二硫代磷酸酯类农药代谢物的高效液相色谱-串联质谱检测方法
【专利摘要】本发明公开了二硫代磷酸酯类农药代谢物的高效液相色谱-串联质谱检测方法，属于二硫代磷酸酯类农药代谢物的检测领域。所述方法包括：将含有二硫代磷酸酯类农药代谢物的样品进行前处理；用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸对样品进行衍生化处理；衍生化产物用液相色谱-串联质谱进行检测。本发明检测方法对于土壤中二硫代磷酸酯类农药代谢物的回收率为79.3～90.7%，精密度为9.38%和5.93%，检出限为0.01mg/kg和0.005mg/kg，在0.005～1.000mg/kg范围内线性相关系数为0.9992和0.9997，具有良好的回收率、定量限、精密度和线性，符合农产品中农药残留及其代谢物检测方法的要求。
【专利说明】二硫代磷酸酯类农药代谢物的高效液相色谱-串联质谱检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种农药代谢物的检测方法，尤其涉及一种二硫代磷酸酯类农药代谢物的高效液相色谱-串联质谱检测方法，属于二硫代磷酸酯类农药代谢物的检测领域。
【背景技术】
[0002]有机磷农药具有广谱、高效等众多优点，是当前农药的三大支柱之一，广泛用作农业杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂等，不论在品种的数量、产量的规模等都位居各种农药首位(张强.有机磷农药快速检测方法研究综述[J].广东化工.2013，10 (40): 142-147)，有机磷农药在农业的广泛应用可能导致土壤、地表水及生物等被污染，并可能最终传递于食品(Ballesteros, E.，&Parrado, Μ.J..Continuous solid-phase extraction and gas chromatographic determinationof organophosphorus pesticidesin natural and drinking waters[J].Journal ofChromatography A，2004，1029，267-273.)。二硫代磷酸酯类有机磷农药是农业生产中最常用一类农药，部分农药还在大量使用，多数为剧毒农药，杀虫效果好，降解周期长，主要种类有甲拌磷、乙拌磷、乐果、特丁硫磷及马拉硫磷等，其主要代谢产物为0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯(图1)。
[0003]传统有机磷农药的检测一般采用气相色谱或气质联用的方法，但在检测二硫代磷酸酯类农药代谢物过程中，都遇到了一些问题。
[0004]二硫代磷酸酯类农药代谢物中磷原子接受巯基中的硫原子提供的孤对电子形成η键，其一对电子供给硫原子形成σ配键，因此氧原子上的氢易失去电子，发生亲和取代反应(苏寿承.有机磷农药的分子结构和化学性质.浙江林学院学报.1988，5(3):318-327.)。痕量二硫代磷酸酯类农药代谢物的检测方法主要有气相色谱法，由于代谢物结构不稳定，气相色谱法采用五氟苄基苯(PFBBr)对代谢物进行衍生化处理，但存在衍生时间长，灵敏度不高等问题(杨玉林，芮振荣，王宏，等.气相色谱法分析尿样中六种有机磷农药代谢产物[J].中国卫生检验杂志，2003, 13(1):24 ;邬春华，郑力行，周志俊.尿中有机磷农药代谢产物的测定[J].复旦学报，2006，33 (4):552-554);采用五氟溴苄基苯(PFBBr)衍生时，将羟基屏蔽以减小0，O- 二甲基二硫代磷酸酯或0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的活性，再进行气相色谱-FPD法进行检测，实际测得土壤中0，O- 二甲基二硫代磷酸酯或0，O- 二乙基二硫代磷酸酯灵敏度分别为0.5mg/kg和1.0mg/kg，远低于液相色谱_质谱法。
[0005]此外，O, O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯遇热甲基化为三甲基硫代磷酸酯和0，O-二乙基-S-甲基二硫代磷酸酯(如图1)，转化效率不高，且转化速率较慢，因而峰形对称性不好，峰形不尖锐，无法准确定量。
[0006]二硫代磷酸酯类农药代谢物极性较强，使用普通的液相色谱柱无法保留，即使使用对极性化合物保留较强的HILIC液相色谱柱，仍很难保留且无法将两种化合物进行分离，因此无法采用液相色谱-质谱法直接进行检测。采用液相色谱-串联质谱法直接测定二硫代磷酸酯类农药代谢物，色谱保留时间过短，代谢物无法完全分离，造成基质效应过高，实际样品灵敏度较低(Schenke D..Analytical Method for the determinationof 0, O-diethylphosphate and 0，O-diethylthiophosphate in faecal sample[J].Chemosphere, 2000，41:1313-13201 ;刘倩，谢曼丹，朱育芬.硫逐磷酸酯和二硫代磷酸酯的电喷雾电离质谱[J].分析测试学报.2000, 19(5):24-27.)。
[0007]总之，采用气相色谱测定二硫代磷酸酯类农药代谢物(0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯)时，以五氟溴苄基苯作为衍生化试剂，存在衍生时间长，灵敏度低的缺陷，而且这种衍生化试剂不适合在液相色谱-串联质谱上检测；直接采用液相色谱-串联质谱的检测方法又存在无法保留，灵敏度低等问题。
【发明内容】
[0008]针对现有的二硫代磷酸酯类农药代谢物检测方法所存在的缺陷，本发明提供了一种新的二硫代磷酸酯类农药代谢物的高效液相色谱-串联质谱检测方法，该方法采用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸作为二硫代磷酸酯类农药代谢物的衍生化试剂，所获得的衍生化产物易溶于水相，适合液相色谱-质谱检测，检测灵敏度远高于五氟溴苄基苯衍生后用气相色谱进行检测的方法，且衍生时间也显著缩短。
[0009]为此，本发明首先提供了 3-溴甲基-4-硝基苯甲酸作为二硫代磷酸酯类农药代谢物高效液相色谱-串联质谱检测的衍生化试剂的新用途；
[0010]本发明进一步提供了一种二硫代磷酸酯类农药代谢物的高效液相色谱-串联质谱检测方法，该方法包括:将待检测的含有二硫代磷酸酯类农药代谢物的土壤样品进行前处理，得到二硫代磷酸酯类农药代谢物提取物；用衍生化试剂将提取物进行衍生化处理，获得衍生化产物；将衍生化产物用液相色谱-串联质谱进行检测，获得样品中二硫代磷酸酯类农药代谢物的含量；其中，所述的衍生化试剂是3-溴甲基-4-硝基苯甲酸。
[0011]本发明通过实验发现，3-溴甲基-4-硝基苯甲酸极性与二硫代磷酸酯类农药相似，在乙腈中溶解度高，结构小于五氟溴苄基苯，亲和取代位阻较小，更有利于衍生化反应的进行，采用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸对二硫代磷酸酯类农药代谢物进行衍生化处理，衍生化产物易溶于水相，适合液相色谱-质谱检测，检测灵敏度远高于五氟溴苄基苯衍生后用气相色谱进行检测，衍生时间缩短，更适合二硫代磷酸酯类农药代谢物的检测。
[0012]本发明中所述的二硫代磷酸酯类农药代谢物优选为0，O- 二甲基二硫代磷酸酯或
O,O-二乙基二硫代磷酸酯；
[0013]本发明特别提供了一种0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯的高效液相色谱-串联质谱检测方法，该方法包括:将待检测的含有0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的土壤样品进行前处理，获得0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和
O,O-二乙基二硫代磷酸酯的提取物；用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸对0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的提取物进行衍生化处理，获得衍生化产物；将衍生化产物用液相色谱-串联质谱进行检测，获得样品中0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基~ 硫代憐Ife酷的含量。
[0014]本发明优选在氮气保护加热条件下对二硫代磷酸酯类农药代谢物进行衍生化处理。
[0015]本发明检测方法中所述的前处理方式依次包括:(1)从土壤样品中提取得到二硫代磷酸酯类农药代谢物提取物；(2)将提取物进行净化处理。
[0016]步骤(I)中所述的从土壤样品中提取得到二硫代磷酸酯类农药代谢物提取物的方法包括:将土壤样品风干后加入丙酮作为提取溶剂进行振荡提取，将提取液离心后，取上清液；将上清液旋转蒸发近干后用乙酸乙酯溶解得到二硫代磷酸酯类农药代谢物提取物。有机磷农药及其代谢产物在乙酸乙酯、乙腈及CHCl3等试剂中均有较好的溶解度，考虑到对环境的污染及乳化问题，通常提取试剂宜采用乙腈、丙酮或乙酸乙酯。土壤中成分较为复杂，腐殖质含量高的土壤色素含量较高，而乙酸乙酯对色素的提取效率不高，提取物色素类杂质含量较低，而且乙酸乙酯可以有效地降低土壤中各种无机盐类的溶解，因此本发明优选采用乙酸乙酯作为提取溶剂从土壤中提取二硫代磷酸酯类农药代谢物，再用活性炭小柱再除去残留的色素，效果较为理想。
[0017]在对二硫代磷酸酯类农药代谢物提取物进行净化处理时，本发明最初的试验中采用反相C18净化小柱对提取物进行浓缩，浓缩后用5%甲醇的乙酸氨溶液溶解过柱，由于
O,O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯极性较强，固相萃取柱保留效果不好，损失较大；本发明通过进一步的试验发现，将土壤样品用乙酸乙酯溶解后用活性炭去掉残留的色素后，再采用弗罗里硅土串联小柱可以有效除去土壤中的色素及大分子的非极性有机物，净化效果较好，因而本发明优选采用活性炭小柱加弗罗里硅土串联固相萃取柱的正相净化方式对提取物进行净化。
[0018]本发明将衍生产物用ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱分离，流动相为乙腈和5mmol的乙酸铵，采用梯度洗脱模式，XEVO TQ三重四极质谱仪检测，采用负多反应监测模式。
[0019]本发明将0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯的衍生产物进行质谱分析发现，两种物质的分子离子峰分别为336和365，丰度较高，说明反应产物纯度较高，质谱电离较好。336和365进行二级电离，分别可以得到292、157、125和321、185、153等离子，也说明336和365分别为0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的衍生产物，292是0，O- 二甲基二硫代磷酸酯衍生产物脱掉羧基后的离子，157是0，O- 二甲基二硫代磷酸酯的离子峰，两个离子都具有特征性，而292分子量大干扰少，且响应值较高；因此，本发明选择192和157作为0，O- 二甲基二硫代磷酸酯衍生产物的监测离子，192为定量离子；0，O- 二乙基二硫代磷酸酯与0，O- 二甲基二硫代磷酸酯相似，衍生产物的监测尚子分别为321和185,321为定量尚子。
[0020]回收率、精密度、定量限及线性实验表明，本发明检测方法对于土壤中0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的回收率为79.3?90.7%，精密度为9.38%和
5.93%，检出限为0.01mg/kg和0.005mg/kg,在0.005?1.000mg/kg范围内线性相关系数为
0.9992和0.9997，具有良好的回收率、定量限、精密度和线性，符合农产品中农药残留及其代谢物检测方法的要求，适合于科研或日常工作中有机磷农药代谢物的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1 0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的结构式。[0022]图2 3-溴甲基-4-硝基苯甲酸对二硫代磷酸酯类农药代谢物进行衍生化反应的通式。
[0023]图3 O, O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯衍生产物质谱图。
[0024]图4 0.01 μ g/mLO, O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯衍生产物多反应监测质谱图。
【具体实施方式】
[0025]通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。仪器与试剂
[0026]液相色谱-质谱/质谱联用仪(Waters公司)；振荡器(IKA公司)；固相萃取装置
坐寸ο
[0027]二硫代磷酸酯类农药代谢产物标准品:0，O- 二甲基二硫代磷酸酯(0，0-dimethyldithiophosphrate, 97%,维赛诺化学技术有限公司)，0，O- 二乙基二硫代磷酸酯(O, 0-diethyl phosphorodithioate,97%,维赛诺化学技术有限公司)，标准品用乙腈溶解，4°C冰箱保存，使用时用流动相定容；衍生试剂:3_溴甲基-4-硝基苯甲酸(Sigma);500mg6mL活性炭固相萃取柱及500mg6mL弗罗里娃土固相萃取小柱(Supelco);乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯试剂。
[0028]实施例1 土壤中0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯含量的高效液相色谱-串联质谱检测方法的建立
[0029]1、实验方法
[0030]1.1、样品前处理及衍生
[0031]土壤样品风干后，过40目筛，称取约5g (精确到0.0lg)于50mL离心管中，加入20mL丙酮,镟润混勻后,用振荡器振荡提取IOmin,然后4000r/min离心5min,取上层清液，残渣在提取一次，合并提取液，旋转蒸发至近干，用2mL乙酸乙酯溶解，过500mg6mL活性炭和500mg6mL弗罗里硅土串联固相萃取柱(小柱经5mL乙酸乙酯活化处理)，再用ImL乙酸乙酯洗涤样品瓶两次，过串联小柱，再用5mL乙酸乙酯洗脱固相萃取柱，流出液氮吹至近干。
[0032]残渣用200 μ L乙腈溶解，加入干燥后的无水碳酸钾约10mg，3_溴甲基_4_硝基苯甲酸30 μ L，充入氮气后密封瓶口，置于50°C烘箱中衍生化反应5h，反应完成后加入ImL乙腈和5mmol乙酸铵(V:V=25:75)的流动相，尽快进行测定。
[0033]1.2、液相色谱条件
[0034]液相色谱为Waters ACQUITY Ultra Performance液相色谱系统,并配有溶剂管理器，液相色谱柱采用 ACQUITY UPLC BEH C18 (50mmX2.lmm1.d.，1.7um)，柱温 30°C，流动相溶剂A为乙腈，溶剂B为5mmol的乙酸铵，采用梯度洗脱模式(表I)。
[0035]表I 0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯衍生产物优化后的液相色谱梯度洗脱条件
[0036]
【权利要求】
1.3-溴甲基-4-硝基苯甲酸作为二硫代磷酸酯类农药代谢物衍生化试剂的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于:所述二硫代磷酸酯类农药代谢物指示物是O，O- 二甲基二硫代磷酸酯或O，O- 二乙基二硫代磷酸酯。
3.—种二硫代磷酸酯类农药代谢物的高效液相色谱-串联质谱检测方法，该方法包括:将待检测的含有二硫代磷酸酯类农药代谢物的土壤样品进行前处理，得到二硫代磷酸酯类农药代谢物提取物；用衍生化试剂将提取物进行衍生化处理，获得衍生化产物；将衍生化产物用液相色谱-串联质谱进行检测，获得样品中二硫代磷酸酯类农药代谢物的含量；其特征在于:所述的衍生化试剂是3-溴甲基-4-硝基苯甲酸。
4.按照权利要求3所述的高效液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于:氮气保护加热条件下用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸对二硫代磷酸酯类农药代谢物进行衍生化处理。
5.按照权利要求3所述的高效液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，所述的前处理依次包括:(I)从土壤样品中提取得到含有二硫代磷酸酯类农药代谢物的提取物；(2)将提取物进行净化处理。
6.按照权利要求5所述的高效液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于:步骤(I)中采用以下方式将土壤样品中提取得到含有二硫代磷酸酯类农药代谢物的提取物:将土壤样品风干后加入丙酮作为提取溶剂进行振荡提取，将提取液离心后，取上清液；将上清液旋转蒸发近干后用乙酸乙酯溶解得到二硫代磷酸酯类农药代谢物提取物；步骤(2)中采用正相净化方式对提取物进行净化。
7.按照权利要求6所述的高效液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于:步骤(3)中所述的正相净化方式是采用活性炭小柱加弗罗里硅土串联固相萃取柱的正相净化方式对提取物进行净化处理。
8.按照权利要求3所述的高效液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于:将衍生化产物用ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱分离，流动相为乙腈和5mmol的乙酸铵，采用梯度洗脱模式；收集的洗脱物用XEVO TQ三重四极质谱仪进行检测，采用负多反应监测模式。
9.一种0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯的高效液相色谱-串联质谱检测方法，该方法包括:将待检测的含有0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯的土壤样品进行前处理，得到含有0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的提取物；用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸对提取物进行衍生化处理，获得衍生化产物；将衍生化产物用液相色谱-串联质谱进行检测，获得样品中0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的含量。
10.按照权利要求9所述的高效液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于:选择192和157作为0，O-二甲基二硫代磷酸酯衍生化产物的监测离子，192为定量离子；选择321和185作为0，O- 二乙基二硫代磷酸酯衍生化产物的监测离子，321为定量离子。
【文档编号】G01N30/02GK103616456SQ201310674588
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】刘永, 宋金凤, 丁为民, 王洋, 胡志伟 申请人:黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心