莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法
【专利摘要】本发明属于分析【技术领域】，具体涉及莲子生物碱的快速测定方法，步骤包括：样品处理、标准品处理，电喷雾萃取电离质谱EESI-MS检测，绘制标准曲线，计算样品中生物碱浓度。本发明方法快速、准确、且无需复杂的样品预处理，不仅可用于复杂基体样品中生物碱的快速鉴定，结合化学计量学还可对不同陈化度的莲子样品进行有效区分。
【专利说明】莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析【技术领域】，具体涉及莲子活性物质检测。
技术背景
[0002]签{Nelumbo nucifera Gaertn.)为睡莲科多年生水生草本植物，广泛分布于热带和亚热带地区。莲子是莲的种子，含有丰富的多糖、磷脂、生物碱和类黄酮等营养保健成分，是一种老少皆宜的食疗佳品及著名的药食同源食物。
[0003]生物碱为莲的主要生物活性成分，在莲各部位均可检测到。传统的生物碱鉴定方法是根据化学降解法来鉴定生物碱的化学结构，近年来已应用光谱分析、质谱分析和核磁分析等现代分析手段来鉴定生物碱的结构。近年来，对莲心生物碱等方面的研究取得了较大的成就，且已有制剂用于临床。然而，基于直接质谱分析，对莲生物碱进行快速分析及鉴定目前未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种快速检测莲子中生物碱的方法，本方法分析速度快，信息提取准确，识别精度高，对莲子样品质谱数据具有较好的识别效果，为生物碱的直接快速分析提供了有效参考。
[0005]具体方案如下:
莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法，其特征在于包括如下步骤:
(1)样品处理:取莲子，粉碎，过80目筛，称取莲子粉末各0.018，加入1.5mL离心管中，加入ImL 80%乙醇溶液，超声提取10 min, 4000 r/min离心5min，将提取上清液作为样品待测；
(2)标准品的制备:分别称取5mg干燥至恒重的莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、0-去甲基荷叶碱对照品，用80 %甲醇溶解，分别配制成浓度为1.00 mg/mL对照品储备溶液。将各对照品储备溶液混合成混标上样，浓度分别为0.03，0.06，0.12，0.24，0.48，
1.00mg/mL,现配现用；
(3)对混合标准品和待测样品分别进样检测；
(4)电喷雾萃取电离质谱EES1-MS检测时=LTQ-MS工作在正离子检测模式，质谱扫描范围均为取A 50^1000 ;电离电压为3.0 kV ;毛细管温度均为250 V ；ESI溶剂均为甲醇；雾化气为氮气(纯度99.999%)，压力为1.2MPa ；EESI溶剂无水甲醇和样品溶液流速分别为3iiL/min和5 ii L/min ;两个毛细管喷雾口距离a=l mm,夹角为60° ,到质谱进样口的距离为5 mm,角度为150° ,在进行串联质谱分析时,母离子的隔离窗口宽度选为1.5 Da,碰撞时间为30 ms，碰撞能量为17%~25%，其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化；
在测定时，质谱和离子源的条件为:离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250 V’样品进样速率为5 uL/min，其他参数设置为默认值；
(5)选择离子流取A611、625、282、314、296分别对应莲心碱、甲基莲心碱、0-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱，与总离子流图的走势一致，离子的丰度随着进样的出现而明显增强，说明样品中存在该质量分数的生物碱；
(6)根据标准品生物碱浓度为横坐标，信号强度为纵坐标绘制标准曲线，根据样品中信号强度计算出样品中相应生物碱的浓度。
[0006]本发明有益效果为:
快速、准确、且无需复杂的样品预处理，不仅可用于复杂基体样品中生物碱的快速鉴定，结合化学计量学还可对不同陈化度的莲子样品进行有效区分。
[0007]本方法对莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、0-去甲基荷叶碱的检出限分别为:3.5 X 10 —7，1.2 X 10 —6，1.6 X 10 —7，6.3 X 10 —7，5.6 X 10 —7mg/mL。
【专利附图】
【附图说明】[0008]图1 EESI源装置示意图；
图2电离电压对取A 625信号强度的影响；
图3离子管温度对ffi/z 625信号强度的影响；
图4样品进样速率对m/z 625信号强度的影响；
图5总离子流图和选择离子流Ob/z 611、625、282、314和296)图；
图6莲子醇提物中5种生物碱的的二级质谱图:(A)莲心碱611; (B)甲基莲心碱625 ； (C) 0-去甲基莲心碱取/z 282 ； (D)莲心季铵碱取/z 314 ； (E)荷叶碱^/z296 ；
图1不同贮藏时间莲子醇提取液中5种生物碱的信号强度变化；
图8不同贮藏时间莲子醇提液EES1-MS谱图的PCA 3D图。
【具体实施方式】
[0009]本发明所述的实例使用的质谱仪为美国Finnigan公司的LTQ-XL型线性离子讲质谱仪，数据处理系统为美国Finnigan公司的Xcalibur数据处理系统。
[0010]中性解吸装置和EESI离子源，由江西省质谱科学与仪器重点实验室自行研制；精密电子天平(MEITLER TOLEDO)o 甲醇(色谱纯，SK CHEMICALS)；
莲子品种为太空莲3号，由江西省广昌县白莲科学研究科所提供。
[0011]实施例1 I实验部分
1.1莲子醇溶液的制备:
2012年9月上旬，分别将每个年份收获的莲子(2012，2011，2010，2009 )进行粉碎，过80目筛，分别称取莲子粉末各0.01g，加入1.5 mL离心管中，加入ImL 80%乙醇溶液，超声提取10 min,4000 r/min离心5min，将提取上清液作为样品直接进行质谱检测，每种样品平行测试6次。
[0012]1.2 EES1-MS 实验参数:
LTQ-MS工作在正离子检测模式，质谱扫描范围均为取/z 5(Tl000 ;电离电压为3.0 kV ；毛细管温度均为250 °C;ESI溶剂均为甲醇；雾化气为氮气(纯度99.999%)，压力为1.2MPa;EESI溶剂和样品溶液流速分别为3 iiL/min和5 y L/min ;两个毛细管喷雾口距离a=lmm，夹角为60° ,到质谱进样口的距离为5 mm,角度为150° ,在进行串联质谱分析时，母离子的隔离窗口宽度选为1.5 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为17%?25%，其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化。(具体原理见图1)。
[0013]1.3主成分分析:
利用Matlab软件(7.0版，美国Mathworks公司)对2012，2011，2010，2009年样本(每年各60个样本，共240个)进行PCA分析，通过计算特征值、特征向量及累计贡献率，获得少数几个主成分，使它们尽可能完整地保留原始变量的信息，且彼此间不相关，以达到简化数据的目的。
[0014]2结果与讨论
2.1 EES1-MS质谱条件优化:
莲子生物碱具有较为相似的性质，本实验选择甲基莲心碱625作为目标信号物质，对电离电压、离子传输管和样品进样速率等EES1-MS质谱条件进行优化。
[0015]2.1.1离子源电压的优化:
离子源电压是直接影响分析物电离的重要参数。在本实验所用离子源中，带电的喷雾溶剂与样品溶剂喷雾在离子传输管空间内碰撞，样品中的目标分子被带电喷雾溶剂萃取，进行电荷传递，样品的目标分子形成带电离子在检测器中被检测，因此离子源电压对样品中的目标分子电离的效率有直接影响，对质谱信号的强弱起关键作用。本实验考察了不同离子源电压对625信号强度的影响，结果如图2所不，电压为3.5 kV时625信号强度较高；电压低于3.5 kV时，因为带电初级离子数目较少，难以使生物碱电离；而电压大于3.5 kV时625信号有所下降,原因可能是喷雾电压加大了对其他杂质的电离,使目标分析物625的信号受到干扰，因此本实验选择3.5 kV的作为离子源电压。
[0016]2.1.2离子传输管温度的优化:
离子传输管温度是质谱仪正常工作的一个重要参数。优化实验结果表明(图3)，当离子传输管温度小于250625信号强度随着温度的上升而增加,说明在250 °C以下，温度升高不仅可去除小液滴中的溶剂，还有利于样品中目标分子加快运动速率，获得更多的电离电荷，因而信号强度升高；在大于250 °C时，625信号强度下降，可能是因为温度升高导致生物碱变性，或者是因为反应环境的温度较高，生物碱在溶剂喷雾碰撞过程中挥发并扩散到外界环境中，造成目标信号的下降。故实验采用的离子传输管温度为250O。
[0017]2.1.3样品进样速率的优化:
本实验样品在高压气流(N2)作用下形成喷雾，在一定的喷雾压力以及电离电压下，样品进样速率直接决定进样量，是影响目标质谱信号高低的重要因素。本实验考察了在电喷雾喷雾溶剂流速一定的条件下(5 μ L/min)，样品进样速率对目标信号的影响(图4)。结果表明，样品的最佳速率为5 μ L/min ;速率较低时，目标信号物质进入质谱口的量相应减少，使信号强度降低；而进样速率大于5 μ L/min时，可能是因为氮气压力一定的情况下，样品溶液不易雾化而影响电离效果，625信号强度出现了一定的下降。因此样品进样速率为 5 μ L/min。
[0018]经过优化，确定本实验质谱和离子源的条件为:离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250 °C，样品进样速率为5 μ L/min。其他参数设置为默认值。[0019]2.2莲子醇提物EES1-MS离子流图:
在优化的实验条件下获得莲子醇提物的EES1-MS谱图(图5)，TIC为总离子色谱图，(6/z 611、625、282、314、296是总离子流中的选择离子。由图5可知，选择的离子流与总离子流图的走势一致，离子的丰度随着进样的出现而明显增强，说明样品中存在该质量分数的物质。通过文献比对，选择的5种离子流的质荷比分别与质子化的莲心碱(异莲心碱)、甲基莲心碱、0-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱质荷比相同，为了确认该系列的离子是否为莲子生物碱，进一步通过串联质谱分析进行验证。
[0020]2.3莲子醇提液的EES1-MS串联质谱分析:
利用串联质谱技术可对莲子生物碱结构进一步确认。选择611进行碰撞诱导解离(CID)实验，获得二级质谱图(图6 A)，其中的取A 593、579、503、489等离子峰是母体离子分别丢失H20、CH30H、CH3-C6H5CKCH3-CH2-C6H5O基团所形成的，与文献报道的莲心碱的二级质谱碎片一致，因而可以确认?々611是质子化的莲心碱分子的信号。另外，在二级质谱上还存在有一定丰度的ffi/z 192的碎片离子峰，而192是莲心碱的同分异构体异莲心碱二级质谱的特征碎片，因此莲子醇提取液中可能含有一定量的异莲心碱，但其信号强度要小于莲心碱的特征碎片强度。因而，在莲子醇提取液?々611的物质中，莲心碱占有较大比例。不同贮藏时间莲子样品的?々611 二级质谱图十分相似，都含有图6 A所示的各种特征离子峰。
[0021]m/z 625 离子的二级质谱(图 6 B)出现了607，593，580，489，297 和 206 等离子碎片，其中取A 607，593，580，489主要由625分别丢失一个H2O, CH3OH, C2H5O,CH3-CH2-CH2-C6H5O形成，通过与文献比对，可以确认625为甲基莲心碱。分析谱图可以发现，甲基莲心碱?/t 625的碎片特征与莲心碱ffi/z 611较为相似，其原因可能是甲基莲心碱只是在莲心碱羟基位 点(-0H)替换成了甲基(-CH3),两者结构较为相似，因而离子断裂方式也较为相似。
[0022]母体离子282的二级质谱图(图6 C)表明，特征碎片离子264、250分别是母体离子丢失&0、013011基团所形成的，通过与文献比对，可以推断母体离子主要为0-去甲基荷叶喊。
[0023]母体离子314的二级质谱图(图6 D)中最主要的碎片离子峰为269(M-45)+，由母离子丢失一个H2O形成的298含量也较高；通过与文献比对，可以断定
z 314为莲心季铵碱。
[0024]母体离子取A 296的二级质谱图(图6 E)中有较强离子特征碎片为取A 265,104,相似的离子断裂方式已经在荷叶中荷叶碱的检测中得到验证，因此推断?/t 296为荷叶碱。
[0025]从鉴定出的生物碱来看，莲子中生物碱种类丰富，不仅含有莲子芯中存在的莲心碱、甲基莲心碱及莲心季铵碱，还有在荷叶中较常见的荷叶碱、0-去甲基生物碱等。丰富的生物碱组成是莲子作为药用食物的一个重要的因素。
[0026]2.4不同贮藏时间莲子生物碱组成的差异:
通过对不同贮藏时间莲子醇提取液进行EES1-MS分析发现，莲子醇提液中5种生物碱含量依次为:0_去甲基荷叶碱〈莲心碱〈甲基莲心碱〈莲心季铵碱〈荷叶碱。各种生物碱的质谱信号在不同年份样品中存在差异，表明不同陈化度莲子的生物碱含量也不同。图7分别为2009、2010、2011、2012年莲子中611、625、282、314和296 5种离子峰的信
号强度趋势图，从2.3可知，这5种离子的信号强度在一定程度上表示莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、O-去甲基荷叶碱和荷叶碱的含量。从图7可知，莲心碱和甲基莲心碱在储藏过程中信号强度变化较小，可能是由于莲心碱与甲基莲心碱分子量较大，在结构上容易形成环状的疏水区域，具有较强的抗氧化活性，在储藏过程变化较小。莲心季铵碱的信号强度随储藏时间延长而呈下降趋势，可能是由于储藏中发生了氧化水解等作用。各个年份莲子样品中荷叶碱信号强度差异较大，且呈现不规则变化。O-去甲基荷叶碱的信号强度变化很小。
[0027]2.5不同贮藏时间莲子醇提物EES1-MS谱图的PCA分析:
将2012、2011、2010和2009年4个年份的莲子共40个样本(每个年份10个样品)在正离子模式下所获得的EES1-MS指纹谱图信息，导入Matlab中进行PCA数据处理与分析，分别得到三维的PCA得分结果，获得区分不同贮藏时间莲子。主成分I (PCl)占总方差贡献率的95.1%，主成分2 (PC2)占1.86%，主成分3 (PC3)占1.06%,其累计方差贡献率是98%(图8)。其中，PCl贡献率的95.1%描述了数据集合中最大变量的方向，沿着PCl的方向，不同贮藏时间的莲子之间具有很好的区分效果。因此，不同贮藏时间莲子的醇提物中物质差异显著，能够被明显区分在PCA三维空间的不同区域。
[0028]3 总结
本文在优化条件下对莲子醇提液进行了 EES1-MS分析。研究结果表明，采用EES1-MSn可在未经样品预处理的前提下，直接对莲子醇提液进行分析。分析结果表明，通芯莲子中含有莲心碱、甲基莲心碱、O-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱等生物碱；不同贮藏时间的莲子生物碱信号强度变化趋势表明，莲心碱、甲基莲心碱含量较为稳定，而荷叶碱的含量变化较大；PCA分析不同贮藏时间莲子醇提液的EES1-MS谱图表明，莲子在贮藏过程中醇提液部分物质发生显著变化，不同年份的莲子能够被明显区分在PCA三维空间的不同的区域。本文首次采用EES1-MS1^t通芯莲子样品中的生物碱进行多级串联质谱鉴定，快速、准确、且无需复杂的样品预处理，不仅可用于复杂基体样品中生物碱的快速鉴定，结合化学计量学还可对不同陈化度的莲子样品进行有效区分。
[0029]实施例2
莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法，包括如下步骤:
(1)样品处理:取莲子，粉碎，过80目筛，称取莲子粉末各0.01g，加入1.5 mL离心管中，加入ImL 80%乙醇溶液，超声提取10 min,4000 r/min离心5min，将提取上清液作为样品待测；
(2)标准品的制备:分别称取5mg干燥至恒重的莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、O-去甲基荷叶碱对照品，用80 %甲醇溶解，分别配制成浓度为1.00 mg/mL对照品储备溶液。将各对照品储备溶液混合成混标上样，浓度分别为0.03，0.06，0.12，0.24，0.48， 1.00 mg/mL,现配现用；
(3)对标准品和待测样品分别进样检测；
(4)电喷雾萃取电离质谱EES1-MS检测时=LTQ-MS工作在正离子检测模式，质谱扫描范围均为50-1000 ;电离电压为3.0 kV ;毛细管温度均为250 V ；ESI溶剂均为甲醇；雾化气为氮气(纯度99.999%)，压力为1.2MPa ；EESI溶剂无水甲醇和样品溶液流速分别为3iiL/min和5 ii L/min ;两个毛细管喷雾口距离a=l mm,夹角为60° ,到质谱进样口的距离为5 mm,角度为150° ,在进行串联质谱分析时,母离子的隔离窗口宽度选为1.5 Da,碰撞时间为30 ms，碰撞能量为17%?25%，其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化；
在测定时，质谱和离子源的条件为:离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250 V’样品进样速率为5 uL/min，其他参数设置为默认值；
(5)选择离子流取A611、625、282、314、296分别对应莲心碱、甲基莲心碱、O-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱，与总离子流图的走势一致，离子的丰度随着进样的出现而明显增强，说明样品中存在该质量分数的生物碱；
(6)根据标准品生物碱浓度为横坐标，信号强度为纵坐标绘制标准曲线。根据样品中信号强度计算出样品中相应生物碱的浓度。本方法对莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、0-去甲基荷叶碱的检出限分别为:3.5 X 10 一7，1.2 X 10一6，1.6 X 10 —7，6.3 X
107, 5.6 X 10 7 mg/mL。
【权利要求】
1.莲子中生物碱的电喷雾萃取电离质谱快速检测方法，其特征在于包括如下步骤: (1)样品处理:取莲子，粉碎，过80目筛，称取莲子粉末各0.01g，加入1.5 mL离心管中，加入ImL 80%乙醇溶液，超声提取10 min, 4000 r/min离心5min，将提取上清液作为样品待测； (2)标准品的制备:分别称取5mg干燥至恒重的莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、荷叶碱、O-去甲基荷叶碱对照品，用80 %甲醇溶解，分别配制成浓度为1.00 mg/mL对照品储备溶液；将各对照品储备溶液混合成混标上样，浓度分别为0.03，0.06，0.12，0.24，0.48，1.00 mg/mL,现配现用； (3)对标准品和待测样品分别进样检测； (4)电喷雾萃取电离质谱EES1-MS检测时=LTQ-MS工作在正离子检测模式，质谱扫描范围均为50-1000 ;电离电压为3.0 kV ;毛细管温度均为250 V ；ESI溶剂均为甲醇；雾化气为氮气(纯度99.999%)，压力为1.2MPa ；EESI溶剂无水甲醇和样品溶液流速分别为3yL/min和5 μ L/min ;两个毛细管喷雾口距离a=l mm,夹角为60° ,到质谱进样口的距离为5 mm,角度为150° ,在进行串联质谱分析时,母离子的隔离窗口宽度选为1.5 Da,碰撞时间为30 ms，碰撞能量为17%~25%，其它参数由LTQ-MS软件系统自动优化； 在测定时，质谱和离子源的条件为:离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250 V,样品进样速率为5 μ L/m in，其他参数设置为默认值； (5)选择离子流取Λ611、625、282、314、296分别对应莲心碱、甲基莲心碱、O-去甲基莲心碱、莲心季铵碱和荷叶碱，与总离子流图的走势一致，离子的丰度随着进样的出现而明显增强，说明样品中存在该质量分数的生物碱； (6)根据标准品生物碱浓度为横坐标，信号强度为纵坐标绘制标准曲线，根据样品中信号强度计算出样品中相应生物碱的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在电喷雾萃取电离质谱EES1-MS测定时，质谱和离子源的条件为:离子源电压为3.5 kV，离子传输管温度为250 °C，样品进样速率为5μ L/min。
【文档编号】G01N27/64GK103792278SQ201410036141
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】罗丽萍, 陈焕文, 戴喜末, 方小伟 申请人:南昌大学