一种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片的制备方法。该传感纸芯片的制作方法包括以下步骤：制备农药残留分子的MIPs溶胶；制备三维石墨烯金纳米复合材料；制备g-C3N4量子点；利用电极修饰技术，将三维石墨烯金纳米复合材料和g-C3N4量子点以及MIPs溶胶修饰到传感纸芯片的电极表面。一种多样品检测农药残留物的方法包括如下步骤：将修饰好的传感纸芯片连接到电化学工作站，配合化学发光仪，对样品提取液中的农药残留物进行检测。本发明的电极特异性强；灵敏度高，可以达到ng级；完成一个检测过程仅需3-5min；成本低。电极检测农药残留物的方法，操作简单快速，反应及结果均由仪器自动完成和记录。
【专利说明】—种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片的制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及农药残留检测【技术领域】，更具体地说是一种分子印迹电致发光同时多样品检测农药残留的纸芯片的制备，本发明还涉及采用所述的电致发光传感芯片检测水果、蔬菜中的农药残留物的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着生活质量的提高，食品安全问题越来越受到大家的重视。然而随着农业技术的发展，农药越来越多的被使用到水果蔬菜的生产中。食品中的农药残留对环境和人体健康构成的潜在威害逐渐受到大家的重视，食品中农药残留以造成人体急性或慢性中毒的案例报道也屡见不鲜，引起了人们的广泛关注。
[0003]由于人们对食品中农药残留的关注度不曾衰减，各种检测农药残留的方法也都应运而生。目前对农药残留的检测方法较多，主要有化学法、色谱法、酶法、免疫法和微生物检测法等。但这些检测或筛选方法或多或少都存在一些缺点。
[0004]1.化学法检测农药残留是广泛应用于农药有机磷检测的方法，但是该方法的缺点是在临界点附近颜色变化不很明显，主要针对几种有机磷农药敏感。易受一些还原性物质的干扰；
2.色谱法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法和色谱仪一质谱联用法。气相色谱法，用于挥发性农药的检测是农药残留量检测，高效液相色谱法用于不易气化或受热易分解的农药的检测。二者都是农药残留检测的常用的方法，虽然灵敏度高，但存在样品的前处理相对复杂、检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点。色谱仪一质谱联用法法灵敏度比较高，但是仪器昂贵，操作比较复杂；
3.酶试剂法虽然成本相对较低，但是检测过程步骤较多，过程比较繁琐，不利于迅速检测；
4.免疫法虽然特异性强、灵敏度高但同样存在样品的前处理相对复杂、检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点；
5.微生物法具有成本低、省时等优点，但一般只用于筛选实验；
以上几种方法对于农药残留的检测和分析都存在一些问题和缺点而限制其在实际样品检测中的应用。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供了一种具有样品处理简单、检测速度快、成本低、灵敏度高、特异性强等特点的同时多组分检测农药残留的分子印迹电致发光传感纸芯片的制备及检测方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的:一种多样品检测农药残留的分子印迹电致发光纸芯片的制备方法，其特征包括以下步骤:
(I)制备折叠式纸芯片:先用蜡打印机在A4纸上打印如附图1的蜡图案，并将带有蜡图案的A4纸放到平板加热器或烘箱中，在60-150 °C下加热0.5-2 min,使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域；采用丝网印刷电极的方法，在处理好的A4纸的未打印蜡的亲水区域印刷碳工作电极和Ag/AgCl参比电极(如附图2)；
(2)选择能与不同的农药残留合成分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymer,简称MIPs)的功能单体；
(3)按一定摩尔比将残留农药的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂混合均匀，制成MIPs溶胶；
(4)制备3D-石墨烯-纳米金复合材料；
(5)制备g_C3N4量子点；
(6)利用层层自主装表面修饰技术，将石墨烯-纳米金复合材料和g_C3N4以及MIPs溶胶修饰在电极表面上，制作分子印迹电致发光传感器。
[0007]本发明所述的农药残留物模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂的摩尔比为:0.1?1:1:0.5?3:35?60:0.05?0.25。
[0008]本发明所述的将石墨烯-纳米金复合材料、g_C3N4和分子印迹聚合物(MIPs)修饰到印刷电极的表面包括以下步骤:
(1)将制备的纸芯片上的印刷电极用玛瑙锤子仔细地打磨2min ；
(2)制备氧化石墨烯:
将2 g石墨烯加入到2 g硝酸钠和40 mL 98%浓硫酸的冰水浴中，磁性搅拌20 min。在搅拌作用下，加入6 g高锰酸钾，并于室温环境下搅拌I h。向上述溶液中加入180 mL超纯水，于95 °C回流15 min。冷却至室温后用超纯水稀释，并加入30 mL 30%的H2O2，此时溶液变为黄褐色。将得到的溶液抽滤，并用超纯水洗涤至中性，将产品于60 °C真空烘箱中烘干；
(3)制备3D-石墨烯-纳米金复合材料:
将10 mL, 0.5 mg I71的氧化石墨烯，200 μ L, 1%, w/w氯金酸和600 μ L聚乙二醇超声混合I h，然后加热到180 V 12 h。将上述反应物冷却至室温后，用超纯水清洗，最后将得到的产物冷冻干燥后得到3D-石墨烯-纳米金复合材料，并溶于水中；
(4)制备g-C3N4:0.095 g盐酸胍和0.048 g EDTA加入到10 mL超纯水中，通过搅拌使溶液均一澄清，然后将混合液置于微波炉内5 min。然后将上述溶液通过离心除去较大颗粒的副产物，得到褐色的沉淀即为g_C3N4 ；
(5)将步骤(I)处理过的纸工作电极表面滴加经步骤(3)合成的3D-石墨烯-纳米金复合材料溶液10 μ L并晾干；
(6)将制备的g_C3N4经超声处理10-30min，得到分散的g_C3N4溶液；
(7)向步骤(5)中处理过的电极滴上经步骤(6)处理过的g_C3N4溶液并晾干；
(8)向步骤(7)中晾干的工作电极表面分别滴加制备的MIPs溶液，然后将工作电极用洗脱剂洗脱20-30 min，在室温下干燥5-10 min。
[0009]本发明还包括以下步骤:
将多样品检测分子印迹电致发光传感器放置24 h后使用。
[0010]本发明所述的洗脱剂为乙腈、甲醇-乙酸、水或乙腈-乙酸。
[0011]本发明所述的化学发光分析仪为西安瑞迈IFFM-E型流动注射化学发光分析仪。
[0012]本发明所述的功能单体为甲基丙烯酰胺(MAM)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)、邻氮基硫酚或4-乙烯基吡啶(4-VP);所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA);所述的引发剂为偶氮二异丁腈(ABIN);所述的致孔剂为氯仿、甲醇。
[0013]一种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片的制备方法，其特征包括如下步骤:按照上述任意一种方法制得的分子印迹电致发光传感纸芯片配合电致化学发光仪，对水果、蔬菜中的多个样品农药残留物进行高灵敏度、快速的检测。
[0014]本发明的有益成果
1.一种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片的制备方法，利用纸电极代替传统电极，降低了农药残留物检测的成本。
[0015]2.将三维石墨烯-纳米金复合材料的增效作用引入到电极的制备当中，使制备的分子印迹聚合物修饰的电极具有更高的灵敏度和更宽的检测限范围。
[0016]3.将表面修饰技术应用到分子印迹聚合物修饰的电极的制备当中，使得纳米增效的分子印迹电致发光传感芯片具有可控性，提高了电极的灵敏度和准确性。
[0017]4.本发明所得到的一种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片传感器，可以实现样本中农药残留的高特异性、高灵敏度、低成本、快速检测。
[0018]5.本发明所得的检测农药残留的分子印迹电致发光纸芯片传感器特异性强?’灵敏度高，可以达到ng级；检测速度快，完成一个基本检测过程仅需3-5min的时间，可以在短时间内实现大量样品的高通量筛选；试剂用量少，检测一个样品只需要几十微升试剂；成本低，检测一个样品仅需几分钱。
[0019]6.一种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片的制备方法，操作简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并有很好的重复性，便于现场检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]下面结合附图和具体实施例子对本发明做进一步的详细描述。
[0021 ] 附图1为A4纸上蜡打印疏水图案。
[0022]附图2为纸上印刷多通道电极(工作电极区域可以检测不同组分，也可以检测相同组分)。
【具体实施方式】
[0023]实施案例I (乐果的检测)
一种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片的制备方法，包括以下步骤:
(1)制备折叠式纸芯片:先用蜡打印机在A4纸上打印如附图1的蜡图案，并将带有蜡图案的的A4纸放到平板加热器或烘箱中，在60-150 °C下加热0.5-2 min,使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域；采用丝网印刷电极的方法，在处理好的A4纸的未打印蜡的亲水区域印刷碳工作电极(附图2 a)、对电极(附图2 b)和Ag/AgCl参比电极(附图2c);
(2)选择能与乐果合成MIPs的功能单体甲基丙烯酸(MAA)；
(3)将残留农药的模板分子乐果、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、致孔剂甲醇、引发剂偶氮二异丁腈(ABIN)按摩尔比为0.1:1: 5:45:0.05混合均勻，制成乐果MIPs溶胶；
(4)制备3D-石墨烯-纳米金复合材料:将10mL, 0.5 mg I/1的氧化石墨烯，200UL, 1%, w/w氯金酸和600 μ L聚乙二醇超声混合I h，然后加热到180 V 12 h。将上述反应物冷却至室温后，用超纯水清洗，最后将得到的产物冷冻干燥后得到3D-石墨烯-纳米金复合材料，并溶于水中；
(5)制备g_C3N4量子点:0.095g盐酸胍和0.048 g EDTA加入到10 mL超纯水中，通过搅拌使溶液均一澄清，然后将混合液置于微波炉内5 min。然后将上述溶液通过离心除去较大颗粒的副产物，得到褐色的沉淀即为g_C3N4量子点；
(6)将制备的纸芯片上的印刷电极用玛瑙锤子仔细地打磨2min ；
(7)将步骤(6)处理过的纸工作电极表面滴加经步骤(4)合成的3D-石墨烯-纳米金复合材料溶液10 μ L并晾干；
(8)将制备的g_C3N4经超声处理10-30min，得到分散的g_C3N4溶液；
(9)向步骤(7)中处理过的电极滴上经步骤(8)处理过的g_C3N4溶液并晾干；
(10)向步骤(9)中晾干的工作电极表面分别滴加制备的MIPs溶液，然后将工作电极用洗脱剂洗脱20-30 min，在室温下干燥5-10 min。检测乐果分子印迹电致发光传感器制备完毕；
将制得的检测乐果的分子印迹电致发光传感器配合与化学发光分析仪，对水果、蔬菜中残留的乐果进行高灵敏度、快速的检测，乐果的最低检测限为4.2 X10—12 mol/L。
[0024]实施案例2 (对硫磷的检测)
一种多样品检测农残的分子印迹电致发光纸芯片的制备方法，包括以下步骤:
(1)制备折叠式纸芯片:先用蜡打印机在A4纸上打印如附图1的蜡图案，并将带有蜡图案的的A4纸放到平板加热器或烘箱中，在60-150 °C下加热0.5-2 min,使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域；采用丝网印刷电极的方法，在处理好的A4纸的未打印蜡的亲水区域印刷碳工作电极(附图2 a)、对电极(附图2 b)和Ag/AgCl参比电极(附图2c);
(2)选择能与对硫磷合成MIPs的功能单体邻氮基硫酹；
(3)将模板分子对硫磷、功能单体邻氮基硫酚、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、致孔剂甲醇、引发剂偶氮二异丁腈(ABIN)按摩尔比为0.1:1: 2:45:0.15混合均匀，制成对硫磷MIPs溶胶；
(4)制备3D-石墨烯-纳米金复合材料:将10mL, 0.5 mg I/1的氧化石墨烯，200UL, 1%, w/w氯金酸和600 μ L聚乙二醇超声混合I h，然后加热到180 V 12 h。将上述反应物冷却至室温后，用超纯水清洗，最后将得到的产物冷冻干燥后得到3D-石墨烯-纳米金复合材料，并溶于水中；
(5)制备g-C3N4:0.095 g盐酸胍和0.048 g EDTA加入到10 mL超纯水中，通过搅拌使溶液均一澄清，然后将混合液置于微波炉内5 min。然后将上述溶液通过离心除去较大颗粒的副产物，得到褐色的沉淀即为g_C3N4 ；
(6)将制备的纸芯片上的印刷电极用玛瑙锤子仔细地打磨2min ；
(7)将步骤(6)处理过的纸电极表面滴加经步骤(4)合成的3D-石墨烯-纳米金复合材料溶液10 μ L并晾干； (8)将制备的g_C3N4经超声处理10-30min，得到分散的g_C3N4溶液；
(9)向步骤(7)中处理过的电极滴上经步骤(8)处理过的g_C3N4溶液并晾干；
(10)向步骤(9)中晾干的工作电极表面分别滴加制备的MIPs溶液，然后将工作电极用洗脱剂洗脱20-30 min,在室温下干燥5-10 min。检测对硫磷分子印迹电致发光传感器制备完毕；
将制得的检测对硫磷的分子印迹电致发光传感器配合与化学发光分析仪，对水果、蔬菜中残留的对硫磷进行高灵敏度、快速的检测，检测限为2.6X 10_12 mol/L。
【权利要求】
1.一种多样品检测农药残留的分子印迹电致发光纸芯片的制备，其特征包括以下步骤: (1.1)制备折叠式纸芯片:先用蜡打印机在A4纸上打印如附图1的蜡图案，并将带有蜡图案的的A4纸放到平板加热器或烘箱中，在60-150 °C下加热0.5-2 min,使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域；采用丝网印刷电极的方法，在处理好的A4纸的未打印蜡的亲水区域印刷碳工作电极和Ag/AgCl参比电极(如附图2)； (1.2)选择能与不同的农药残留物结合成分子印迹聚合物(molecularly imprintedpolymer,简称MIPs)的功能单体； (1.3)按一定摩尔比将残留农药的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂混合均匀制成MIPs溶胶； (1.4)制备3D-石墨烯-纳米金复合材料； (1.5)制备g_C3N4量子点； (1.6)利用层层自主装表面修饰技术，将石墨烯-纳米金复合材料和g_C3N4以及MIPs溶胶修饰在电极表面上，制作分子印迹电致发光传感器； 本发明所述的农药残留物的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂的摩尔比为:0.1?1:1:0.5?3:35?60:0.05?0.25。
2.本发明所述的将石墨烯-纳米金复合材料、g_C3N4和分子印迹聚合物(MIPs)修饰到印刷电极的表面包括以下步骤: (2.1)将制备的纸芯片上的印刷电极用玛瑙锤子仔细地打磨2 min ； (2.2)制备氧化石墨烯: 将2 g石墨烯加入到2 g硝酸钠和40 mL 98%的浓硫酸的冰水浴中，磁性搅拌20 min ；在搅拌作用下，加入6 g高锰酸钾，并于室温环境下搅拌I h，向上述溶液中加入180 mL超纯水，于95 V回流15 min ;冷却至室温后用超纯水稀释，并加入30 mL 30%的H2O2，此时溶液变为黄褐色；将得到的溶液抽滤，并用超纯水洗涤至中性，将产品于60 °C真空烘箱中烘干； (2.3)制备3D-石墨烯-纳米金复合材料: 将10 mL, 0.5 mg I71的氧化石墨烯，200 μ L, 1%, w/w氯金酸和600 μ L聚乙二醇超声混合I h，然后加热到180 V 12 h;将上述反应物冷却至室温后，用超纯水清洗，最后将得到的产物冷冻干燥后得到3D-石墨烯-纳米金复合材料，并溶于水中； (2.4)制备g-C3N4:0.095 g盐酸胍和0.048 g EDTA加入到1mL超纯水中，通过搅拌使溶液均一澄清，然后将混合液置于微波炉内5 min ;然后将上述溶液通过离心除去较大颗粒的副产物，得到褐色的沉淀即为g_C3N4 ； (2.5)将步骤(2.1)处理过的纸电极表面滴加经步骤(2.3)合成的3D-石墨烯-纳米金复合材料溶液10 μ L并晾干； (2.6)将制备的g_C3N4经超声处理10-30 min，得到分散的g_C3N4溶液； (2.7)向步骤(2.5)中处理过的电极滴上经步骤(2.6)处理过的g_C3N4溶液并晾干；(2.8)向步骤(2.7)中晾干的工作电极表面分别滴加制备的MIPs溶液，然后将工作电极用洗脱剂洗脱20-30 min，在室温下干燥5-10 min ； (2.9)将步骤2.8中制备的电致发光分子印迹传感器放置24 h后配合电化学工作站和化学发光分析仪对农药残留分子进行检测。
3.根据权利要求1-2之一所述的分子印迹电致发光传感器，其特征是:所述的3D-石墨烯-纳米金复合材料的制备步骤:将10 mL, 0.5 mg L—1的氧化石墨烯，200 μ L, 1%,w/w氯金酸和600 μ L聚乙二醇超声混合I h，然后加热到180 V 12 h ;将上述反应物冷却至室温后，用超纯水清洗，最后将得到的产物冷冻干燥后得到3D-石墨烯-纳米金复合材料，并溶于水中。
4.根据权利要求1-3之一所述的分子印迹电致发光传感器，其特征是:所述的g_C3N4量子点的制备步骤为:将0.095 g盐酸胍和0.048 g EDTA加入到10 mL超纯水中，通过搅拌使溶液均一澄清，然后将混合液置于微波炉内5 min ;然后将上述溶液通过离心除去较大颗粒的副产物，得到褐色的沉淀即为g_C3N4量子点。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分子印迹电致发光传感器，其特征是:所述的功能单体为甲基丙烯酰胺(MAM)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)、邻氮基硫酚或4-乙烯基吡啶(4-VP);所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA);所述的引发剂为偶氮二异丁腈(ABIN);所述的致孔剂为氯仿、甲醇。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分子印迹电致发光传感器，其特征是:所述的农药残留物模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂的摩尔比为:0.1?1:1:0.5?3:35?60:0.05?0.25。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分子印迹电致发光传感器，其特征是:所述的洗脱剂为乙腈、甲醇-乙酸、水或乙腈-乙酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分子印迹电致发光传感器，其特征是:所述的化学发光分析仪为西安瑞迈IFFM-E型流动注射化学发光分析仪。
【文档编号】G01N27/26GK104132934SQ201410371947
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】于京华, 吴鲁丹, 颜梅, 葛慎光, 张彦, 吴开庆, 孙国强, 李丽 申请人:济南大学