质中和，故直接测定凝血酶非常困难。临床上凝血酶检测多用间接检测的方法，即通过检测凝血酶激活至血栓形成过程中的特定凝血标志物来反映凝血酶的生成。传统的间接检测方法有纤维蛋白肽A(FPA)测定，可溶性纤维蛋白单体复合物(SFMC)测定，凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)测定等。这些检测法应用较为广泛，但其特异性和灵敏度相对较低。
[0004]基于适配体与聚合物作用的凝血酶直接检测法灵敏度和特异性较高，可为临床提供更多、更为直观的实验室数据。然而，完整的凝血酶适配体碱基数目较多，自身容易形成二级结构，在进行检测前需要进行加热去除二级结构，使得操作繁琐；此外，还存在空白样品背景较高等问题，这些因素都会影响检测的准确性和灵敏度。相比而言，拆分的凝血酶适配体，碱基数量较少，自身不易形成二级结构，从而可以减少操作步骤，降低空白样品的背景。本发明的研究，以聚对苯撑乙炔为信号放大工具，以拆分的凝血酶适配体为识别探针，以荧光检测为主要分析手段，实现了对凝血酶的高灵敏度检测。这种灵敏度高、特异性好、操作简便、检测快、成本低的生物传感策略，将为该领域今后的发展提供有价值的理论和实验依据。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是针对现有的凝血酶检测方法存在的不足，提供一种利用拆分适配体和水溶性共轭聚合物检测凝血酶的荧光方法，其具有较高的特异性和灵敏度。
[0006]本发明基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物检测凝血酶的方法，包括以下步骤:
a.将适配体片段1、适配体片段2和水溶性共轭聚合物按摩尔比1:1:5?10混合，形成适配体/聚合物的复合物，然后加入到缓冲溶液中，以404 nm为激发波长，进行荧光检测，记录该复合物的荧光发射谱带，并计算其525 nm与440 nm处荧光强度的比值1525/144(| ;其中，所述适配体片段I或者适配体片段2上标记有染料；
b.将适配体片段I和适配体片段2及含凝血酶的待测样品加入到结合液中进行反应，形成凝血酶/适配体复合物；适配体片段I和适配体片段2的摩尔比1:1，凝血酶的量是可变的，最小为零，最大时与适配体的量相同。[0007]c.向上述复合物中加入水溶性共轭聚合物，凝血酶/适配体复合物与水溶性共轭聚合物的摩尔比为O?1:5(此处适配体的量是固定的，含凝血酶的待测样品中凝血酶的量是可变的，最小为零，最大时与适配体的量相同，所以凝血酶/适配体复合物的量按照凝血酶的量来计，所以凝血酶/适配体复合物与水溶性共轭聚合物的摩尔比为O?1:5)，凝血酶诱导适配体片段I和适配体片段2形成G-四链体结构，从而不能形成适配体/聚合物的复合物，然后加入到缓冲溶液中，以404 nm为激发波长，进行荧光检测，计算其525 nm与440 nm处荧光强度的比值1525/144(1，其1525/144(1比值下降，根据1525/144(1比值下降的程度实现对凝血酶的定性及定量检测。
[0008]其中:所述的适配体为凝血酶特异性单链寡核苷酸，适配体片段I的碱基组成为:5’ -FITC-GGTTGGTG-3’ ；适配体片段 2 的碱基组成为:5’ -TGGTTGG-3’。
[0009]步骤a)所述适配体片段I或者适配体片段2上标记有染料，所述染料为荧光素或异硫氰酸荧光素；染料标记在适配体片段I的5’端或者适配体片段2的3’端。
[0010]所用缓冲溶液为0.1M NaHCO3,0.1M Na2CO3, pH = 10.6 ;所用荧光检测方法为:将
2.5 μ L水溶性共轭聚合物、2.5 μ L适配体片段I和2.5 μ L适配体片段2的溶液加入到500μ L缓冲溶液中进行突光发射光谱的扫描,激发波长为404 nm,发射波长扫描范围为420 —650 nm。适配体片段I的浓度为10 μ M、适配体片段2的浓度为10 μ Μ、水溶性共轭聚合物的浓度为50 μ Mo
[0011]适配体片段1、2以及水溶性共轭聚合物都是溶解在水中配成的溶液。
[0012]步骤b)所述的凝血酶/适配体复合物的形成，是在凝血酶的诱导下，通过非共价键相互作用使两段适配体片段形成G-四链体结构；将凝血酶加入到含有适配体的结合液中，37°C放置 40 分钟；所用结合液为 140 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH = 8.0。
[0013]所述的荧光信号用荧光分光光度计进行检测，激发波长为404 nm，发射波长扫描范围为 420 — 650 nm。
[0014]有益效果:根据本发明所述的荧光检测方法，可实现对凝血酶的检测。当体系中含有其它酶或蛋白质时，仍然可以实现对其高灵敏度检测。因此，本发明方法有望为实际临床样品中凝血酶的检测提供一种简便、快速的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明利用拆分适配体和水溶性共轭聚合物检测凝血酶的荧光检测方法的工作原理图。
[0016]图2为本发明利用拆分适配体和水溶性共轭聚合物检测凝血酶的可行性分析图。a为聚合物+全长凝血酶适配体；b为聚合物+全长凝血酶适配体+凝血酶；c为聚合物+拆分适配体1+拆分适配体2 ；d为聚合物+适配体片段1+适配体片段2+凝血酶。从图中可以看出，全长凝血酶适配体在与凝血酶结合后，可引起FRET效率的下降，即1525/144(|比值下降；拆分的适配体片段与凝血酶仍然可以结合形成G-四链体结构，引起FRET效率的下降。不同的是，使用拆分的适配体时FRET效率下降的效果比全长适配体更好。
[0017]图3为本发明利用拆分适配体和水溶性共轭聚合物检测凝血酶的特异性分析图。
[0018]图4为本发明利用拆分适配体和水溶性共轭聚合物检测凝血酶的灵敏度分析图。该图表明了 FRET效率变化率l-F/匕和凝血酶浓度c的关系，其中，F为含凝血酶样品的 FRET效率，F0为不含凝血酶的空白的FRET效率。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图，用凝血酶的检测实施例来进一步说明本发明。但本发明并不仅限于检测凝血酶还可以检测K+和Pb2+等，也并不受实施例中其他条件的限制。
[0020]荧光检测所用的仪器为荧光分光度计(RF-5301，日本)。荧光光谱测量条件:氙灯激发，激发和发射狭缝宽度为5.0 nm和5.0 nm,电压为950 V，响应时间Auto，激发波长为404 nm，发射波长扫描范围420?650 nm ;用600 μ L石英比色皿进行测量，样品体积500μ L ;室温。
[0021]本发明实施例中所用的适配体片段I和适配体片段2均购自上海生物工程技术有限公司，序列分别为 5’-FITC-GGTTGGTG-3’和 5’-TGGTTGG-3’ ；凝血酶购自 Sigma-Aldrich公司；结合液成分为:140 mM NaCiaO mM Tris-HCl, pH = 8.0 ;所用的缓冲溶液成分为:0.1M NaHCO3,0.1M Na2CO3, pH = 10.6。
[0022]实施例1:1)将染料标记的适配体片段1、适配体片段2和水溶性共轭聚合物按摩尔比1:1:5混合，形成适配体/聚合物的复合物，然后加入到缓冲溶液中，以404 nm为激发波长，进行荧光检测，记录该复合物的荧光发射谱带，并计算其525 nm与440 nm处荧光强度的比值I525A44tl ;适配体片段I和适配体片段2为特定单核苷酸序列，适配体片段I的5’端标记有异硫氰酸荧光素，标记方法为:5’ -6-FITC。
[0023]2)将适配体片段I和适配体片段2及含凝血酶的待测样品加入到结合溶液中37°C放置40分钟，形成凝血酶/适配体复合物。
[0024]3)向上述复合物中加入水溶性共轭聚合物，凝血酶诱导并与适配体片段I和适配体片段2结合形成G-四链体结构，此时适配体与聚合物的距离较远，不能发生有效的能量转移，标记在适配体末端的染料的荧光信号下降，在缓冲溶液的环境下进行荧光检测，计算其525 nm与440 nm处荧光强度的比值1525/144(1，其I525/I44Q比值下降，根据I525A44tl比值下降的程度实现对凝血酶的定性及定量检测。
[0025]实施例2:
I)将适配体片段1、染料标记的适配体片段2和水溶性共轭聚合物按摩尔比1:1:10混合，形成适配体/聚合物的复合物，然后加入到缓冲溶液中，以404 nm为激发波长，进行荧光检测，记录该复合物的荧光发射谱带，并计算其525 nm与440 nm处荧光强度的比值I525A44tl ;适配体片段I和适配体片段2为特定单核苷酸序列，适配体片段2的3’端标记有突光素，标记方法为:3’ -6-FAM标记。
[0026]2)将适配体片段I和适配体片段2及含凝血酶的待测样品加入到结合溶液中37°C放置40分钟，形成凝血酶/适配体复合物。
[0027]3)向上述复合物中加入水溶性共轭聚合物，凝血酶诱导并与适配体片段I和适配体片段2结合形成G-四链体结构，此时适配体与聚合物的距离较远，不能发生有效的能量转移，标记在适配体末端的染料的荧光信号下降，在缓冲溶液的环境下进行荧光检测，计算其525 nm与440 nm处荧光强度的比值1525/144(1，其I525/I44Q比值下降，根据I525A44tl比值下降的程度实现对凝血酶的定性及定量检测。[0028]实施例3凝血酶检测的特异性分析
向各离心管中加入2.5 μ L浓度为10 μ M的适配体片段I和2.5 μ L浓度为10 μΜ的适配体片段2，然后分别加入I μ L浓度为10 μ M的凝血酶(Thro) ,6.8 μ L浓度为0.1mg/ml的牛血清蛋白(BSA)、2 μ L浓度为5 μ M的溶菌酶(Lys)和1.6 μ L浓度为Img/ml免疫球蛋白(IgG)，使各个蛋白终浓度为20 nM，适配体片段I和适配体片段2的终浓度为50 nM;最后加入2.5 μ L浓度为50 μ M的水溶性共轭聚合物，在pH=10.6 ,0.1 M CBS缓冲溶液的环境下进行荧光检测，结果见图3，从图中可以看出，空白和加入非特异性蛋白的FRET相近且都比较高，加入凝血酶的FRET明显降低。因为当溶液中不存在Thro或存在其他非特异性蛋白时，被拆分的两段序列不能形成G-四链体结构，复合物与聚合物的之间的距离较近，从而能与聚合物发生有效的能量转移；当溶液中存在凝血酶时，凝血酶将诱导这两段序列形成G-四链体结构，增加了复合物与聚合物的之间的距离，从而不能发生有效的能量转移。表明该方法具有良好的特异性。
[0029]实施例4凝血酶检测的灵敏度分析
1)向各离心管加入2.5 μ L浓度为10 μ M的异硫氰酸荧光素标记的适配体片段1，2.5 μ L浓度为10 μ M适配体片段2以及2.5 μ L浓度为50 μ M的水溶性共轭聚合物，形成适配体/聚合物的复合物，然后加入到492.5 μ L的缓冲溶液中，以404 nm为激发波长，进行荧光检测，记录该复合物的荧光发射谱带，其525 nm与440 nm处荧光强度的比值I525/I440 ;
2)向各离心管加入2.5 μ L浓度为10 μ M的适配体片段I和适配体片段2以及不同浓度的凝血酶，使凝血酶终浓度分别为2 ηΜ、5 ηΜ、8 ηΜ、10 ηΜ、20 ηΜ、30 ηΜ、50 ηΜ，在37°C的结合液中孵育40分钟；同时用不含凝血酶的检测液作空白对照，然后加入2.5 μ L浓度为50 μ M的水溶性共轭聚合物，在缓冲溶液的环境下进行荧光检测，计算其525 nm与440nm处荧光强度的比值1525/144(|，随着凝血酶浓度的增加，能量转移效率逐渐降低，即I525/I44Q比值逐渐降低。结果见附图4，从图中可以看出，随着凝血酶浓度的增加，1-FziFci逐渐升高，这是由于凝血酶和溶液中的适配体片段I和适配体片段2发生特异性结合，导致越来越多的适配体片段I和适配体片段2结合成G-四链体结构。可以发现，在2.0nM?20 ηΜ的范围内，凝血酶浓度与l-F/匕接近于线性关系。可以据此线性关系对凝血酶进行定量检测。
【权利要求】
1.一种基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤: a)将适配体片段1、适配体片段2和水溶性共轭聚合物按摩尔比1:1:5?10混合，形成适配体/聚合物的复合物，然后加入到缓冲溶液中，以404 nm为激发波长，进行荧光检测，记录该复合物的荧光发射谱带，并计算其525 nm与440 nm处荧光强度的比值1525/144(| ;其中，所述适配体片段I或者适配体片段2上标记有染料； b)将适配体片段I和适配体片段2及含凝血酶的待测样品加入到结合液中进行反应，形成凝血酶/适配体复合物； c)向步骤b)凝血酶/适配体复合物中加入水溶性共轭聚合物，凝血酶/适配体复合物与水溶性共轭聚合物的摩尔比为O?1:5，然后加入到缓冲溶液中，以404 nm为激发波长，进行荧光检测，计算其525 nm与440 nm处荧光强度的比值1525/144(|，根据1525/144(|比值下降的程度实现对凝血酶的定性及定量检测； 其中:所述的适配体片段I的碱基组成为:5’ -FITC-GGTTGGTG-3’ ；适配体片段2的碱基组成为:5’ -TGGTTGG-3’。
2.根据权利要求1所述的基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法，其特征是步骤a)中适配体片段I或者适配体片段2上标记有染料，所述染料为荧光素或异硫氰酸荧光素；染料标记在适配体片段I的5’端或者适配体片段2的3’端。
3.根据权利要求1所述的基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法，其特征是步骤a)和步骤c)中所用缓冲溶液的组成为:0.1M NaHCO3,0.1M Na2CO3,pH = 10.6。
4.根据权利要求1所述的基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法，其特征是步骤b)中所用结合液为140 mM NaCiaO mM Tris-HCl，pH = 8.0 ;反应温度为37°C，反应时间为40分钟。
【文档编号】G01N21/64GK103630517SQ201310572331
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】刘兴奋, 石琳, 黄艳琴, 黄维 申请人:南京邮电大学