水蛭指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种水蛭指纹图谱的建立方法，具体步骤为将水蛭制备成供试品溶液，在一定的条件下经过高效液相色谱仪的分离检测，获得水蛭的指纹图谱。本发明同时提供了由该方法得到的水蛭的标准指纹图谱，该图谱能够为水蛭鉴别和内在的质量控制提供可靠的依据。本发明操作简便，稳定性高、重现性好、特征峰多，能全面、准确地评价水蛭药材的质量。
【专利说明】水蛭指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水蛭指纹图谱的建立方法，以及由该方法所得的水蛭标准指纹图谱，属于中药分析领域。
【背景技术】
[0002]水輕为水輕科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水輕 Hirudo nipponicaWhitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，夏、秋两季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥，其味咸、苦，性平，归肝经，有小毒。中医认为水蛭是一味传统的破血药，有逐血瘀、通经脉、利水道的功效。水蛭在临床上有着广泛的应用，以水蛭治疗的临床疾病主要有:慢性肾炎、经脉曲张、前列腺炎、不孕、糖尿病、癌症、心脏病、肝硬化、高血压、高血脂症、脉管炎、女子血闭、结膜炎与白内障、哮喘等；同时，水蛭体内含有水蛭素、组胺样物质、肝素、抗血栓素等多种药效成分，对于消除手术后引起的后遗症、阻碍血液凝固、促进血液循环亦有重要作用。中国专利CN101412726A公开了从蚂蝗中分离得到3个新杂环类化合物水蛭胺A、B、C，并进行了药效学试验，结果表明新化合物具有抗细胞缺氧及抗肿瘤细胞作用，其中化合物C的抗肿瘤细胞作用较强，化合物A和B化合物的抗细胞缺氧及抗肿瘤细胞作用均很强。
[0003]目前，国内外上市的中成药中，有一部分就是含有水蛭或水蛭提取物的制剂，这类制剂主要用于治疗心脑血管疾病，并取得了良好的效果，如脑血康颗粒、蛭龙血通胶囊、脑血康滴丸、复方水蛭口服液、芪参胶囊、通心络胶囊等，可见，水蛭具有多种药理药效作用，有着广阔的临床应用前景。但是，由于对水蛭中化学成分研究不充分，导致现有的药品标准中对水蛭或水蛭提取物的质量控制方法大多为浸出物检查、薄层鉴别等。例如，《中华人民共和国药典2010版一部》水蛭药材标准中采用水蛭对照药材薄层鉴别，其含量测定也只是粗略地记录水蛭浸出物消耗凝血酶的体积，以中和一个单位的抗凝血酶的量为一个抗凝血酶活性单位，其中规定，每I克水蛭含有抗凝血酶活性应不低于16.0U，蚂蝗、柳叶蚂蝗应不低于3.0U (式中的U为每I克含凝血酶活性单位，U/g)。以上鉴别或测量水蛭药材的方法，缺乏对水蛭中有效化学成分的定性鉴别和含量测定，专属性差，不能有效地控制水蛭及含有水蛭制剂的质量。
[0004]中药指纹图谱技术是目前国内外公认的用来控制中药、天然药物或中药材整体质量最有效、最准确、最直接的手段，是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别方法，其基本属性是“整体性”和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照物与待测样品指纹图谱的相似性。运用指纹图谱技术可以鉴别中药材和中成药的真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。对于用指纹图谱来控制水蛭药材的质量，国内已有专利及文献报道，例如，中国专利CN1844911A公开了水蛭指纹图谱的建立方法并公开了特征指纹图谱，但其以生理盐水室温浸泡16小时提取水蛭中的成分，试验周期长，生理盐水或水不能有效提出水蛭中的蝶啶类成分，所得的无关杂质多，影响指纹图谱的全面性和精确性；仅以次黄嘌呤作为参照物，而对水蛭中其它重要药效及质量标志性成分,如尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A等均没有涉及，不能准确、全面地反映水蛭药材的质量；梯度洗脱过程中，在流动相不含有机相的时间段，普通C18色谱柱填料中的C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。袁晓环等以HPLC指纹图谱来控制水蛭注射液及复方水蛭注射液的质量，并建立了水蛭注射液的指纹图谱，但两篇文献水蛭指纹图谱建立方法的局限性与中国专利CN1844911A相同，其注射液或复方注射液仅以次黄嘌呤作为参照物，而对水蛭中其它重要药效成分及质量标志性成分，如尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A等均没有涉及，不能准确、全面地反映水蛭注射液或复方水蛭注射液的质量；且梯度洗脱过程中，在流动相不含有机相的时间段，普通C18填料中的C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定(杨晓环，杨旭东，崔荣军，等.水蛭注射液的HPLC指纹图谱[J].中国医药工业杂志，2008，39 (7):530?532.)、(杨晓环，杨旭东，王春涛，等.复方水蛭注射液HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2008，33 (15):1825?1827.)。徐长根等对水蛭冻干粉针剂指纹图谱的建立方法进行了研究，并得到了其指纹图谱，但其仅以次黄嘌呤溶液作为参照物，不能全面、准确反映水蛭冻干粉针剂中其它重要水蛭药效成分的质量；梯度洗脱过程中，在流动相含极小比例(小于0.15%)有机相的时间段，普通C18填料中的C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定；并且其指纹图谱上的特征峰太少，且分离不佳(徐长根，罗世书，谢艳华.水蛭冻干粉针剂指纹图谱评价[J].第四军医大学学报，2009，30(22):2667?2669.)。
[0005]鉴于以上不足，有必要发明一种建立水蛭指纹图谱的新方法，使之既能操作简便，稳定性和重现性好，又能全面、准确地评价水蛭药材的质量，从而能加强对水蛭药材真伪、产地的鉴别，又能对水蛭药材的质量和品质进行全面评价和控制，弥补了现有水蛭质量控制方法的不足，使其更加完善和科学。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有水蛭药材质量控制方法的不足而提供一种水蛭指纹图谱的建立方法，其特点是将水蛭制备成供试品溶液后，经过高效液相色谱仪分离检测，获得水蛭的指纹图谱，从而为水蛭鉴别和内在的质量控制提供可靠的依据。
[0007]本发明一种水蛭指纹图谱的建立方法具体包括如下步骤:
[0008]I)供试品溶液的制备:取水蛭粗粉，以甲醇溶液回流提取，离心，取上清液加在碱性氧化铝层析柱上,收集过柱液,再以水洗脱,合并过柱液及水洗脱液,过滤，作为供试品溶液；
[0009]2)参照物溶液的制备:取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A对照品，溶于甲醇溶液作为参照物溶液；
[0010]3)制作水蛭指纹图谱:分别精密吸取供试品溶液和参照物溶液，经高效液相色谱仪分离检测，其中，流动相的组成为10mmol/L的磷酸二氢钾溶液一乙腈；采用梯度洗脱；得到水蛭指纹图谱。
[0011]其中，供试品溶液按如下步骤制备:精密称取水蛭粗粉5g，置具塞容器中，精密加A 50%甲醇溶液50ml，水浴回流提取30min，以IOOOOrpm的速度高速离心lOmin，精密量取上清液20ml，加在碱性氧化铝柱(氧化铝为6g，100?200目，层析柱内径为1.5cm)上，收集过柱液，再用水30ml洗脱，合并过柱液及水洗脱液，置50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，经
0.45um微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。现用现配。
[0012]对照物溶液按如下步骤制备:取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解并稀释成每Iml中含尿嘧啶30 u g、次黄嘌呤80 u g、黄嘌呤20 u g、尿苷20 u g、水蛭胺C30 u g、水蛭胺B30 u g和水蛭胺A30 u g的混合溶液，摇匀，即得。
[0013]色谱条件为:色谱柱为YMC-Pack-ODS-AQ C18柱(250x4.6mm，5 y m);流动相为10mmol/L的磷酸二氢钾溶液一乙腈；采用梯度洗脱:0min — 15min — 40min — 60min,乙腈0% — 0% — 20% — 20% ;流速 0.8ml/min ;检测波长 254nm ;进样量 10 U I ;柱温 30°C。
[0014]本发明还提供由上述水蛭指纹图谱建立方法得到的水蛭标准指纹图谱。
[0015]将10份水蛭样品按上述方法制备成供试品溶液，在高效液相色谱仪上分离检测，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到水蛭标准指纹图谱。
[0016]所述标准指纹图谱有13个共有特征峰，第3、5、6、7、9、10、12号色谱峰分别依次对应尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B和水蛭胺A，其中5号次黄嘌呤峰最强，图谱总长度为60min，具体如下:
[0017]I号峰，平均保留时间t为4.6min ;
[0018]2号峰，平均保留时间t为7.3min;
[0019]3号峰，平均保留时间t为8.4min ;
[0020]4号峰,平均保留时间t为10.3min ；
[0021]5号峰,平均保留时间t为14.9min ；
[0022]6号峰,平均保留时间t为18.0min ；
[0023]7号峰，平均保留时间t为20.2min ;
[0024]8号峰，平均保留时间t为26.8min ;
[0025]9号峰，平均保留时间t为30.7min ;
[0026]10号峰,平均保留时间t为33.2min ；
[0027]11号峰,平均保留时间t为35.4min ；
[0028]12号峰,平均保留时间t为37.1min ；
[0029]13号峰,平均保留时间t为40.9min。
[0030]本发明所述水蛭是指《中华人名共和国药典一部》(2010版)记载的的水蛭科动物蚂蟥 Whitmania pigra Whitman 的干燥全体。
[0031]与现有技术相比，本发明水蛭指纹图谱的建立方法及其特征指纹图谱有以下显著的进步:
[0032]( I)供试品溶液的制备方法简便，易于操作，试验周期短，制备的供试品溶液杂质少，更干净，不易污染色谱柱，所得到的色谱图杂质信号干扰少；
[0033](2)色谱条件容易实现，乙腈系统柱压较低，有利于系统的稳定，且色谱柱选用耐水的YMC-Pack-ODS-AQ C18填料，防止普通C18填料色谱柱用水作为流动相时柱头塌陷造成色谱系统的不稳定；
[0034](3)文献表明，水蛭醇提物的抑制血液凝固作用强于水提物(黄振中.水蛭的临床应用[J].湖北中医杂志，1985 (3):13?15.)，所以，本发明以50%的甲醇提取水蛭中的成分，能最大程度提取、分离水蛭中的小分子药效成分，如尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B和水蛭胺A等，并在此基础上建立水蛭的指纹图谱方法，使其对水蛭的质量控制更具针对性和实用性；
[0035](4)本发明色谱条件下的各特征色谱峰均实现了基线分离，不仅能从整体上对水蛭进行模糊识别，也可对比参照物色谱对水蛭进行清晰鉴别及水蛭的多组分定量分析；
[0036](5)本发明方法稳定性高、重现性好、特征峰多，能全面、准确地评价水蛭药材的质量，适于对水蛭真伪、产地和品质的鉴别与控制。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是水蛭特征指纹图谱，图中从左到右分别是共有的第I至13号特征峰；
[0038]图2是水蛭的参照物图谱，图中从左到右分别对应图1中的第3、5、6、7、9、10、12号峰,依次分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B和水蛭胺A。
【具体实施方式】
[0039]实施例1水蛭指纹图谱的建立
[0040]I)药品、试剂和仪器
[0041]水蛭药材共10批,均采集于江苏宝应；使用AgilentllOO高效液相色谱仪；试剂为色谱纯或分析纯；
[0042]2 )供试品溶液的制备
[0043]精密称取水蛭粗粉5g，置具塞容器中，精密加入50%甲醇溶液50ml，水浴回流提取30min,以IOOOOrpm的速度高速离心lOmin，精密量取上清液20ml，加在碱性氧化铝柱(氧化铝为6g，100?200目，层析柱内径为1.5cm)上，收集过柱液，再用水30ml洗脱，合并过柱液及水洗脱液，置50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，经0.45 y m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；
[0044]3)参照物溶液的制备
[0045]取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解并稀释成每Iml中含尿嘧啶30 u g、次黄嘌呤80 u g、黄嘌呤20 y g、尿苷20 ii g、水蛭胺C30 u g、水蛭胺B30 u g和水蛭胺A30 u g的混合溶液，摇匀，即得；
[0046]4)制作水蛭指纹图谱
[0047]色谱柱为YMC-Pack-ODS-AQ C18 柱(250x4.6mm，5 y m)；流动相为 IOmmol/L的磷酸二氢钾溶液一乙腈；采用梯度洗脱:Omin — 15min — 40min — 60min,乙腈0% — 0% — 20% — 20% ;流速0.8ml/min ;检测波长254nm ;进样量10 U I ;柱温30°C;分别精密吸取供试品溶液和参照物溶液，在以上色谱条件下经高效液相色谱仪分离检测，得到水蛭指纹图谱，见图1 ;按相同色谱条件得参照物的图谱，见图2。
[0048]实施例2水蛭标准指纹图谱
[0049]水蛭药材共10批，均采集于江苏宝应。按本发明实施例1所述方法得到各批水蛭指纹图谱，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到水蛭标准指纹图谱，确定了 13个共有特征峰，见图1。[0050]第3、5、6、7、9、10、12号色谱峰分别依次对应尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B和水蛭胺A，其中5号次黄嘌呤峰最强，图谱总长度为60min，具体如下:
[0051]I号峰，平均保留时间t为4.6min ;
[0052]2号峰，平均保留时间t为7.3min ；
[0053]3号峰，平均保留时间t为8.4min ；
[0054]4号峰,平均保留时间t为10.3min ；
[0055]5号峰，平均保留时间t为14.9min ；
[0056]6号峰,平均保留时间t为18.0min ；
[0057]7号峰，平均保留时间t为20.2min ;
[0058]8号峰，平均保留时间t为26.8min ;
[0059]9号峰，平均保留时间t为30.7min ;
[0060]10号峰,平均保留时间t为33.2min ；
[0061]11号峰,平均保留时间t为35.4min ；
[0062]12号峰,平均保留时间t为37.1min ；
[0063]13号峰,平均保留时间t为40.9min。
【权利要求】
1.水蛭指纹图谱的建立方法，其特征在于将水蛭制备成供试品溶液，经过高效液相色谱仪分离检测，获得水蛭的指纹图谱； 所述方法包括如下步骤: 1)供试品溶液的制备:取水蛭粗粉，以甲醇溶液回流提取，离心，取上清液加在碱性氧化铝层析柱上,收集过柱液,再以水洗脱,合并过柱液及水洗脱液,过滤,作为供试品溶液； 2)参照物溶液的制备:取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A对照品，溶于甲醇溶液作为参照物溶液； 3)制作水蛭指纹图谱:分别精密吸取供试品溶液和参照物溶液，经高效液相色谱仪分离检测，其中，流动相的组成为10mmol/L的磷酸二氢钾溶液一乙腈；采用梯度洗脱；得到水蛭指纹图谱。
2.如权利要求1所述的水蛭指纹图谱的建立方法，其特征在于所述供试品溶液按如下步骤制备:精密称取水蛭粗粉5g，置具塞容器中，精密加入50%甲醇溶液50ml，水浴回流提取30min，以1000Orpm的速度高速离心lOmin，精密量取上清液20ml，加在碱性氧化铝柱(氧化铝为6g，100~200目，层析柱内径为1.5cm)上，收集过柱液，再用水30ml洗脱，合并过柱液及水洗脱液，置50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，经0.45 y m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
3.如权利要求1所述的水蛭指纹图谱的建立方法，其特征在于所述的高效液相色谱仪分离检测条件为:色谱柱为YMC-Pack-ODS-AQ C18柱(250x4.6mm，5 y m);流动相为10mmol/L的磷酸二氢钾溶液一乙腈；采用梯度洗脱:0min — 15min — 40min — 60min,乙腈0% — 0% — 20% — 20% ;流速 0.8ml/min ;检测波长 254nm ;进样量 10 U I ;柱温 30°C。
4.如权利要求1所述的水蛭指纹图谱的建立方法，其特征在于所述参照物溶液按如下步骤制备:取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解并稀释成每Iml中含尿嘧啶30 u g、次黄嘌呤80 u g、黄嘌呤20 u g、尿苷20 u g、水蛭胺C30 u g、水蛭胺B30 u g和水蛭胺A30 u g的混合溶液，摇匀。
5.由权利要求1至4中任一项所述的水蛭指纹图谱的建立方法得到的水蛭标准指纹图谱，其特征在于:有13个特征峰，第3、5、6、7、9、10、12号色谱峰分别依次对应尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B和水蛭胺A，其中5号次黄嘌呤峰最强，图谱总长度为60min，平均保留时间t如下: I号峰，平均保留时间t为4.6min ； 2号峰，平均保留时间t为7.3min ； 3号峰，平均保留时间t为8.4min ； 4号峰，平均保留时间t为10.3min ； 5号峰，平均保留时间t为14.9min ； 6号峰，平均保留时间t为18.0min ； 7号峰，平均保留时间t为20.2min ； 8号峰，平均保留时间t为26.8min ； 9号峰，平均保留时间t为30.7min ； 10号峰，平均保留时间t为33.2min ； 11号峰，平均保留时间t为35.4min ；12号峰，平均保留时间t为37.1min ；13号峰，平均保留时间t为40.9m`in。
【文档编号】G01N30/88GK103558329SQ201310605877
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】赵志全, 苏瑞强, 刘武占, 李蔚群 申请人:鲁南厚普制药有限公司