基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法
【专利摘要】本发明涉及基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于：金插指微阵列电极包含25对梳齿，每对梳齿间相互穿插平行排列，形成插指形状。梳齿宽15μm，相邻梳齿间的间距为15μm。插指型微阵列电极具有高稳态电流密度，高信噪比，低溶液电位降等优势，在对检测生物识别元件引起的微弱阻抗信号上明显优于传统电极。在金插指微阵列电极表面依次滴涂壳聚糖溶液、乙酰胆碱酯酶和nafion溶液。壳聚糖提供适宜的微环境固定乙酰胆碱酯酶，nafion膜进一步保护乙酰胆碱酯酶。本发明基于微阵列电极固定乙酰胆碱酯酶，利用阻抗分析技术检测农药。经上述步骤制备的基于微阵列电极的酶传感器，可用于农药的快速检测，便于实现农药残留检测仪的微型化、便携式。
【专利说明】基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法
【技术领域】
[0001]本发明提供基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，属于农产品安全检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]农药作为重要的农业生产资料，被广泛应用于农业生产中。而农药主要是一些有毒有害的化学物质，长期使用农药引起的农产品中农药残留超标，对环境生物安全和人类健康都将产生巨大危害。近年来，由农药残留引发的食品安全问题已成为当今各国政府和社会各界广为关注的焦点问题之一。因此，要促进农药的科学使用，保证我国农产品农药残留量达到食品安全标准，必须尽早尽快建立农药残留检测技术。由于我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药，所以农药残留检测的重点也在有机磷和氨基甲酸酯类农药上。
[0003]目前，农药残留常用的检测方法为气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法以及气质联用法，这些方法虽然分析精度高，定量准确，但其通常耗时长、成本高，需要专业人员操作，不宜用于现场的快速检测。我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法(农残快速检测仪)，可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测，具有较好的实用性。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于定性测量严重超标的蔬菜样品。酶抑制分光光度法也有比较广泛的应用，国内已有多种基于此原理的农药残留速测仪。分光光度法是基于吸光度值的变化进行检测的，但蔬菜水果含有的大量色素会对吸光度值造成很大影响，导致检测结果的不准确。并且上述方法存在回收率低，错检、漏检比例较高，重复性差，难以满足低残留和定量检测的要求等。
[0004]发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷，而且操作简单、响应时间短、便于实现便携化、灵敏度高的检测农药残留的乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法。
[0005]所述的基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其技术方案为:基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于:金插指微阵列电极包含25对梳齿，每对梳齿间相互穿插平行排列，形成插指形状。梳齿宽15 Mffl，相邻梳齿间的间距为15 Mm。插指型微阵列电极具有高稳态电流密度，高信噪比，低溶液电位降等优势。在金插指微阵列电极表面滴涂壳聚糖，再固定乙酰胆碱酯酶，最后滴涂nafion膜，制备乙酰胆碱酯酶传感器。
[0006]所述的基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于:金插指微阵列电极的清洗，乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及其过程表征，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立。
[0007]所述的基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于:金插指微阵列电极包含25对梳齿，每对梳齿间相互穿插平行排列，形成插指形状。梳齿宽15 Mffl，相邻梳齿间的间距为15 Mm。插指型微阵列电极具有高稳态电流密度，高信噪比，低溶液电位降等优势，在对检测生物识别元件引起的微弱阻抗信号上明显优于传统电极。所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的工作曲线为:西维因农药的浓度在1-100 ng/mL时，P/ο = 21.063+ 18.75 lgC.
[0008]其制备原理为:由于氨基甲酸酯类农药与乙酰胆碱酯酶具有较高的特异性结合，因此常用乙酰胆碱酯酶作为检测氨基甲酸酯类农药的分子识别元件。乙酰胆碱酯酶生物传感器是将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面，酶催化底物乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。农药在结构上与底物乙酰胆碱有些类似，它可以和乙酰胆碱的活性中心有效结合，抑制乙酰胆碱酯酶的活性。胆碱是一种电活性物质，能在一定电位下发生氧化反应，通过阻抗法测定阻抗值的大小可以测定农药残留的浓度。通过比较有无农药时酶促反应中阻抗值的变化得到农药对酶的抑制率，该抑制率与农药的浓度成对应关系，便可测得有机磷或氨基甲酸酯类农药的含量。
[0009]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于:(I)阻抗型乙酰胆碱酯酶传感器制备前金插指微阵列电极的清洗，用丙酮、乙醇、超纯水浸泡3 min，然后用蘸有无水乙醇的擦镜纸轻轻擦拭电极表面，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。如有需要，可以通过显微镜观察金插指微阵列电极的表面状态。(2)配置壳聚糖溶液和nafion溶液，在清洗干净的金插指微阵列电极表面依次滴涂壳聚糖、乙酰胆碱酯酶和nafion膜，制备好的生物传感器于冰箱4°C环境下封闭保存。
[0010]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于:配置一系列的西维因标准液，进行阻抗谱扫描，求出抑制率，进一步得到上述制备的阻抗型乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作曲线、检测范围和检测限。
[0011]本发明通过壳聚糖提供适宜的微环境固定乙酰胆碱酯酶，最后又用nafion膜保护乙酰胆碱酯酶，提高了乙酰胆碱酯酶的稳定性。插指型微阵列电极具有高稳态电流密度，高信噪比，低溶液电位降等优势，在对检测生物识别元件引起的微弱阻抗信号上明显优于传统电极，结合阻抗分析技术，便于研制灵敏、快速、小型化、易操作的生物传感器设备。本发明基于金插指微阵列电极制备乙酰胆碱酯酶生物传感器，具备传统生物传感器不可比拟的优势。
[0012]所述基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法工艺如下:(1)将20 PL壳聚糖溶液滴涂在清洗干净的金插指微阵列电极表面，在室温下放置30 min后，用用超纯水冲洗未固定上的修饰物，并用氮气小心吹干；(2)取0.2 U乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在上述修饰有壳聚糖的电极上，室温下放置I h后，然后用PH=7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗表面，而后用氮气吹干；(3)在上述修饰好的电极上滴涂20 μ? nafion膜，放置30 min后，用超纯水冲洗，并用氮气干燥。乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，于4°C条件下保存备用。
【具体实施方式】
[0013]实施例:(1)壳聚糖溶液的制备:将0.5 g壳聚糖溶解于100 ml 1.0% (v/v)的乙酸溶液中。用微型振荡器溶解后，再超声5 min，最后将制备好的溶液于4° C条件下保存备用。(2)金插指微阵列电极的清洗:将金插指微阵列电极依次用丙酮、乙醇、超纯水浸泡3 min，然后用蘸有无水乙醇的擦镜纸轻轻擦拭电极表面，经超纯水冲洗后，用氮气小心吹干。清洗完成后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。如有需要，可以通过显微镜观察金插指微阵列电极的表面状态。(3)将20 ML壳聚糖溶液滴涂在清洗干净的金插指微阵列电极表面，在室温下放置30 min 后，用用超纯水冲洗未固定上的修饰物，并用氮气小心吹干。(4)取0.2 U乙酰胆碱酯酶溶 液滴涂在上述修饰有壳聚糖的电极上，室温下放置I h后，然后用PH=7.0的磷酸盐缓冲溶 液冲洗表面，而后用氮气吹干。(5)在上述修饰好的电极上滴涂20 ML nafion膜，放置30 min后，用超纯水冲洗，并用氮气干燥。乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，于4°C条件下保 存备用。(6)在上述制备好的乙酰胆碱酯酶传感器上滴涂含有I mol/L KCl和5 mmol/L Fe [CN]3—广的PBS (0.1M, pH 7.0)缓冲溶液进行阻抗谱扫描。测量频率范围为IHz -1MHz, 外加电压为55 mV，电压振幅为±5 mV，记录反应过程中的阻抗谱。(7)配置I ng/mL - 100 ng/mL的西维因标准溶液，农药测量时，在上述乙酰胆碱酯酶传感器上滴涂不同浓度的农药 标准溶液12 min，然后在含有I mM氯化硫代乙酰胆碱(ATCl)，I mol/L KCl和5 mmol/L Fe[CN]3_/4_的PBS (0.1M, pH 7.0)缓冲溶液中进行阻抗谱扫描，抑制率I可由下式求得:
I (%) - (Zsample Zcontrol) / Zcontrol X 100%
其中Z_tMl和Zsample分别为测试电极未经过农药抑制和经过农药抑制后，在氯化硫代 乙酰胆碱溶液中的阻抗值，根据农药浓度与抑制率之间呈一定的线性关系，做出工作曲线 图，得到农药浓度与抑制率之间的线性关系，以及检测限。
[0014]此种基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法操作简单，便于掌握，且检测 时间短，检测限低，检测农药范围广，稳定性好，灵敏度高，符合我国农药残留快速检测技术 发展和国际化要求。
【权利要求】
1.基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于:使用的金插指微阵列电极包含25对梳齿，每对梳齿间相互穿插平行排列，形成插指形状，梳齿宽15 Mffl，相邻梳齿间的间距为15 Mffl，由于插指型微阵列电极具有高稳态电流密度，高信噪比，低溶液电位降等优势，在对检测生物识别元件引起的微弱阻抗信号上明显优于传统电极，本发明在微阵列电极上固定乙酰胆碱酯酶制备了酶传感器用于农产品中农药残留的快速检测。
2.如权利要求1所述的基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于:基于微阵列电极的酶传感器的制备方法如下:将20 PL壳聚糖溶液滴涂在清洗干净的金插指微阵列电极表面，在室温下放置30 min后，用用超纯水冲洗未固定上的修饰物，并用氮气小心吹干；取0.2 U乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在上述修饰有壳聚糖的电极上，室温下放置Ih后，然后用PH=7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗表面，而后用氮气吹干；在上述修饰好的电极上滴涂20 μLnafion膜，放置30 min后，用超纯水冲洗，并用氮气干燥，乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，于4°C条件下保存备用。
3.如权利要求1所述的基于微阵列电极的酶传感器农药残留检测方法，其特征在于:采用权利要求2所述的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法在微阵列电极上固定了乙酰胆碱酯酶，由于微阵列电极与传统的三电极系统相比具有无可比拟的优势，结合阻抗分析技术，实现农产品中农药残留的快速、准确的测定。
【文档编号】G01N27/327GK103558276SQ201310576570
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】孙霞, 郭业民, 王相友, 刘君峰, 巩智利 申请人:山东理工大学