基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法
【专利摘要】本发明涉及基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，其特征在于：每个阵列由多个宽度和间距为微米级的指电极并联组合而成，电极之间相互啮合形成叉指状电极阵列，其中包含25对梳齿，梳齿宽15μm，相邻梳齿间的间距为15μm。微阵列电极具有阻抗降低、快速建立稳态信号、信噪比高、较高的灵敏度等优点，可以对生物识别元件引起的微弱阻抗信号进行检测。在微阵列电极表面依次修饰蛋白A、抗体和牛血清蛋白，蛋白A可以牢固地与微阵列电极共价结合，再与抗体的Fc端结合从而定向固定抗体，用牛血清蛋白进一步封闭非特异性活性位点，制备了免疫传感器。经上述步骤制备的免疫传感器，可用于农药残留快速检测，便于实现农药残留检测仪的微型化、便携式。
【专利说明】基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法
【技术领域】
[0001]本发明提供基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，属于农产品安全检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]农药广泛应用于世界各国，对农业生产的发展起着重要的作用。但是随着农药的大量使用，农药对土壤、水和大气环境也造成了污染，对鸟类、昆虫及农产品品质产生了影响。人工合成的化学农药约500余种，这些农药的广泛使用，不仅造成环境的严重污染，同时对环境生物安全和人类健康都将产生巨大危害。因此，要促进农药的科学使用，保证我国农产品农药残留量达到食品安全标准，必须尽早尽快建立农药残留快速检测技术。
[0003]目前，传统的农药残留检测方法为色谱法、色质联用法、高效液相色谱法以及气质联用法等，这些方法可以准确定性、定量，但由于仪器大型、复杂、昂贵，操作繁琐，需液-液萃取或固-液萃取等前期处理过程，无法现场使用；而一些已经使用的检测速测法，灵敏度低，有的农药残留检测达不到国际或国内最低检测线标准，取样量大，需超声提取，恒温反应，检测时间最快也需要几十分钟，不利于现场的快速检测。与传统的分析方法相比，生物传感器具有特异性强、分析速度快、结构简单、成本低廉等优点。
[0004]发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷，且灵敏度高、响应时间短、便于实现小型便携化检测农药残留的免疫传感器的制备方法。
[0005]所述的基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，其特征在于:每个阵列由多个宽度和间距为微米级的指电极并联组合而成，电极之间相互啮合形成叉指状电极阵列，其中包含25对梳齿，梳齿宽15Mm，相邻梳齿间的间距为15Mm。叉指微阵列电极具有阻抗降低、快速建立稳态信号、信噪比高、较高的灵敏度等优点，在叉指微阵列电极表面依次修饰蛋白A、毒死蜱抗体和牛血清蛋白BSA，蛋白A可以牢固地与金叉指微阵列电极共价结合，再与抗体的Fe端结合从而定向固定抗体，用BSA进一步封闭非特异性活性位点，制备了微阵列免疫传感器。
[0006]所述的基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，其特征在于:金叉指微阵列电极的清洗，免疫传感器敏感界面的构建及其过程表征，工作曲线的确定，免疫传感器性能的检测。
[0007]所述的基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，其特征在于:免疫传感器的修饰及表征过程，有关实验参数的优化；所制备出免疫传感器的工作曲线；免疫传感器性能检测。所制备的免疫传感器的工作曲线为:ΛΖ = 210.11 1gC - 236.38(R2=0.9828)，且该免疫传感器的特异性良好。
[0008]其制备原理为:免疫生物传感器利用抗原、抗体可以发生特异性结合反应，将产生的物理或化学信号转化为可定量或者可处理的物理化学信号，从而实现对待测物质的检测。本发明利用蛋白A可以与金叉指微阵列电极牢固地结合，且可以与抗体的Fe端结合以便定向固定抗体。而牛血清蛋白(BSA)可以封闭非特异性结合位点，即可制备得到一种新型的、便捷的免疫传感器。
[0009]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:基于叉指微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，其特征在于:(I)用丙酮、乙醇、清洁和去离子水依次清洗叉指微阵列电极，用氮气吹干后，进行阻抗谱扫描，与原始裸电极的阻抗值对比，两者基本相同，则说明清洗合格。(2)在清洗干净的叉指微阵列电极表面依次修饰蛋白A、毒死蜱抗体和牛血清蛋白BSA，制备好的免疫传感器于4°C环境下封闭保存。
[0010]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:基于叉指微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，其特征在于:(I)配置一系列的毒死蜱标准液，进行阻抗谱扫描，得到阻抗增值，进一步得出上述制备的免疫传感器的工作曲线和检测范围；(2)配置一系列的常用农药混合溶液，以检测所制备免疫传感器的选择性。
[0011]本发明利用叉指微阵列电极具有阻抗降低、快速建立稳态信号、信噪比高、较高的灵敏度等优点，可以对生物识别元件引起的微弱阻抗信号进行检测。通过蛋白A可以与抗体的Fe端结合，从而实现抗体的定向固定。该免疫传感器检测时间较短，灵敏度高，特异性好。将叉指微阵列电极与阻抗测量技术相结合，以叉指微阵列电极作为阻抗信号转换器能够显著提高免疫传感器检测灵敏度，实现农产品中农药残留的快速检测。
[0012]所述基于叉指微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法工艺如下:(I)用丙酮、乙醇、清洁和去离子水依次清洗叉指微阵列电极，用氮气吹干；(2)将20μ? lOOPg/mL蛋白质A滴涂到电极，50分钟后用氮气吹干；(3)将10 μ L lOOPg/mL毒死蜱抗体溶液修饰到电极上，在4°C孵育；(4)用20μ? 2.5%牛血清蛋白BSA封闭非特异性活性位点，用氮气吹干，于4°C条件下保存 备用。
【具体实施方式】
[0013]实施例:(1)用丙酮、乙醇、去离子水依次清洗叉指微阵列电极，用氮气吹干；(2)将20μ? lOOPg/mL蛋白质A滴涂到电极，50分钟后用氮气吹干；(3)将10 μ L lOOPg/mL毒死蜱抗体溶液修饰到电极上，在4°C孵育；(4)用20μ? 2.5%牛血清蛋白BSA封闭非特异性活性位点，用氮气吹干，从而用于检测农产品中农药残留的检测，于4°C条件下保存备用；
(5)在上述制备好的乙酰胆碱酯免疫传感器上滴涂测试底液(0.1M，pH7.0 PBS内含Imol/LKCl,5mmol/LFe[CNJ3V4O进行阻抗谱扫描。测量频率范围为ΙΗζ-ΙΜΗζ，外加电压为55mV，电压振幅为±5mV，记录整个修饰过程中的阻抗谱。(7)配置lng/mL-100ng/mL的毒死蜱标准溶液，农药测量时，在上述免疫传感器上滴涂不同浓度的农药标准溶液，然后在测试溶液中进行阻抗谱扫描，阻抗增量可由下式求得:
△ ^ ^sample ^control
其中Z_tMl和Zsample分别为测试电极未经过农药抑制和经过农药抑制后的阻抗值，根据农药浓度与阻抗增量之间呈一定的线性关系，做出工作曲线图，得到农药浓度与阻抗增值之间的线性关系。
[0014]此种基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法操作简单，便于掌握，且检测时间短，与阻抗测量技术相结合，以叉指微阵列电极作为阻抗信号转换器能够显著提高免疫传感器检测灵敏度，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。
【权利要求】
1.基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，其特征在于:每个阵列由多个宽度和间距为微米级的指电极并联组合而成，电极之间相互啮合形成叉指状电极阵列，其中包含25对梳齿，梳齿宽15Mm，相邻梳齿间的间距为15Mm ;叉指微阵列电极具有阻抗降低、快速建立稳态信号、信噪比高、较高的灵敏度等优点，可以对生物识别元件引起的微弱阻抗信号进行检测；本发明在微阵列电极上定向固定抗体制备了免疫传感器用于农产品中农药残留的快速检测。
2.如权利要求1所述的基于微阵列电极的免疫传感器农药残留检测方法，其特征在于:在微阵列电极上修饰蛋白A，从而定向固定抗体，制备步骤为: (I)用丙酮、乙醇、去离子水依次清洗叉指微阵列电极，用氮气吹干；(2)将20μ?lOOPg/mL蛋白质A滴涂到电极，50分钟后用氮气吹干；(3)将10 μ L lOOPg/mL毒死蜱抗体溶液修饰到电极上，在4°C孵育；(4)用20μ? 2.5%牛血清蛋白BSA封闭非特异性活性位点，用氮气吹干，制备了微阵列免疫传感器用于农产品中农药残留的快速检测。
【文档编号】G01N27/06GK103558262SQ201310576591
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】孙霞, 郭业民, 王相友, 刘君峰, 曹瑶瑶 申请人:山东理工大学