专利名称：二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原及其制备方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种二乙氧基^l代磷酸酯 类有机磷农药半抗原及其制备方法。
背景技术：
农药残留问题严重危害着人民群众的身体健康。近年来，因不合 理使用农药而引起的群体性中毒和农产品农残超标事件屡有发生。农 药残留问题也严重影响了我国农产品的国际竞争力，农药残留标准成 为贸易技术壁垒的主要内容，近年来我国的蔬菜、茶叶等农产品和食 品因农药残留等问题被进口国拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同的
事件时有发生。2003年种植业农产品所受损失的金额高达41.1亿美 元。
有机磷类农药由于高效，廉价而在农业和种植业上广泛使用，但 是有机磷农药作为神经毒物，会引起神经功能紊乱、震颤、精神错乱、 语言失常等症状。在2002年中华人民共和国公布的第199号公告上 明令禁止在蔬菜、果树、茶叶、中草药材上不得使用和限制使用的农 药共有19种，其中有机磷农药占了 17种，而含二乙氧基硫代磷酸酯 共有结构的农药就有8种。根据农业部第194号、第199号和第274 号公告等规定，我国己经限制甲胺磷等19种高毒农药的使用，决定 对甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺等五种有机磷高毒农 药的使用进行削减，方案为2004年1月1日起禁止在除棉花以外的农作物使用，2007年1月1日起全面禁止在农业上使用。
加强农残检测、提高分析检测水平是控制农药残留的重要手段之 一。研究和完善农药残留的分析检测技术，尤其是免疫快速检测技术， 对于加强农药残留的监控管理、保障人民生命安全和农产品质量安 全、提高农产品在国际市场的竞争力、满足我国人民物质生活水平日 益提高的要求、促进我国经济发展具有重要意义。
目前国内外的农药残留免疫检测研究，基本上都集中于单组分特 异性检测及相应试剂盒的研制，但是实际生产中，食物中残留的农药 种类较多，单组分试剂盒很难实现快速高通量的检测，虽然仪器多残 留检测已经可以实现越来越多组分的多残留检测，但所需仪器复杂昂 贵，而且样品前处理繁琐费时，操作需专业人员、检测费用高，很难 适应许多场合快速检测的需要。因此，实现农药多残留快速检测，已 经是国内外残留分析的一种新趋势。
目前农药多残留免疫检测国内研究成果比较少，国外仅有少量用 多克隆抗体和单克隆抗体进行有机磷农药多残留免疫检测的研究报
道。Sudi， Johnson, Banks, Alcocer等相继研究了有机磷农药的共有 结构，设计出能够识别相似结构的"簇抗原"，利用交叉反应，制备 出"簇多克隆抗体"，并研究了该抗体对几种有机磷农药的选择性和 亲和力，其中有的"簇多克隆抗体"已经应用于有机磷农药多残留的 检测中，但有的抗体检测限较高，亲和力不够。2002年，Mi Soon Jang 报道了用其设计的两种半抗原免疫动物后制备的单克隆抗体实现了
一类有机磷农药的多残留检测。该抗体对部分有机磷农药检测的IC5C)为0.1 0.3 pg/mL，但设计的半抗原只有两种，不能通过构效关系筛 选更理想的半抗原用于制备单克隆抗体。2005年，刘金贤等公开了"用 于检测有机磷农药残留的免疫抗体及其应用"。该发明以二乙基膦酸 乙酸为半抗原，不需要进行结构改造即可与蛋白质偶联用于免疫动 物，从而制备的抗体可以检测多种有机磷农药，但可以检测的农药没 有针对性，检测限差异很大。可见本领域作为半抗原设计这个关键课 题还没有很好解决。
由于大多数药物、毒素、环境污染物分子质量比较小，属于仅有 反应原性而无免疫原性的半抗原，因此大部分小分子需要与大分子蛋 白质偶联后才能产生免疫原性。目前制备小分子半抗原抗体的常规方 法是选择具有毒理学意义的原形药物作为待测物，设计合成保留待测 物分子结构特征或类似结构特征并带有活性基团的半抗原，通过共价 键使半抗原与大分子蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫 程序制备针对半抗原的特异性抗体。而半抗原的提供是免疫化学分析 中最为关键的步骤，合理的半抗原设计和制备将大大提高抗体的质
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一系列可通用于一 类有机磷农药检测的半抗原，所述半抗原偶连载体蛋白后能使机体产 生效价高，能识别该类有机磷农药共有结构的特异抗体。
本发明的另一个目的是提供所述半抗原的制备方法。
本发明还有一个目的是提供所述半抗原的应用。本发明所指的一类有机磷农药共有结构是二乙氧基硫代磷酸酯。 本发明的技术方案是
提供一类半抗原，是二乙氧基硫代磷酰氯与带羧基的苯酚衍生物 或氨基酸亲核取代后的产物。
上述带羧基的苯酚衍生物或氨基酸优选具有式(A》、式(A )、 式(Am)、式(Aiv)、式(Av)、式(人vi)、式(Avn)、式(A )、式(A K)所示结构式的物质，(A!) (A )式中n为0 9的整数，(Aix) 式中n为3 7的整数
<formula>formula see original document page 10</formula><formula>formula see original document page 11</formula>
采用上述结构式(A》 (A!x)所示的带羧基的苯酚衍生物或氨基 酸与二乙氧基硫代磷酰氯亲核取代得到的半抗原(OP)的结构式分别 对应为(式(A,)对应式(B!)，依此类推)
<formula>formula see original document page 11</formula><formula>formula see original document page 12</formula>(Bix)
其中(B!) (B )式中n为0 9的整数，(BK)式中n为3 7的整数。
本发明同时提供了所述半抗原的制备方法是将二乙氧基硫代磷 酰氯和带羧基的苯酚衍生物手臂在0°C 60°C、缚酸剂存在的条件下， 于有机溶剂中进行反应，生成目标半抗原(OP)。
所述带羧基的苯酚衍生物手臂可选用带羧基的苯酚衍生物、氨基 酸，或者通过羟基苯甲醛和丙二酸或氨基苯酚和酸酐合成得到。
所述缚酸剂优选氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、金属钠、甲醇钠、 乙醇钠、吡啶或三乙胺的任意一种。
所述有机溶剂优选甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、丙酮或二 氯甲垸的任意一种或两种以上任意比例的混合物。
本发明提供的半抗原偶连载体蛋白后，能使机体产生效价高，特 异性好的针对含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药的抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明针对一类有机磷农药的共有结构一二乙氧基硫代磷酸酯 提供一系列半抗原，半抗原在分子结构，立体化学和电子分布上与含 二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药对应体相似。半抗原结构中 引入苯环平面，使之与蛋白质偶联后的全抗原更易于暴露在蛋白质载 体外面，因而更易于产生理想的抗体。所述半抗原的连接臂不易于诱导产生"臂抗体"，并且使用了一定长度的饱和或不饱和碳链，使机 体更易于识别。本发明所述半抗原分子具有便于与蛋白载体偶联的活 性基团，且活性基团的存在对待测物分子的电子分布没有影响。此半 抗原偶连载体蛋白后能使机体产生效价高，特异性好的针对含二乙氧 基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药的抗体，所述抗体可以检测绝大部 分含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药，对17种限制使用的 有机磷农药中的对硫磷、甲拌磷、特丁硫磷、治螟磷、内吸磷、硫环 磷、蝇毒磷、氯唑磷有很好的检测效果，对哒嗪硫磷，三唑磷等高效 低毒农药也具有较好的检测效果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。 实施例1半抗原B ! (11=0)的制备方法
(TC下，取0.884g (6.4mmo1)对羟基苯甲酸，0.898g (16mmo1) KOH溶解于50mL甲醇中。搅拌下逐滴加入1.81g (9.6mmo1) 二乙氧 基硫代磷酰氯，升温至65"C，搅拌反应18h。反应结束，反应旋转蒸 发浓縮，得到的粗产物，溶解于乙酸乙酯中，用50mL2MNaOH溶液 萃取，水层用6M盐酸酸化，析出沉淀，用水洗，得到产物1.05g，产 率为56.4% 。 ESI-MS analysis (negative) m/z 289 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.36(t, /=7.1Hz， 6H， CH3); 4.24(qd, J尸7.1Hz, J2=7.1Hz, J3=7.1Hz, /4=10.0Hz, 4H, CH2); 7.26(d， 《/=8.1， 2H, ArH); 8.09(d, /=8.5,2H，ArH). 实施例2半抗原B！ (11=0)制备方法0。C下，取0.884g (6.4mmo1)间羟基苯甲酸，0.898g (16mmo1) KOH溶解于50mL甲醇中。搅拌下逐滴加入1.81g (9.6mmo1) 二乙氧 基硫代磷酰氯，升温至65'C，搅拌反应18h。反应结束，反应旋转蒸 发浓縮，得到的粗产物，用乙酸乙酯溶解，溶液浓缩，氯仿甲醇= 8: l过硅胶柱，得到黄色固体0.5g，产率为27.0%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 289 [M隱H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.37(t, J二7.0Hz, 6H， CH3); 4.25(qd， J产7.1Hz, J^7.1Hz, J3=7.1Hz, /4=9.6Hz, 4H, CH2); 7.45(d,声4.7， 2H， ArH); 7.89(s， 1H, ArH); 7.94(d, 7=4.6, lH,ArH).
实施例3半抗原Bm 0=0)制备方法
取4.8848g (0.04moL)对羟基苯甲醛溶于吡啶中，加入催化剂量 DMAP，用干燥管保护，水浴85°C，搅拌。往上述溶液滴加3.746 (0.036moL)丙二酸，反应3h。反应结束，混合液倾入饱和碳酸氢钠 溶液中，搅拌15min，用乙酸乙酯萃取，水层用4M盐酸调pH至3， 析出白色固体2.32g，产率为78.6% 。ESI-MS analysis (negative) m/z 163 [M-H]國；1H-NMR (400 MHz, d6-Acetone and TMS): S 6.33(d, /=16.0Hz, 1H, CH=CH); 6.89(d， /=8.6Hz, 2H, ArH); 7.54(d, /=8.6Hz， 2H, ArH); 7.60(d, J^6.0Hz， 1H, CH=CH); 8.86(s, 1H, OH); 10.77(s, 1H, COO巧.
称取0.7 (0.0125moL) KOH溶于无水甲醇中，称取0.821g (0.005moL)上述固体，OT:搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加1.415g (0.0075moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，0。C反应过夜。反应结 束，过滤，上清液旋转蒸发浓縮，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液选装
14蒸发浓縮，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，搅拌25min，用乙酸乙酯萃 取，有机相浓縮析出结晶，用石油醚洗，得到产物0.75g，产率为11.9 %。 ESI画MS analysis (negative) m/z 315 [M-H]-; 1H-NMR (400固z, CDC13 and TMS): S 1.36(t, J产7.0Hz, /2=7.0Hz, 6H, CH3); 4.23(qd, J产7.1Hz, /2=7,lHz, /产7.1Hz，力^9.6Hz, 4H, CH2); 6.37(d， /=16.0Hz, m, CH=CH); 7.21(d, /=8.4Hz, 2H， ArH); 7.52(d， /二8.5Hz， 2H, ArH); 7.74(d， >/=16.0 Hz, 1H， CH=CH). 实施例4半抗原Biv (『0)制备方法
取9.77g (0.08moL)间羟基苯甲醛溶于吡啶中，加入催化剂量 DMAP，用干燥管保护，水浴85°C，搅拌。往上述溶液滴加7.492 (0.072moL)丙二酸，反应3h。反应结束，混合液倾入饱和碳酸氢钠 溶液中，搅拌15min，用乙酸乙酯萃取，水层用4M盐酸调pH至3， 析出白色固体11.82g，产率为75.2%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 163 [M-H]-; 1H画NMR (400固z， d6-Acetone and TMS): 5 6.45(d, / =16.0Hz, 1H， CH=CH); 6.卯(dd， J产2.1Hz, J^7.8Hz， 1H, ArH); 7.13(dd, ^:4.8Hz, J2=11.9Hz, 2H， ArH); 7.25(t, /=7.8Hz, 1H, ArH); 7.60(d, /=16.0Hz, 1H, CH=CH); 8.54(s, 1H, OH); 10.77(s, 1H, COOH).
称取4.48g (0.08moL) KOH溶于无水甲醇中，称取3.283g (0.02moL)上述固体，0。C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加5.658g (0.03moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，0。C反应过夜。反应结束， 过滤，上清液旋转蒸发浓縮，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液选装蒸发 浓縮，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，搅拌15min，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至3，析出沉淀，用水洗，得到产物1.25g，产 率为19.8% 。 ESI-MS analysis (negative) m/z 315 [M-H]-; 1H-NMR(400 MHz, CDC13 and TMS): S l.36(t,风lHz, 6H, CH3); 4.23(qd, J产7.1Hz, /2=7.1Hz, J3二7.1Hz, /产10.0Hz, 4H， CH2); 6.43(d, J=16.0 Hz， 1H, CH=CH); 7.22-7.23(m, 1H， ArH); 7.36(d,声5.4Hz， 3H, ArH); 7.74(d, 7=16.0 Hz， 1H, ArH); 7.73(d,声16.0， 1H, CH=CH). 实施例5 半抗原Bv (11=1)制备方法
分别取5.46g (0.05moL)对氨基苯酚和5g (0.05moL) 丁二酸酐 溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适量 饱和碳酸钾溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析出 灰紫色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物3.5g，产率33.5%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 208 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6- Acetone and TMS): S 2.61画2.67(m， 4H, CH2); 6.74-6.77(m， 2H， ArH); 7.45-7.47(m, 2H, ArH); 8.10(s, IH,丽)；8.98(s, 1H, OH); 10.712(s, 1H, COOH).
称取l.Olg (0.018moL) KOH溶于无水甲醇中，称取1.31g (0.006moL)上述固体，O-C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加1.1317g (0.006moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，(TC反应12h。反应结 束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓縮后过(氯仿甲醇=6: 1)硅胶 柱，得0.60g，产率27.6%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 360 [M誦H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.32(t, /=7.1Hz, 6H, CH3); 2.58(s, 2H, CH2); 2.69(s, 2H, CH2); 4.15画4.23(m, 4H， CH2); 7.06(d, /=7.9 Hz, 2H, ArH); 7.42(d, /=8.6 Hz, 2H, ArH); 8.11(s, 1H, NH).实施例6半抗原Bvi (11=1)制备方法
分别取5.46g (0.05moL) 3-氨基苯酚和5.0g (0.05moL) 丁二酸 酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适 量饱和碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析 出白色或淡黄色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物2.5g，产率23.9%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 208 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6-Acetone and TMS): S 2.64(s, 4H, CH2); 6.51(ddd， J产0.9Hz, /2=2.2Hz， J3=7.8Hz， 1H， ArH); 7.00(d， J:8.5Hz, 1H, ArH); 7.06(t, /=8.0Hz, 1H, ArH); 7.34(s, 1H, ArH); 8.24(s， 1H,NH); 9.09(s, 1H, OH).
称取1.68g( 0.03moL )KOH溶于无水甲醇中，称取2.09g( 0.01 moL ) 上述固体，0。C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加0.15g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，0。C反应12h。反应结束旋干，用 氯仿洗，过滤，上清浓縮后过(氯仿甲醇=6: 1)硅胶柱，得0.80g， 产率27.5%。 ESI陽MS analysis (negative) m/z 360 [M-H]國；1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.32(t, /产7.0 Hz, /2=7.0Hz， 6H, CH3); 2.60(t, /=6.3Hz， 2H, CH2); 2.69(t, J二6.2Hz, 2H, CH2); 4.19(dqd， J「0.6Hz, /产7.0Hz /3=6.9Hz， /4=6.9Hz, /5=9.6Hz, 4H, CH2); 6.87(d， J二7.5Hz， 1H, ArH); 7.19(td, /产8.0Hz, J2=8.0Hz， J3=15.9Hz， 2H, ArH); 7.48(s, 1H, ArH); 8.16(s， IH，皿). 实施例7半抗原Bv (11=2)制备方法
分别取5.46g (0.05moL)对氨基苯酚和5.7g (0.05moL)戊二酸 酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适
17量饱和碳酸钾溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析 出灰紫色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物7.034g，产率63.1%。ESI-MS analysis (negative) m/z 222 [M-H]画；1H-NMR (400 MHz, d6誦DMS0 and TMS): S l.77(p， /=7.4Hz, 2H, CH2); 2.26(dd, J产7.6Hz, J"^15.6Hz, 4H, CH2); 6.67(d, J=8.8Hz， 2H， ArH); 7.34(dd, J尸1.9Hz, /2=8.7他，2H, ArH); 9.15(s, 1H, NH); 9.61(s， 1H, OH).
称取1.68g (0.018moL) KOH溶于无水甲醇中，称取2.23g (0.01moL)上述固体，0。C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，O"C反应12h。反应结束旋 干，用氯仿洗，过滤，上清浓縮后过(氯仿甲醇=6: 1)硅胶柱， 得0.60g，产率19.8%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 374 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S l'30(t, J^7.1Hz, 6H， CH3); 1.87(s, 1H， CH2); 2.27(s， 4H, CH2); 4.13-4.20(m, 4H, CH2); 7.02(d, /=8.1Hz, 2H， ArH); 7.46(d, 7=7.7Hz, 2H， ArH); 8.62(s, 1H,丽). 实施例8半抗原Bvi (n-2)制备方法
分别取5.46g (0.05moL) 3-氨基苯酚和5.8g (0.05moL)戊二酸 酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加入适 量饱和碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2，析 出灰紫色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物6.7g，产率60.03%。ESI-MS analysis (negative) m/z 222 [M隱H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6-Acetone and TMS): S 1.93(p， ".4Hz, 2H， CH2); 2.39(td， J产7.4Hz, ^7.4Hz, /3=12.8Hz, 4H, CH2); 6.51(ddd, /产l.lHz, ^-2.3Hz, /3=7.9Hz, 1H, ArH);
187.01(dd,/产1.2Hz， J2=8.1Hz, 1H， ArH); 7.06(t, ^^8.0Hz, 1H， ArH); 7.36(t /=1.9Hz, 1H， ArH); 8.30(s, 1H, NH); 9.05(s, 1H， OH).
称取1.68g (0.018moL) KOH溶于无水甲醇中，称取2.23g (O.OlmoL)上述固体，0。C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，O匸反应12h。反应结束旋 干，用氯仿洗，过滤，上清浓縮后过(氯仿甲醇=6: 1)硅胶柱， 得0.72g，产率24.0°/。。 ESI-MS analysis (negative) m/z 374 [M-H]-; 1H画NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.34(dt, J产0.6Hz， J^7.0Hz, j3=7.0Hz, 6H, CH3); 2.02(p， /^7.1Hz, 2H, CH2); 2.44(td, /产7.1Hz, j2=7.1Hz, /3=11.4Hz, 4H, CH2); 4.21(qd, J产7.1Hz, J2=7.1Hz， Js=7.0Hz, /广9.8Hz, 4H, CH2); 6.90(d, J=7.2Hz， 1H, ArH); 7.24(q, J尸8.2Hz, 力二8.2Hz, ^二8.1Hz， 2H， ArH); 7.49(s， 1H， ArH); 7.67(s, 1H， NH). 实施例9半抗原Bvb (n-O)制备方法
分别取5.46g (0.05moL)对氨基苯酚禾口 4.903g (0.05moL)顺丁 烯二酸酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。 加入适量饱和碳酸钾溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH 至2，析出草绿色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物5.546g，产率53.5%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 206 [M誦H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6画Acetone and TMS): S 6.33(d， /=12.8Hz, 1H, CH=CH); 6.67(d, 7=12.8Hz， 1H， CH=CH); 6.84-6.88(m， 2H, ArH); 7.54(td, J尸2.5Hz, /2=2.5Hz, /产10.1Hz， 2H, ArH); 8.51(s, 1H, NH); 10.26(s, 1H, OH); 15.22(s, 1H, COOH).称取1.68g (0.018moL) KOH溶于无水甲醇中，称取2.072g (O.OlmoL)上述固体，0。C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，(TC反应12h。反应结束旋 干，用氯仿洗，过滤，上清浓縮后过(氯仿甲醇=6: 1)硅胶柱， 得1.2g，产率42.0%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 358 [M-H]-; 1H-NMR (400画z, CDC13 and TMS): S L33(t， /=7.0Hz， 6H, CH3); 4.17-4.24(m, 4H， CH2); 6.37(d,/=12.1Hz, IH, CH=CH); 6.71(d，《/=9.5Hz, IH, CH=CH); 7.15(d,声7.2Hz， 2H, ArH); 7.66(d, /=7.8Hz, 2H， ArH); 10.03(s， IH,NH).
实施例10半抗原Bvi (11=0)制备方法
分别取5.46g (0.05moL) 3-氨基苯酚和4.9g (0.05moL)顺丁烯 二酸酐溶于无水吡啶中，后者滴加入前者，室温搅拌反应30min。加 入适量饱和碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH至2， 析出灰紫色固体，用蒸馏水洗，干燥得到产物7.544g，产率72.93%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 206 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO and TMS): S 6.50(ddd， J产0.8Hz， J尸2.3Hz， /3=8.0Hz, 1H, CH=CH); 6.64(d, /=15.4Hz, IH, CH=CH); 7.04(d, /=8.1Hz, IH, ArH); 7.12(dd, J产11.8Hz, /2=20.4, 2H， ArH); 7.26(t， /=2.1Hz, IH, ArH); 9.46(s, IH, NH); 10.36(s, 1H， OH); 12.97(s, IH, COOH).
称取1.68g (0.018moL) KOH溶于无水甲醇中，称取2.072g (O.OlmoL)上述固体，0。C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，O"反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓縮后过(氯仿甲醇=6: 1)硅胶柱，
得0.9g，产率31.5%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 358 [M-H]-; 1H-NMR (400固z, CDC13 and TMS): S l.36(t, /=7.0Hz, 6H, CH3); 4.24(qd, /产7.1Hz, J2=7.1Hz, /3=7.1Hz, J4=14.2Hz, 4H, CH2); 6.42(d, /=12.0Hz, 1H, CH=CH); 6.50(d, /=7.0Hz， 1H, CH=CH); 7.33(dd, J尸7.4Hz， J尸15.5Hz， 2H, ArH); 7.63(s, 1H, ArH); 8.81(s， 1H, NH). 实施例11 半抗原Bk (11=3)制备方法
称取1.68g (0.018moL) KOH溶于无水甲醇中，称取l.OOg (0.01moL)氨基丁酸，0。C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，0。C反应12h。反应结束旋 干，用氯仿洗，过滤，上清浓縮后过(氯仿甲醇=3: 1)硅胶柱， 得1.14g,产率56.0%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 254 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.27(t, /=7.0Hz， 6H, CH3); 1.77(p, /=6.9Hz, 2H, CH2); 2.39(t, /=7.3Hz, 2H, CH2); 2.98(td, J产6.8Hz, 72=6.8Hz, j3=6.8Hz, J4=ll.lHz， 2H， CH2); 4.01 (ddd, J尸1.4Hz, /2=7.3Hz, 73=15.9Hz, 4H, CH2). 实施例12半抗原Bix (11=5)制备方法
称取1.68g (0.018moL) KOH溶于无水甲醇中，称取1.31g (O.OlmoL)氨基己酸，0。C搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，O"C反应12h。反应结束旋 干，用氯仿洗，过滤，上清浓縮后过(氯仿甲醇=3: 1)硅胶柱， 得1.36g，产率60.0%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 282 [M-H]隱;1H画NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S l.26(t,声7.1Hz, 6H, CH3); 1.33(dt， J尸4.5Hz, J2:8.6Hz, J^8.8Hz, 2H， CH2); 1.45(td, J产7.2Hz, /2=7.2Hz, /3=14.3Hz, 2H, CH2); L55-1.63(m, 2H， CH2); 2.3 l(t， /=7.4Hz, 2H, CH2); 2.89(tdJ产7.0Hz,J尸7.0Hz,Jfl 0.5Hz, 2H, CH2); 3.96-4.03(m: 4H， CH2).
实施例13免疫原OP-BSA的制备方法
取半抗原(OP)0.12mmo1溶于2mlDMF中，搅拌加入DCC29.7mg 和NHS16.6mg。 4。C下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称 取BSA136mg溶于10ml浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，搅拌溶解 制备B液。磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4'C下反应12h。离 心后，取上清夜，fC下用生理盐水透析3d，每天更换4次透析液。 得到的免疫原OP-BSA以lmg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中。冻 存于-2(TC冰箱中，供免疫用。
免疫原鉴定对载体蛋白BSA，半抗原OP和免疫原OP-BSA进 行紫外扫描测定(200 400nm)，发现免疫原OP-BSA与BSA和半抗 原OP相比，吸收曲线有明显改变，说明半抗原OP与BSA偶连成功。 实施例14包被原OP-OVA的制备方法
取半抗原(OP)0.12mmo1溶于2mlDMF中，搅拌加入DCC29.7mg 和NHS16.6mg。 4。C下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称 取BSA136mg溶于10ml浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，搅拌溶解 制备B液。磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4'C下反应12h。离 心后，取上清夜，4"C下用生理盐水透析3d，每天更换4次透析液。得到的包被原OP-OVA以lmg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中。冻 存于-2(TC冰箱中，供免疫用。
包被原鉴定对载体蛋白OVA，半抗原OP和包被原OP-OVA进 行紫外扫描测定(200 400nm)，发包被原OP-OVA与载体蛋白OVA 及半抗原OP相比，吸收曲线有明显改变，说明半抗原OP与载体蛋 白OVA偶连成功。
实施例15多克隆抗体的制备方法及抗体效价测定
多克隆抗体的制备将免疫原解冻，然后加入等剂量的佐剂(第1 次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)用搅拌 器乳化。完全乳化后，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘 静脉多种注射方式免疫6只体重为2.5 3kg的健康新西兰大白兔。 第一次免疫隔一个月后每两周加强免疫一次。第4次加强免疫后l周 耳缘静脉采血，并利用间接ELISA测定血清效价。当效价不再上升时， 采用耳缘静脉加强免疫。1周后心脏采血，室温静置0.5 lh,于4'C 冰箱过夜后吸取上层析出的血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化得到 多克隆抗体，透析后冷冻干燥成粉末，于-2(TC下保存备用。
抗体效价的检测间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于 阴性血清的测定值为准，测得抗体的阳性滴度为1:512000以上。 实施例16抗体亲和性及特异性试验
将不同浓度的有机磷标准品与抗体一起进行间接竞争ELISA反 应，测定其抑制率，以确定抗体对多种有机磷标准品的亲和性。各 种有机磷的抑制中浓度ICso见表1。以上实验结果说明由所设计半抗原制备的免疫原免疫产生的抗 体能够检测大多数含二乙氧基硫代磷酸酯的有机磷农药，具有灵敏度 高，检测方便等优点。
表1不同有机磷农药对抗体的抑制效果
竞争药物IC50 (ng/mL)
对硫磷Parathion0.140
辛硫磷Phoxim0.310
毒死蜱Chlorpyrifos2.069
二嗪磷Diazinon7.074
虫竜毒憐Coumaphos0.013
除线磷Dichlofenthion0.247
乙基溴硫磷Bromophos ethyl1.580
瞎嗪硫磷Pyridaphenthione0.863
喹硫磷Quinalphos0.021
三唑磷Triazophos0.035
硫环磷Phosfolan0.487
氯唑磷Isazofhos14.102
治螟磷Sulfotepp3.840
内吸磷Systox0.567
特丁硫磷Terbufos1.521
甲拌磷Phorate0.67权利要求
1、一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原，其特征在于所述半抗原为二乙氧基硫代磷酰氯与带羧基的苯酚衍生物或氨基酸亲核取代后的产物。
2、 根据权利要求1所述的半抗原，其特征在于所述带羧基的苯 酚衍生物具有式(AO所示结构，所述半抗原具有式(B》所示结构其中n为0 9的整数； 或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(An)所示结构，所述半 抗原具有式(B )所示结构(A》;(A0;(Bn);其中n为0 9的整数；或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(Am)所示结构，所述半抗原具有式(Bni)所示结构(Am);(Bm);其中n为0 9的整数；或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(Aw)所示结构，所述半抗原具有式(Brv)所示结构:/=<n(H2C)、 HO~</〉 OS i/=\ OH (Bjv);其中n为0 9的整数；或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(Av)所示结构，所述半 抗原具有式(Bv)所示结构<formula>formula see original document page 4</formula>其中n为0 9的整数；或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(Avi)所示结构，所述半抗原具有式(B一所示结构:<formula>formula see original document page 4</formula>其中n为0 9的整数；或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(Avn)所示结构，所述半 抗原具有式(B )所示结构<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>其中n为0 9的整数;或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(A )所示结构，所述半抗原具有式(B )所示结构<formula>formula see original document page 5</formula>其中n为0 9的整数；或者所述带羧基的苯酚衍生物具有式(AK)所示结构，所述半 抗原具有式(BK)所示结构<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>其中n为3 7的整数。
3、 一种权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于是将二 乙氧基硫代磷酰氯和带羧基的苯酚衍生物手臂在0°C 60°C、缚酸剂 存在的条件下，于有机溶剂中进行反应，生成目标半抗原。
4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述带羧基的 苯酚衍生物手臂为带羧基的苯酚衍生物或者氨基酸。
5、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述带羧基的 苯酚衍生物手臂为羟基苯甲醛和丙二酸或氨基苯酚和酸酐合成产物。
6、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述缚酸剂为 氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、金属钠、甲醇钠、乙醇钠、吡啶或三 乙胺的任意一种。
7、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述有机溶剂 为甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、丙酮或二氯甲烷的任意一种或 两种以上的混合物。
全文摘要
本发明公开了一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原及其制备方法。所述半抗原为二乙氧基硫代磷酰氯与带羧基的苯酚衍生物或氨基酸亲核取代后的产物。本发明针对一类有机磷农药的共有结构-二乙氧基硫代磷酸酯提供了一系列半抗原，所述半抗原在分子结构、立体化学和电子分布上与含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构有机磷农药对应体相似，在二乙氧基硫代磷酰酯氧原子上分别引入了长短不同的带有羧基的苯酚衍生物手臂，便于连接载体蛋白，本发明为抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体制备和快速检测产品开发提供了技术基础。
文档编号C07F9/00GK101475587SQ20091003652
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月9日 优先权日2009年1月9日
发明者孙远明, 徐振林, 杨金易, 沈玉栋, 弘 王, 谢桂勉, 雷红涛 申请人:华南农业大学