产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种产气荚膜梭菌α毒素双单抗夹心ELISA检测方法，该检测方法是采用原核表达的α毒素蛋白为免疫原，利用杂交瘤技术制备单克隆抗体作为检测抗体和捕获抗体，通过试验优化反应条件，以系列含量的α毒素蛋白作为标准制作标准曲线，建立了双单抗夹心ELISA方法，并对该方法各项指标进行验证。具体包括以下步骤：（1）α毒素原核表达；(2)抗α毒素单克隆抗体的制备；(3)双单抗夹心ELISA方法的建立；(4)标准曲线的建立；（5）对该双单抗夹心ELISA方法进行性能评价。该方法特异性好、灵敏度高、稳定性好，快速、简便，且能有效地定量检测A～E型产气荚膜梭菌培养上清中α毒素，为α毒素提供了高效的检测工具。
【专利说明】产气荚膜梭菌Cl毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法。
(二)发明背景
[0002]产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡等的坏死性肠炎、肠毒血症等疾病，发病急、死亡率高，是严重危害养殖业的重要疾病，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素(CPA)，因此α毒素是诊断魏氏梭菌病的重要依据，亦是判定食品安全的重要指标。
[0003]检测α毒素的经典方法包括动物试验、毒素中和试验、卵磷脂分解试验等，但操作繁琐、敏感性较低。近年随着生物技术的发展，国内外对α毒素的检测方法已有很大进展，Naylor等建立了多抗基础上的ELISA方法，Hale等建立了捕获抗体ELISA，McCourt等用双夹心ELISA检测α毒素。但是这些方法灵敏度不是特别高，且在国内可操作性欠缺，而国外可购买的检测试剂盒价格昂贵亦无法定量和大批量检测，难以在国内推广，因此为了弥补此方法在国内α毒素检测中的空白，急切需要建立快速、灵敏、特异并能定量和大批量检测的ELISA方法，本方法的建立也为产气荚膜梭菌病早期诊断、后续研究提供有效工具。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明建立了特异性好、灵敏度高、稳定性好，快速、简便，高效检测α毒素的双抗体夹心ELISA方法。该 方法检测速度快、操作简单、可定量检测和大批量检测，能大大缩短检测周期，为α毒素的早期检测和魏氏梭菌的传播预防提供有效检测工具。
[0005]为达到上述目的，本发明的技术方案为:
[0006]一种产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法，具体操作步骤是:
[0007]I产气荚膜梭菌α毒素的原核表达，得到纯化的重组α毒素蛋白；
[0008]2抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备:
[0009]选择与骨髓瘤细胞Sp2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠(4_6周龄)作为免疫动物，免疫方案:首免为纯化后的重组α毒素蛋白(步骤I中得到)与等体积弗式完全佐剂完全乳化后，IOOyg/只腹腔注射；二免、三免分别于首免后二周和五周将重组α毒素蛋白与等体积弗式不完全佐剂完全乳化后，100 μ g/只腹腔注射；三免后三周腹腔注射不加佐剂的重组α毒素蛋白50~100 μ g/只,注射后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合。
[0010]取生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG1500进行化学法融合，运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3~5次亚克隆，得到抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞株CP Π2;利用CP Π2制备单克隆抗体F12。
[0011]3抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备:
[0012]选取新西兰大白兔作为免疫动物，首免为纯化的重组α毒素蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射Img/只，首免后弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组α毒素蛋白完全乳化，间隔两周免疫一次，三免后两周用不加佐剂的纯化的重组α毒素蛋白加强免，15d后兔心脏采血获得血清，利用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体，得到多克隆抗体。
[0013]4双抗体夹心ELISA定量检测方法及标准曲线的建立
[0014](I)用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将多克隆抗体(包被抗体)稀释至3 μ g/mL。100 μ L/孔包被96孔酶标板，4°C过夜；
[0015](2)用 PBST 溶液(含 0.05%Tween-20 的 PBS 溶液:NacL8g/L、KCL0.2g/L,Na2HPO4.12Η203.58g/L、KH2PO40.27g/L，pH7.4)洗涤 3 次，加入含 5%脱脂奶粉的 PBST 溶液作为封闭液200 μ L/孔，4°C封闭过夜；
[0016](3)用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品，100 μ L/孔，同时设置阴阳性和空白对照，阳性对照为步骤I得到的纯化重组α毒素蛋白，阴性对照分别为按常规方法制备的大肠杆菌培养上清和PBS缓冲液(含NacL8g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4.12H203.58g/L、KH2PO40.27g/L)，空白对照为不加任何样品，37°C孵育Ih ；
[0017](4) 3次PBST溶液洗涤后，将杂交瘤细胞株CP f 12制备的单克隆抗体F12用PBS缓冲液稀释至0.2 μ g/mL, 100 μ L/孔，37°C反应Ih
[0018](5)用PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液1:10000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih，PBST溶液洗涤3次；
[0019](6)最后加入可溶性TMB底物显色液100 μ L/孔，室温条件避光反应15min，用2MH2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值。
[0020](7)以α毒素蛋白稀释浓度为横坐标，OD45tlnm值为纵坐标绘制曲线图；根据曲线图，选择最佳线性范围，以浓度的自然对数LN(X)为横坐标，OD45tlnm值为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中α毒素浓度。
[0021]4结果判定标准的确定
[0022]计算阴性样品平均值(X)与标准差(SD)，求得1+3SD为阳性临界值，1+2SD为阴性临界值。运用建立的DAS-ELISA测定OD45tlnm, 0D4M?>X+3SD为阳性，0D45tel〈X+2SD为阴性，X+2SD <0D4Mm<X+3SD 为可疑样品。
[0023]本发明制备得到的抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞株，命名为CP Π2，分类命名:抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞株；已于2014年I月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，保藏号:CGMCC8770。
[0024]本发明的有益效果主要体现在:
[0025](I)特异性强:与重组α毒素蛋白(步骤I中原核表达蛋白)和天然α毒素有较强的反应性，β毒素、大肠杆菌培养上清、其他无关蛋白等为抗原进行ELISA检测，表明无交叉反应。
[0026](2)灵敏度高:通过试验和标准曲线得知，线性范围5.86?375ng/mL即为该方法的有效检测范围；平均值与2倍标准差之和(OD45tol),在标准曲线中对应的浓度为4.57ng/mL，即为此方法最低检测线。[0027](3)重复性好:在线性范围内选择375、93.75、11.72ng/mL3个浓度点，在一次试验中每个浓度测10孔，计算批内变异次数；连续测10个批次，计算批间变异系数。该方法批内变异系数为2.59%?5.02%，批间变异系数为2.67%?5.86%，两者均小于10%，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度很小，表明该方法具有较好的精密度。
[0028](4)回收率测定:在10次试验中，对3个浓度点的蛋白样品测量得到的回收率在97.22%?102.85%范围内，证明该方法准确性较高。
(四)说明书附图:
[0029]图1产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法曲线图。由图得知，以α毒素蛋白稀释浓度为横坐标，OD45tlnm值为纵坐标绘制成曲线图，可知α毒素蛋白在
5.86?375ng/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
[0030]图2产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法标准曲线。浓度的自然对数LN(X)与OD45tol值呈显著线性关系，回归方程为y=0.2533x-0.2047，相关系数R2=0.9935。
(五)【具体实施方式】:
[0031]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032]实施例中所用的试剂及其来源:表达载体pET28a购自德国Novagen公司；PMD18-T购自大连宝生物公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；PCR产物回收试剂盒购自美国OMEGABio-Tek 公司；限制性内切酶 Bam HI 和 Hind III 购自 Fermentas 公司；High AffinityN1-1DA Resin购自南京金斯瑞公司；弗式完全佐剂与弗式不完全佐剂、IPTG、Tween20均购自美国Sigma公司；ant1-His Tag兔多抗、羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP均购自杭州华安生物技术有限公司；96孔酶标板购自Solarbio公司；厌氧肉肝汤、液体硫乙醇酸盐培养基购自青岛海博生物；融合剂PEG1500购自德国Roche公司；BL21 (DE3)感受态细胞购自北京全式金公司；Sp2/0骨髓瘤细胞株购自中国典型培养物保藏中心(武汉)；可溶性TMB底物显色液购自天根生化科技有限公司；其他所用化学试剂均为分析纯。
[0033]实施例1产气荚膜梭菌α毒素的原核表达
[0034]根据primmer5软件设计特异性的引物:
[0035]上游引物:5’-GCGGAATTCATGAAAAGAAAGATTTGT-3’，如 SEQ N0.1 所示；
[0036]下游引物:5’-GCGGCGAAGCTTTTATTTTATATTATAAGTT-3’，如 SEQ N0.2 所示；
[0037]选取标准菌种NCTC528增菌后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA后，利用PCR扩增产气荚膜梭菌α毒素基因片段，扩增条件:94°C 5min、94°C lmin、54°C lmin、72°C 70s，共进行32个循环，72°C延伸7min。将经DNA纯化回收试剂盒纯化的目的产物与PMD18-T连接，测序。测序正确的重组质粒与载体pET-28a分别用EcoR I和Xho I双酶切处理，连接后转入表达感受态细胞BL21中，将菌液涂布于固体LB培养基(Nacllg，蛋白胨Ig,酵母提取物0.5g，琼脂粉1.5g,用IOOmL去离子水溶解后高压灭菌)，挑取单菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中(卡那霉素终浓度为100 μ g/mL)，37°C培养3h至OD6tltol为0.4-0.6时，加入IPTG (异丙基硫代半乳糖苷，终浓度lmmol/L)诱导表达6h，菌体超声破碎后，经High Affinity N1-changed Resin纯化制备的α毒素重组蛋白；利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western-blot)验证纯化后的α毒素重组蛋白的纯度和免疫原性，用于后续动物免疫实验和检测实验。
[0038]实施例2抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备
[0039]选择与骨髓瘤细胞Sp2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠(4_6周龄)作为免疫动物，免疫方案:首免为步骤I中制备的重组α毒素蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后，IOOyg/只腹腔注射；二免、三免分别于首免后二周和五周将重组α毒素蛋白与等体积弗式不完全佐剂完全乳化后，100 μ g/只腹腔注射；三免后三周腹腔注射不加佐剂的重组α毒素蛋白50?100 μ g/只，注射后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于下步细胞融合。期间每次免疫后第7d采血通过间接ELISA检测抗体水平，以便时刻检测抗体水平，选择效价最优的小鼠用于后续试验。
[0040]取生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG1500进行化学法融合，运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3?5次亚克隆后，得到2株抗产气荚膜梭菌α毒素的杂交瘤细胞株CP fl2(已提交中国微生物菌种保藏中心保藏)、CP bl2。选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠20只，分为2组，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL/只致敏，一周后第一组注射阳性杂交瘤细胞株CP Π2，第二组注射阳性杂交瘤细胞株CP bl2，0.5-1 X IO6个/只，7-10天后分别收集2组小鼠腹水，分别得到大量单克隆抗体F12、B12，经间接ELISA方法检测腹水效价。腹水经正辛酸_硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果；蛋白质印迹法(Western-blot)用于单抗特性鉴定:验证单克隆抗体的特异性、鉴定单抗与α毒素的反应性。
[0041]实施例3抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备:
[0042]选取5只2_3Kg新西兰大白兔，首免为纯化的重组α毒素与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射Img/只，以后弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组α毒素完全乳化，间隔2周免疫一次,3免后2周用不加佐剂的纯化的重组α毒素加强免，15d后兔心脏采血获得血清。利用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体，得到抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体，通过间接ELISA法检测抗体效价，SDS-PAGE电泳检测纯度。
[0043]实施例4双抗夹心ELISA定量检测方法的建立
[0044]通过方阵滴定实验确定包被抗体及检测抗体(单克隆抗体F12、Β12)的最佳配对，以及包被抗体的最佳包被浓度和检测抗体的最佳稀释浓度，并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系:
[0045](I)配对抗体的选择及最佳浓度确定
[0046]初步选择实施例3制备的抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体作为捕获抗体，由杂交瘤细胞株CP H2、CP bl2制备的单克隆抗体F12、B12分别作为检测抗体，通过方阵实验进行最佳抗体配对的选择。将捕获抗体用抗原包被液按体积比1:100稀释加入96孔酶标板第一行，并用抗原包被液向下1:2倍比稀释至第八行，IOOuL /孔，4°C包被过夜，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。每孔加封闭液200 μ L，4°C封闭过夜，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。每孔加入重组α毒素蛋白IOOyL /孔(用PBS稀释毒素蛋白浓度至4μ g / mL)，37°C孵育lh，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。将检测抗体用PBS缓冲液按体积比1:100稀释加入96孔酶标板第一列、第二列，并用PBS缓冲液做1、3、5、7、9、11列1:2倍比稀释，2、4、6、8、10、12列同理做1:2倍比稀释，IOOyL /孔，37°C孵育lh，PBST溶液洗涤3次，每次3min，拍干。加入可溶性TMB底物显色液，避光显色15min，每孔加入50 μ L2M H2SO4终止反应，在450nm处用酶标仪测定每孔OD值。以P / N值作为选择最佳配对抗体和最佳稀释浓度的依据。
[0047]最终确定捕获抗体为抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体，最佳工作浓度为3 μ g/mL ;检测抗体为杂交瘤细胞株CP fl2制备的单克隆抗体F12，最佳工作浓度为0.2 μ g/mL。
[0048](2)最佳包被条件的确定
[0049]96孔酶标板第一、二列用0.01mol/L碳酸盐缓冲液包被捕获抗体，第三、四列用
0.05mol/L碳酸盐缓冲液包被捕获抗，第五、六列用0.lmol/L碳酸盐缓冲液包被捕获抗体，第一、二行包被时间为37°C2h，第三、四行包被时间4°C 12h，第五、六行包被时间为370C lh+4°C 12h，进行方阵滴定实验，根据P/N值确定最佳包被条件。
[0050]最终确定最佳包被条件为0.lmol/L碳酸盐缓冲液包被捕获抗体，4°C 12h条件最佳。
[0051](3)最佳封闭条件的确定
[0052]以捕获抗体最佳包被浓度包被96孔酶标板，以最佳工作浓度稀释检测抗体，分别用5%脱脂奶粉、5%胎牛血清、1%BSA作为封闭液,选取5份重组α毒素蛋白抗原,5份阴性抗原，测定其在450nm处的OD值，根据P / N值确定合适的封闭液。
[0053]最终确定的最佳封闭条件为5%脱脂奶粉。
[0054](4)检测抗体最佳作用时间的确定
[0055]最佳包被条件下，加入重组α毒素蛋白和阴性样品各10份，以检测抗体最佳工作浓度0.2 μ g/mL稀释检测抗体，置37°C分别反应30min、60min、90min、120min，进行ELISA试验，根据P/N值确定检测抗体的最佳作用时间。
[0056]最终确定检测抗体的最佳作用时间为lh。
[0057](5)利用方阵滴定实验对ELISA检测条件进行优化，最终确定如下反应体系:
[0058]①用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将作为捕获抗体的多克隆抗体稀释至2 μ g/mL。100 μ L/孔包被96孔酶标板，4°C过夜；
[0059]②用PBST 溶液(含 0.05%Tween-20 的 PBS 溶液:NacL8g/L、KCL0.2g/L,Na2HPO4.12Η203.58g/L、KH2PO40.27g/L，pH7.4)洗涤 3 次，加入含 5%脱脂奶粉的 PBST 溶液作为封闭液200 μ L/孔，4°C封闭过夜；
[0060]③用PBST溶液洗漆3次后,前5行加入待检样品,第6行加纯化重组α毒素蛋白作为阳性对照，第7行加入按常规方法制备的大肠杆菌培养上清，第8行加入PBS缓冲液(含 NacL8g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4.12H203.58g/L、KH2PO40.27g/L)，第 7 行和第 8 行作为阴性对照，100 μ L/孔；空白对照为不加任何样品，37°C孵育Ih ；
[0061]④3次PBST溶液洗涤后，将杂交瘤细胞株CP f 12制备的单克隆抗体F12用PBS缓冲液稀释至0.2 μ g/mL, 100 μ L/孔，37°C反应Ih ；
[0062]⑤用PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG, 37°C孵育Ih，PBST洗涤液洗涤3次；
[0063]⑥最后加入可溶性TMB底物显色液100 μ L/孔，室温条件避光反应15min，用2MH2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。[0064]实施例5:双抗体夹心ELISA方法标准曲线的建立
[0065]根据已建立好的双单抗夹心ELISA定量检测方法操作程序，对重组的α毒素蛋白标准品从1500ng/mL起两倍系列稀释至0.73ng/mL、阴性样品和空白孔分别进行检测，反应完毕后测定OD45tlnm值。以α毒素蛋白稀释浓度为横坐标，OD45tlnm值为纵坐标绘制曲线图；根据曲线图，选择最佳线性范围，以浓度的自然对数LN(X)为横坐标，OD45tlnm值为纵坐标绘制标准曲线。该曲线线性范围较理想，可根据标准曲线计算待测样品中α毒素浓度。
[0066]实施例6:双抗体夹心ELISA方法性能评价
[0067](I)特异性试验运用建立好的双抗体夹心ELISA方法，检测产气荚膜梭菌α毒素阳性样品30份，大肠杆菌培养上清等阴性样品20份，其他无关蛋白10份，并设置空白对照。结果显示除与重组α毒素蛋白和α毒素反应呈阳性外，其他均为阴性，表明无交叉反应。
[0068](2)灵敏度分析根据上述试验中得到的X+2SD的值，从标准曲线中找出对应浓度，
即为此方法的检测限。根据标准曲线的线性范围确定有效检测范围。
[0069](3)精密度分析在线性范围内选择375、93.75、IL 72ng/mL3个浓度点，在一次试验中每个浓度测10个孔，计算批内变异次数；连续测10个批次，计算批间变异系数。该方法批内变异系数为2.59%?5.02%，批间变异系数为2.67%?5.86%，两者均小于10%，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度很小，表明该方法具有较好的精密度。
[0070](4)回收率测定在空白检测基质中加入不同浓度(375、93.75、11.72ng/mL)重组α毒素蛋白，按标准检测程序测定，根据实测值/理论值*100%求得平均回收率。在10次试验中，对3个浓度点的蛋白样品测量得到的回收率在97.22%?102.85%范围内，证明该方法准确性较高。
[0071]实施例7:以表达的重组α毒素蛋白和提取的天然α毒素为检测材料
[0072](I)重组α毒素蛋白和提取的天然α毒素的制备
[0073]①α毒素原核表达方法制备重组α毒素蛋白
[0074]根据primmer5软件设计特异性的引物:
[0075]上游引物:5’-GCGGAATTCATGAAAAGAAAGATTTGT-3’，如 SEQ N0.1 所示；
[0076]下游引物:5’-GCGGCGAAGCTTTTATTTTATATTATAAGTT-3’，如 SEQ N0.2 所示；
[0077]选取标准菌种NCTC528增菌后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA后，利用PCR扩增产气荚膜梭菌α毒素基因片段，扩增条件:94°C 5min、94°C lmin,54°C lmin、72°C 70s，共进行32个循环，72°C延伸7min。将经DNA纯化回收试剂盒纯化的目的产物与PMD18-T连接，测序。测序正确的重组质粒与载体pET-28a分别用EcoR I和Xho I双酶切处理，连接后转入表达感受态细胞BL21中，涂布于固体LB培养基(Nacl lg，蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，琼脂粉1.5g,用IOOmL去离子水溶解后高压灭菌)，挑取单菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中(卡那霉素终浓度为100 μ g/mL)，37°C培养3h至OD6tltlnm为
0.4-0.6时，加入IPTG (异丙基硫代半乳糖苷，终浓度lmmol/L)诱导表达6h，菌体超声破碎后，经High Affinity N1-changed Resin纯化制备的α毒素重组蛋白；利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western-blot)验证纯化后的α毒素重组蛋白的纯度和免疫原性，用于后续动物免疫实验和检测实验。
[0078]②将A型产气荚膜梭菌标准菌株(NCTC756)接种血平板培养基厌氧培养36_48h后，接入液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)增菌培养后，接种厌氧肉肝汤40°C厌氧震荡培养6h ；
[0079]③8000r, 15min离心取上清；
[0080]④上清经饱和硫酸铵法纯化，得到天然α毒素；大肠杆菌(ATCC11775)培养上清及未接种厌氧肉肝汤均作为阴性对照
[0081]2、双抗体夹心ELISA方法检测
[0082]①用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，ρΗ9.6)通过方阵试验确定作为捕获抗体的多克隆抗体稀释至3 μ g/mL, 100 μ L/孔包被96孔酶标板，4°C过夜。
[0083]②用PBST溶液(0.05%Tween20,pH7.4PBST)洗涤3次，加入封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST溶液)200 μ L/孔，4°C封闭过夜；
[0084]③用PBST溶液洗涤3次后前3行加入上述制备好的重组α毒素蛋白，第4_6行加入制备的天然α毒素，IOOyL/孔，第7、8行分别加入阴性对照(PBS、大肠杆菌(ATCC11775)培养上清及未接种菌的厌氧肉肝汤均)和空白对照(不加样品)；37°C孵育Ih ；
[0085]④3次PBST溶液洗涤后，加入制备的作为检测抗体的单克隆抗体F12(用PBS缓冲液稀释至0.2 μ g/mL)，100 μ L/孔，37°C反应Ih ；
[0086]⑤用PBST洗涤3次，加入用PBS缓冲液按体积比1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠 IgG, 37°C孵育 Ih ；
[0087]⑥最后加入可溶性TMB底物显色液100 μ L/孔，室温条件避光反应15min，用2MH2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。
[0088]3、结果
[0089]由图1得知，本实施例标准品的浓度与可检测到吸光度呈显著的线性关系，其相关系数R2=0.9935，线性方程为y=0.2533χ-0.2047，线性范围5.86?375ng/mL，此方法最低检测线为4.57ng/mL。本实施例测得的回收率在97.22%?102.85%范围内，满足要求。结果说明本方法能有效地检测α毒素。
[0090]实施例8:以A?E型产气荚膜梭菌培养上清为检测材料
[0091]1、Α-Ε型产气荚膜梭菌培养上清的制备
[0092]①相同培养条件下，将标准菌种A型(NCTC756)、B型(NCTC8533)、C型(NCTC3180)、D型(NCTC8504)、E型(NCTC6719)接种血平板培养基厌氧培养36_48h后，接入液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)增菌培养后；
[0093]②接种厌氧肉肝汤40°C厌氧震荡培养6h ；
[0094]③8000r，15min离心取上清，大肠杆菌(ATCC11775)培养上清及未接种的厌氧肉肝汤作均为阴性对照。
[0095]2、双抗体夹心ELISA方法检测
[0096]①用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将通过方阵试验确定作为捕获抗体的多克隆抗体稀释至3 μ g/mL, 100 μ L/孔包被96孔酶标板，4°C过夜。
[0097]②用PBST溶液(含0.05%Tween20, pH7.4的PBS)洗涤96孔酶标板3次，拍干后加入封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST溶液)200 μ L/孔，4°C封闭过夜；
[0098]③用PBST溶液洗涤96孔酶标板板3次后，前5行分别加入上述制备的各型产气荚膜梭菌的培养上清，第6行加入阳性对照重组α毒素蛋白、第7、8行分别加入阴性对照(常规方法制备的大肠杆菌培养上清、未接种菌的厌氧肉肝汤、PBS缓冲液)，100 μ L/孔，以及空白对照(不加样品)，37°C鮮育Ih ；
[0099]④3次PBST溶液洗涤后，加入制备的作为检测抗体的单克隆抗体F12(用PBS缓冲液稀释至0.2 μ g/mL)，100 μ L/孔，37°C反应Ih ；
[0100]⑤用PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液按体积比1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih ;
[0101]⑥最后加入可溶性TMB底物显色液100 μ L/孔，室温条件避光反应15min，用2MH2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。
[0102]3、结果
[0103]经过样品、阳性和阴性对照的多次平行测定，得到A?E型产气荚膜梭菌培养上清中α毒素检测值均为阳性，且根据450nm处吸光值运用回归方程计算出其在标准曲线对应浓度，得到A?E型产气荚膜梭菌标准菌株产生的α毒素量的平均值和标准差分别为 103.29±4.13ng/mL、29.20±1.21ng/mL、16.15±0.97ng/mL、10.46±0.58ng/mL、7.05±0.47ng/mL，符合产气荚膜梭菌各型中均有α毒素的理论，且能有效地定量检测A?E型产气荚膜梭菌培养上清中α毒素。
[0104]结果说明本方法在制备单克隆抗体基础上建立的双抗体夹心ELISA，可用于大批量样品检测、α毒素的初步定量检测和早期结果的获得，为预防畜禽产气荚膜梭菌的传播及研究提供了更快速、有效的工具，并为疫苗质量和食品安全监测的研究奠定了坚实的基础。
【权利要求】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA定量检测方法，其特征在于包括以下步骤: 1)产气荚膜梭菌α毒素的原核表达，得到纯化的重组α毒素蛋白； 2)抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备: 选择与骨髓瘤细胞Sp2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠作为免疫动物:首免为步骤I)中得到的纯化的重组α毒素蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后，IOOyg/只腹腔注射；二免、三免分别于首免后二周和五周将重组α毒素蛋白与等体积弗式不完全佐剂完全乳化后，1OOyg/只腹腔注射；三免后三周腹腔注射不加佐剂的重组α毒素蛋白50~.100 μ g/只，注射后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合； 取生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG1500进行化学法融合，运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3~5次亚克隆，得到抗产气 荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞株CP Π2 ;利用CP Π2制备单克隆抗体F12 ； 3)抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备: 选取新西兰大白兔作为免疫动物，首免为纯化的重组α毒素蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射Img/只；，首免后将弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组α毒素蛋白完全乳化每间隔两周免疫一次，三免后两周用不加佐剂的步骤I)得到的纯化的重组α毒素加强免，15d后采集兔血清，利用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体，得到多克隆抗体； 4)双抗体夹心ELISA定量检测方法及标准曲线的建立 (1)用抗原包被液将多克隆抗体即包被抗体稀释至3μ g/mL ；100 μ L/孔包被96孔酶标板，4°C过夜；所述的抗原包被液组分为0.1M碳酸盐缓冲液，其pH9.6 ； (2)用PBST溶液洗涤3次，加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液200μ L/孔，4°C封闭过夜；所述PBST溶液组分为:含0.05%Tween-20的PBS溶液:NacL8g/L、KCL0.2g/UNa2HPO4.12Η203.58g/L、KH2PO40.27g/L, pH7.4 ； (3)用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品，100μ L/孔，同时设置阴阳性和空白对照，阳性对照为步骤I)得到的纯化的重组α毒素蛋白，阴性对照分别为按常规方法制备的大肠杆菌培养上清和PBS缓冲液，所述PBS缓冲液组分为:含NacL8g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4.12H203.58g/L、KH2PO40.27g/L ;空白对照为不加任何样品，37°C孵育 Ih ； (4)3次PBST溶液洗涤后，将杂交瘤细胞株CPΠ2制备的单克隆抗体F12用PBS缓冲液稀释至 0.2 μ g/mL, 100 μ L/ 孔，37°C 反应 Ih ； (5)用PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液1:10000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih，PBST溶液洗涤3次； (6)最后加入可溶性TMB底物显色液100μ L/孔，室温条件避光反应15min，用2Μ H2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值； (7)以α毒素蛋白稀释浓度为横坐标，OD45tol值为纵坐标绘制曲线图；根据曲线图，选择最佳线性范围，以浓度的自然对数LN(X)为横坐标，OD45tlnm值为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中α毒素浓度； 5)结果判定标准的确定计算阴性样品平均值(又)与标准差(SD)，求得X+3SD为阳性临界值，3T+2SD为阴性临界值；运用建立的DAS-ELISA测定OD4stal, 0D_> X+3SD为阳性，0D--<X+2SD为阴性，X +2SD <0D?m< X +3SD 为可疑样品。
【文档编号】G01N33/577GK103941004SQ201410036188
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年1月25日 优先权日:2014年1月25日
【发明者】王海荣, 孙佳芝, 柴同杰, 李课, 陈勇, 逄伟 申请人:山东农业大学