褪黑素快速检测方法及其检测卡和制备方法
【专利摘要】本发明公开一种褪黑素快速检测方法及其检测卡和制备方法，旨在提供一种使用方便，快速简便，灵敏度高的检测食品、保健食品或药品中掺杂褪黑素的快速检测方法及其所用检测卡，其技术要点：1）对需检测的产品加有机溶剂溶解，加缓释剂稀释后过滤，收集滤液；2）将步骤1）收集的滤液滴加于褪黑素胶体金层析检测卡上，判断待测样品为阳性或阴性，若控制C线和检测T线均显紫红色，则阴性；若控制线C显紫红色，检测线T不显色，则为阳性；胶体金检测试纸上的控制线C和检测线T均不显色，或只出现检测线T显色，则说明实验无效；属于生物检测【技术领域】。
【专利说明】褪黑素快速检测方法及其检测卡和制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测方法，具体的说，是一种褪黑素的快速检测方法及试剂盒，属于生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]褪黑素又称松果体素，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是人体大脑内松果体分泌的一种吲哚胺类激素。其分泌随着光照的增加而减少，故又被称为黑暗荷尔蒙。褪黑素主要用于调节人体的清醒和睡眠周期，诱导生理睡眠，以及抗衰老等。
[0003]褪黑素是一种内源性激素，有研究表明，大量使用褪黑素可能会引发呼吸问题，产生宿醉效应，同时褪黑素会影响某些镇静安眠药物如氯硝西泮的作用。在欧洲，褪黑素的服用周期、适用人群以及剂量均有严格限制。在美国，褪黑素以膳食补充剂的形式销售，但其说明书上需明确标示含量及使用剂量。在我国，褪黑素仅可作为保健食品，且有明确的使用规定:日服用剂量为I?3mg，不得添加除维生素B6以外的其他成分，注意事项中应注明从事驾驶、机械作业或危险操作者不要在操作前或操作中食用，自身免疫症(类风湿等)及甲亢患者慎用。故当需服用褪黑素时最好遵循医嘱，以明确使用剂量，儿童使用更需要谨慎。
[0004]但是近年来，一些不法分子利用褪黑素的镇静、催眠的良好作用和健康产品成分复杂的特点，在镇静催眠类健康产品中擅自添加褪黑素，服用者在不知情的情况下服用该类产品，易引发不良后果，给人民群众的身体健康造成了严重危害。
[0005]目前，在镇静安神类中成药和保健食品中是否掺杂褪黑素的检测方面主要有以下几种方法:
[0006]1、理化反应的快速筛查方法
[0007]样品中的待测成分经乙酸乙酯提取后，向提取液中加入对二甲氨基肉桂醛盐酸乙醇溶液，通过观察溶液颜色的变化来判断，样品中是否含有褪黑素化学成分。若溶液颜色在30秒内呈现明显蓝色至绿色，则提示样品中可能含有褪黑素成分。
[0008]该方法的优点在于不需要昂贵的分析仪器，检测成本低，可快速、简便的进行检测，对环境的要求不高，对操作人员的专业要求也不高，可满足现场检测的需求。但该方法也存在以下缺点:
[0009]试剂以对二甲氨基肉桂醛盐酸乙醇溶液为显色剂，该试剂的稳定较差，长时间放置容易导致试剂灵敏度不足，需临用前配制，对于现场检测来说较为繁琐。
[0010]试剂中使用的盐酸乙醇溶液，具有一定的腐蚀性，并且提取剂乙酸乙酯，具有一定的气味，对于现场操作人员具有一定的危害性。而且方法的灵敏度较低，受样品本身的颜色干扰较大，影响实验结果的判断，容易产生误判。
[0011]2、薄层色谱法
[0012]样品中的待测成分经过甲醇提取，所得供试品溶液与对照品溶液在硅胶板上经展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯254nm下检视。在展开剂的作用下，由于不同物质的迁移速度不同，不同物质在薄层色谱板上的不同位置以斑点的形式出现，根据待测样品是否在与对照品相应的位置出现斑点这一实验现象来判断待测样品中是否含有目标成分。如果供试品溶液薄层色谱图与褪黑素对照品相应位置出现斑点，则提示样品中可能含有褪黑素成分。
[0013]薄层色谱法的优点是不需要昂贵的分析仪器。该法缺点是:色谱分辨率较低，中成药成分复杂，干扰因素多，容易产生误判。
[0014]色谱展开和晾干所需时间较长，不足以满足快速测定的要求。薄层色谱板需要烘干并干燥存放，分离效果受环境因素影响较大，不适合现场检测。需要有固定的场所，不合适作流动性大的现场检测。对检测人员的专业技术要求较高，不适合基层人员现场操作。
[0015]3、高效液相色谱法
[0016]高效液相色谱法是常用的现代分析方法，在相同的色谱条件下，不同的物质有不同的色谱保留时间。在相同的色谱条件下褪黑素对照品溶液与样品提取所得供试品溶液分别进样，根据色谱保留时间可判断待测样品是否含有褪黑素成分。
[0017]高效液相色谱法的优点是色谱分离效率高、灵敏度高。但目前也存在以下缺点:仪器价格昂贵，样品前处理时间长，色谱柱易受污染，分析成本高；当共存成分的色谱峰保留时间与褪黑素色谱保留时间接近时容易造成误判；仪器对环境的要求高，需固定放置，不适合现场检测。
[0018]4、高效液相色谱-质谱联用法
[0019]以高效液相色谱仪作为分离器，质谱仪作为分析器的高效液相色谱-质谱联用法适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测结果的可靠性。但高效液相色谱-质谱联用法是一种分析成本比高效液相色谱更高，操作更加复杂的分析方法。仪器对环境的要求更高，需要固定放置，不合适现场检测。目前这些检验只能在少数实验室中进行，不易推广使用。
[0020]综上所述，目前在中成药和保健食品中是否掺杂褪黑素的检测方面，虽然有适合现场检测的理化反应快速筛查方法发布，但尚一种灵敏度，操作简单，进行快速筛查褪黑素的方法，对于药店和基础药检单位，开发中成药和保健食品中非法掺杂褪黑素的快速筛查方法，在监管现场对样品进行快速分析，为中成药和保健食品监管及时提供证据，打击不法分子的造假行为和保障人民群众的用药安全是非常必要的。
【发明内容】
[0021]针对上述不足，本发明的目的在于提供一种使用方便，快速简便，灵敏度高的检测食品、保健食品或药品中掺杂褪黑素的快速筛查方法及其所用检测卡。
[0022]为解决上述技术问题，本发明提供的前一技术方案是这样的:该褪黑素的快速检测方法，依次包括下述步骤:
[0023]I)对需检测的产品加有机溶剂溶解，加缓释剂稀释后过滤，收集滤液；
[0024]2)将步骤I)收集的滤液滴加于褪黑素胶体金层析检测卡上，开始计时，3?5min后，根据胶体金试纸条的检测T线和控制C线的显色，判断待测样品为阳性或阴性；
[0025]3)步骤2)所述的胶体金检测试纸上的控制C线和检测T线均显紫红色，则判断为阴性，即待测样品中未掺杂褪黑素化学成分；胶体金检测试纸上的控制线C显紫红色，检测线T不显色，则判断为阳性，即待测样品中含有褪黑素化学成分；胶体金检测试纸上的控制线C和检测线T均不显色，或只出现检测线T显色，则说明实验无效，应用新的胶体金检测试纸重新检测。
[0026]上述的褪黑素的快速检测方法步骤I)所述的有机溶剂为醇类有机溶剂或氯仿。
[0027]进一步的，上述的褪黑素的快速检测方法，所述的醇类有机溶剂为乙醇。
[0028]进一步的，上述的褪黑素的快速检测方法，步骤I)所述的缓释剂为PBS缓冲液。
[0029]本发明另外一个技术方法，是提供一种检测褪黑素的检测卡，包括PVC板和PVC板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，其特征在于:所述的金标接合垫为吸附褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物的玻璃纤维，在包被膜上依次用褪黑素偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐性检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐性质控线C线，两条线平行排列。
[0030]进一步的，上述的检测卡，所述的包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述的兔IgG的用量为0.2~0.9 μ g/cm2 ;所述的褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物的用量为0.09~0.5 μ g/cm2 ;所述的褪黑素单克隆抗原的用量为0.03~0.1 μ g/mm ;所述的羊抗兔IgG的浓度为4mg/ml,所述羊抗兔IgG的用量为0.03~0.05 μ g/mm。
[0031]本发明最后一个技术方案提供该检测卡的制备方法，在PVC板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫；
[0032]其中:
[0033]I)包被膜的制备方法是:
[0034]用ρΗ7.4，0.01M PBS缓冲液、10%~20%蔗糖将褪黑素抗原稀释到0.3~1.0mg/ml,喷至硝酸纤维膜上，每300mm的喷量为30ul,为T线；羊抗兔IgG稀释到0.3mg/ml~0.5mg/ml，每300mm的喷量为30ul，为C线，C、T线的间距为4.5mm，烘箱45°C中放置12~18小时；
[0035]2)金标结合垫的制备方法是:
[0036]用高纯水将1%的氯金酸稀释浓度为0.01%，放入磁力搅拌子，置于恒温磁力搅拌加热套上煮沸，剧烈沸腾后每100mL氯金酸稀释液一次性迅速加入0.7ml的柠檬酸三钠，继续煮沸，至颜色保持红色不再发生改变停止加热，冷却至室温后补充损耗的高纯水，得透亮，无杂质和漂浮物的胶体金；
[0037]取半径为15nm~40nm的胶体金颗粒，调pH值到7.0~7.4,在搅拌下按10 μ g抗体/ml胶体金加入褪黑素单克隆抗体，最后每1ml加入IOOul 10%BSA使其稳定，在12000rpm/s离心30min,弃上清液,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的0.01MpH8.5的Tris-HCl 缓冲液，1%。~5%。PVP-40, 5%BSA, 0.1%。~0.5%。NaN3 重悬；
[0038]将褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物用0.01M pH8.0的Tris-HCl 缓冲液，1%?~5% PVP-40, 5%BSA, 1%?~5% TritonX-100,0.1%?~0.5% NaN3 稀释至3%~10%，取玻璃纤维，每张涂布20ml~30ml，置烘箱，在37°C保温18~24小时；或者把褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物每IOOul用0.01M pH8.0的PBS、5%BSA，0.1%。~0.5%。NaN3稀释至150~300ul，再加20%蔗糖，溶解混匀，用喷金设备喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上；
[0039]3)制样品垫
[0040] 取玻璃纤维，每张涂布20ml~30ml涂布溶液为0.01MpH7.4的PBS，1%BSA,l%TWEEN-20,0.1%。?0.5% NaN3，置烘箱在 37°C烘干 18 ?24 小时。
[0041]与现有技术相比，本发明提供的技术方案，具有如下优点:
[0042]1、本发明操作步骤简单，检测速度快，结果容易观察，可实现对大批量样品的快速筛查，大大降低检测成本，减少工作量，在食品药品监管中具有实际意义；
[0043]2、本发明针对待测样品成分复杂问题，对样品预处理方法进行优化，所需样品量少，仅需提取、稀释两步即可完成样品前处理。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1是本发明提供的检测试卡结构示意图；
[0045]图2是本发明提供的检测卡判定结果为阴性时示意图；
[0046]图3是本发明提供的检测卡判定结果为阳性时示意图；
[0047]图4是本发明提供的检测卡判定结果为无效时示意图。
【具体实施方式】
[0048]下面结合【具体实施方式】，对发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
[0049]实施例1
[0050]该褪黑素的快速检测方法，依次包括下述步骤:
[0051]I)对需检测的产品加醇类有机溶剂溶解，较优的醇类有机溶剂是乙醇，再加PBS缓释剂稀释后过滤，收集滤液；
[0052]其中:不同剂型样品溶解方法如下:
[0053]硬胶囊:旋开胶囊壳，取约I粒内容物。
[0054]软胶囊:用剪刀剪开胶囊壳，挤出约I粒内容物。
[0055]片剂:压碎成粉末，取约I片量。
[0056]丸剂:取每次服用量的1/2左右，压碎或剪碎。
[0057]向上述样品的任意一种样品加入有机溶剂，优选为乙醇，有机溶剂的使用量以浸没待测样品为宜，本发明选用I?2mL的使用量，基本上可覆盖不同剂型样品的需要。
[0058]为保证提取完全，振摇时间应不少于30秒，以适应各种剂型的需要。
[0059]通过实验发现，滴加至褪黑素胶体金试纸条上的滤液，若有机溶剂的浓度大于50%，则褪黑素胶体金试纸条不能正常使用，因而需加入ImL以上的PBS缓冲液进行稀释。同时，考虑到提取液在过滤过程中需损耗一定的溶液，因此本发明加PBS缓冲液进行稀释至总体积为10mL，既确保试纸的灵敏度，又保证有足够的提取液进行加样。
[0060]液体剂型:无需前处理，直接检测。
[0061]2)将步骤I)收集的滤液滴加于褪黑素胶体金层析检测卡上，开始计时，3?5min后，根据胶体金试纸条的检测T线和控制C线的显色，判断待测样品为阳性或阴性；
[0062]3)步骤2)所述的胶体金检测试纸上的控制C线和检测T线均显紫红色，则判断为阴性，即待测样品中未掺杂褪黑素化学成分；胶体金检测试纸上的控制线C显紫红色，检测线T不显色，则判断为阳性，即待测样品中含有褪黑素化学成分；胶体金检测试纸上的控制线C和检测线T均不显色，或只出现检测线T显色，则说明实验无效，应用新的胶体金检测试纸重新检测。
[0063]检测时所使用的检测卡，包括PVC板和PVC板5上依次衔接的样品垫1、金标结合垫2、包被膜3和吸水垫4组成，参阅图1，样品垫I压在金标结合垫2的1/2~1/3左右，金标结合垫2压在包被膜3的0.1~0.2cm, T线距离包被膜3下端6mm，C线距离包被膜3上端6mm, C、T间距为4.5mm,吸水垫压在包被膜0.1~0.2cm处。
[0064]其中:金标结合垫为吸附褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物的玻璃纤维，依次在包被膜上用褪黑素偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐性检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐性质控线C线，两条线平行排列。
[0065]所述的包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述的单克隆-兔IgG的用量为0.2~0.9 μ g/cm2,优选0.25~0.45 μ g/cm2,更优的选择为0.3 μ g/cm2,所述的褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物的用量为0.09~0.5 μ g/cm2,优选0.15 μ g/mm,所述的羊抗兔IgG的浓度为4mg/ml,所述羊抗兔IgG的用量为 0.03~0.05 μ g/mm,优选0.04 μ g/mm,所述的褪黑素单克隆抗原的用量为0.03~0.1 μ g/mm，优选0.05 μ g/mm。
[0066]该检测卡的制备方法是在PVC板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫；
[0067]其中:
[0068]I)包被膜的制备方法是:
[0069]用ρΗ7.4，0.01M PBS缓冲液、10%~20%蔗糖将褪黑素抗原稀释到0.3~1.0mg/ml,喷至硝酸纤维膜上，每300mm的喷量为30ul,为T线；羊抗兔稀释到0.3mg/ml~0.5mg/ml，每300mm的喷量为30ul，运转速度为80毫米/秒，泵压力IOOPa压力，移动长度290cm为C线，C、T线的间距为4.5mm，放45°C烘箱过夜12~18小时；
[0070]2)金标结合垫的制备方法是:
[0071]用高纯水将1%的氯金酸稀释成0.01%，放入磁力搅拌子，置于恒温磁力搅拌加热套上煮沸，剧烈沸腾后每100mL 一次性迅速加入0.7ml的柠檬酸三钠，继续煮沸，至颜色保持红色不再发生改变停止加热，冷却至室温后补充损失的水份，得到透亮，无杂质和漂浮物的胶体金，可保存一个月不发生改变。
[0072]取半径为15nm~40nm的胶体金颗粒，调pH值到7.0~7.4,在搅拌下按10 μ g抗体/ml胶体金加入褪黑素单克隆抗体,最后每1ml加入100ull0%的BSA使其稳定，在12000rpm/s离心30min,弃上清液,将沉淀用十分之一初始胶体金体积的IOOul的0.01MρΗ8.5 的 Tris-HCl 缓冲液，1%。~5%。PVP-40, 5%BSA, 0.1%。~0.5%。NaN3 重悬，置 4°C可放2个月左右；
[0073]把褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物用0.01M pH8.0的Tris-HCl 缓冲液，1%?~5% PVP-40，5%BSA，I %?~5% TritonX-100,0.1%?~0.5% NaN3稀释至3%~10%，取面积为25*30cm的玻璃纤维，每张涂布20ml~30ml，置烘箱，在37°C放置18~24小时；或者把褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物每IOOul 用 0.01M ρΗ8.0 的 PBS、5%BSA,0.1%。~0.5%。NaN3 稀释至 150 ~300ul，再加 20% 蔗糖，溶解混匀，用喷金设备喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上；所用的设备压力0.015~
0.02MPa，喷金参数为0.05~0.2ul/mm，运转速度为80毫米/秒，喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上，聚酯膜或玻璃纤维处理方法为:把聚酯膜或玻璃纤维放在处理液为3%。?5%o Tris, 5%BSA, 0.1%。?0.5%。NaN3中浸泡2小时，液体应完全没过聚酯膜或玻璃纤维，置37°C烘箱12?18小时。
[0074]3)制备样品垫
[0075]取25*30cm玻璃纤维，每张涂布20ml?30ml涂布溶液为0.0lM pH7.4的PBS，1%BSA, l%TWEEN-20,0.1%。-0.5%。NaN3,置烘箱 37 度 18 ?24 小时。
[0076]检测例I
[0077]市售保健食品某品牌牌美眠褪黑素胶囊(胶囊剂，标示服用量为每次2粒，标识“含褪黑素”，功效成分及含量显示:每IOOg含褪黑素282mg)
[0078]取本品胶囊剂I粒，旋开胶囊壳，取约I粒内容物置于样品管中，加入I?2mL氯仿溶解，大力振摇约Imin后，再加PBS缓释剂稀释作为待测液。用一次性小吸管吸取3滴待测液垂直滴加于褪黑素胶体金层析检测卡的加样孔中，开始计时，3min后判定结果为，参阅图3，胶体金检测试纸上的控制线C显紫红色，检测线T不显色，则判断待测样品中含有褪黑素化学成分，与功效成分及含量提示结果一致。
[0079]采用高效液相液相色谱法技术对本实施例的赛天仙牌美眠褪黑素胶囊进行验证检测，检测结果本品每粒含褪黑素1.lmg，与本发明的检测方法结果一致。
[0080]检测例2
[0081]市售某品牌保健食品A(胶囊剂，标示服用量为每次I?4粒，未标识“含褪黑素”)
[0082]取本品胶囊剂I粒，旋开胶囊壳，取约I粒内容物置于样品管中，加入I?2mL乙醇，大力振摇约Imin后，再加PBS缓释剂稀释作为待测液。用一次性小吸管吸取3滴待测液垂直滴加于褪黑素胶体金层析检测卡的加样孔中，开始计时，3min后判定结果，参阅图3:胶体金检测试纸上的控制线C显紫红色，检测线T不显色，则判断待测样品中含有非法添加褪黑素化学成分。
[0083]采用高效液相液相色谱法技术对本实施例的市售保健食品A进行验证检测，检测结果本品每粒含褪黑素0.9mg，与本发明的检测方法结果一致。
[0084]检测例3
[0085]市售某品牌保健食品安神补脑液(口服液，标示服用量为每次I支，未标识“含褪黑素”)
[0086]用一次性小吸管吸取3滴口服液垂直滴加于褪黑素胶体金层析检测卡的加样孔中，开始计时，3min后判定结果，参阅图2:胶体金检测试纸上的控制线C、检测线T均显紫红色，则判断待测样品中没有褪黑素化学成分。若出现图4所述的情况的，胶体金检测试纸上的控制线C和检测线T均不显色，或只出现检测线T显色，则说明检测无效。
[0087]采用高效液相液相色谱法技术对该品牌保健食品安神补脑液进行验证检测，检测结果为未检出褪黑素成分，与本发明的检测方法结果一致。
【权利要求】
1.一种褪黑素的快速检测方法，其特征在于，依次包括下述步骤: 1)对需检测的产品加有机溶剂溶解,加缓释剂稀释后过滤,收集滤液； 2)将步骤I)收集的滤液滴加在褪黑素胶体金层析检测卡上，开始计时，3~5min后，根据胶体金试纸条的检测T线和控制C线的显色，判断待测样品为阳性或阴性； 3)步骤2)所述的胶体金检测试纸上的控制C线和检测T线均显紫红色，则判断为阴性，即待测样品中未掺杂褪黑素化学成分；胶体金检测试纸上的控制线C显紫红色，检测线T不显色，则判断为阳性，即待测样品中掺杂有褪黑素化学成分；胶体金检测试纸上的控制线C和检测线T均不显色，或只出现检测线T显色，则说明实验无效，应用新的胶体金检测试纸重新检测。
2.根据权利要求1所述的褪黑素的快速检测方法，其特征在于，步骤I)所述的有机溶剂为醇类有机溶剂或氯仿。
3.根据权利要求2所述的褪黑素的快速检测方法，其特征在于，所述的醇类有机溶剂为乙醇。
4.根据权利要求1所述的褪黑素的快速检测方法，其特征在于，步骤I)所述的缓释剂为PBS缓冲液。
5.一种用于检测权利要求1所述的褪黑素的检测卡，其特征在于，包括PVC板和PVC板上依次衔接的样品垫、金 标结合垫、包被膜和吸水垫组成，其特征在于:所述的金标接合垫为吸附褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物的玻璃纤维，依次在包被膜上用褪黑素偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐性检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐性质控线C线，两条线平行排列。
6.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述的包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
7.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述的兔IgG的用量为0.2~0.9 μ g/cm2
8.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述的褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物的用量为0.09~0.5 μ g/cm2 ;所述的褪黑素单克隆抗原的用量为0.03~0.1 μ g/mm。
9.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述的羊抗兔IgG的浓度为4mg/ml，所述的羊抗兔IgG的用量为0.03~0.05 μ g/mm。
10.权利要求5所述的检测卡的制备方法，其特征在于，在PVC板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫； 其中: 1)包被膜的制备方法是: 用ρΗ7.4，0.01M PBS缓冲液、10%~20%蔗糖将褪黑素抗原稀释到0.3~1.0mg/ml，喷至硝酸纤维膜上，每300mm的喷量为30ul,为T线；羊抗兔IgG稀释到0.3mg/ml~0.5mg/ml，每300mm的喷量为30ul，为C线，C、T线的间距为4.5mm，烘箱45°C中放置12~18小时； 2)金标结合垫的制备方法是: 用高纯水将1%的氯金酸稀释浓度为0.01%，放入磁力搅拌子，置于恒温磁力搅拌加热套上煮沸，剧烈沸腾后每100mL氯金酸稀释液一次性迅速加入0.7ml的柠檬酸三钠，继续煮沸，至颜色保持红色不再发生改变停止加热，冷却至室温后补充损耗的高纯水，得透亮，无杂质和漂浮物的胶体金； 取半径为15nm~40nm的胶体金颗粒,调pH值到7.0~7.4,在搅拌下按10 μ g抗体/ml胶体金加入褪黑素单克隆抗体,最后每1ml加入IOOul 10%BSA使其稳定,在12000rpm/s离心30min，弃上清液，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的0.01M pH8.5的Tris-HCl缓冲液，1%。~5% PVP-40, 5%BSA, 0.1%。~0.5%。NaN3 重悬； 将褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物用0.01MpH8.0的Tris-HCl 缓冲液，1%?~5%。PVP-40, 5%BSA, 1%?~5%。TritonX-100,0.1%?~0.5%。NaN3 稀释至3%~10%，取玻璃纤维，每张涂布20ml~30ml，置烘箱，在37°C保温18~24小时；或者把褪黑素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物每IOOul用0.01M pH8.0的PBS、5%BSA，0.1%。~0.5%。NaN3稀释至150~300ul，再加20%蔗糖，溶解混匀，用喷金设备喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上； . 3)制样品垫 取玻璃纤维，每张涂布20ml~30ml涂布溶液为0.01MpH7.4的PBS，1%BSA,.l%TWEEN-20,0.1%。~0.5%。NaN3，置烘箱在 37°C烘干 18 ~24 小时。
【文档编号】G01N33/558GK103969454SQ201310698818
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】石松, 王铁杰, 王懿, 殷果, 王炳志, 黄凡, 韩东歧, 郭建琼, 王莹莹, 张炎钦 申请人:深圳市药品检验所, 广州达元食品安全技术有限公司