一种血中tnni3k的浓度的检测试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒及其制备方法和应用，所述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括浓度为0.01～0.3μg/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液、浓度为0.1～2μg/mL的羊抗鼠lgG(H+L)抗体水溶液、浓度为1～5mg/mL的稀土盐溶液、纳米银-纳米稀土-羊抗鼠lgG(H+L)抗体的混合液、甘油的PBS缓冲液、带有深度和直径分别为0.5mm和6mm的小圈的载体。该血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒可以用于对血中TNNI3K的浓度进行检测，能检出0.008ngTNNI3K/点，并且耗时短，耗样量少。
【专利说明】—种血中TNN13K的浓度的检测试剂盒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种血中ΤΝΝΙ3Κ的浓度的检测试剂盒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]缺血性心脏病多由包括粥样硬化病变引致的冠状动脉梗阻或狭窄所致。由于缺血性心脏病有发病突然,死亡率高的特点,发病开始后数小时到24小时，3天到一周内的时间里的早期诊断和对应治疗是决定其救命率高低的主要因素。一般来说，虽然根据心电图S-T段的缺血性抬高和CPK，心肌肌钙蛋白I，T(cTnI, cTnT)，肌红蛋白(MB)升高等指标可以确诊，但依然有很多的病例难以很快就下以诊断。
[0003]特别是测定血清肌红蛋白(MB)虽可作为急性心肌梗死(AMI)诊断的早期最灵敏的指标，但特异性差，骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病，都可导致其升高；心肌肌钙蛋白I，T(cTnI, cTnT)，有相对高的特异性，但在一些骨骼肌疾病血中同样也会增高。cTnl不但在急性心肌梗死病人血中增高,在急性肾衰血样标本也有升高。
[0004]由于心肌缺血，心肌梗死导致的不同程度的心肌细胞坏死而泄漏到血管中导致血中不同程度的TNNI3K浓度增高。目前血中TNNI3K浓度的检测主要采用酶标法测定，但该检测方法耗时较长、需要较多的血样及特殊的仪器等技术问题。
【发明内容】
[0005]本发明的之一为了解决上述的血中TNNI3K浓度的检测耗时较长、需要较多的血样及特殊的仪器等技术问题，而提供一种检测耗时短、需要血样量少，不需要特殊的仪器的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒。
[0006]本发明的目的之二在于提供上述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒的制备方法。
[0007]本发明的目的之三在于利用上述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒对血中TNNI3K的浓度进行检测的方法。
[0008]本发明的技术方案
一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括:
(1)、浓度为0.01 -0.3 μ g/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
(2)、浓度为0.1?2 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液；
(3)、浓度为I?5mg/mL的稀土盐溶液；
其中稀土为镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钦、铒、铥、镱、镥、钇、钪氧化物中的一种或一种以上的稀土混合物；
(3)、纳米银-纳米稀土 -羊抗鼠lgG(H+L)抗体的混合液
所述的纳米银-纳米稀土-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米稀土:羊抗鼠lgG(H+L)抗体为6.4?1.2:1?1.6:0.2?0.24 ; (4)、甘油的PBS缓冲液
所述的甘油的PBS缓冲液，即将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀而得，其中甘油的体积百分比浓度为30% ；
(5)、带有的小圈的载体
所述的载体为孔径< 0.25 μ m的多孔的聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯膜或乙酸纤维素膜；
所述的小圈的直径为6mm、深度为0.5mm。
[0009]上述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下:
(1)、用蒸馏水将鼠抗人TNNI3K单克隆抗体溶解，配成浓度为0.01?0.3 μ g/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
(2)、用蒸馏水将羊抗鼠lgG(H+L)抗体溶解，配成浓度为0.1?2yg/mL羊抗鼠lgG(H+L)抗体水溶液；
(3)、稀土盐溶液的配制
将稀土氧化物溶于浓硝酸水溶液或质量百分比浓度为37%的盐酸水溶液中进行反应，得到浓度为I?5mg/mL的稀土盐溶液；
其中稀土氧化物为镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钦、铒、铥、镱、镥、钇、钪氧化物中的一种或两种以上的稀土氧化物；
(4)、纳米银-纳米稀土-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液的制备
①、纳米银溶液的制备
用质量百分比浓度为1%的单宁酸溶液与质量百分比浓度为0.04%硝酸银水溶液按体积比计算，即1%单宁酸溶液:0.04%硝酸银溶液为16.5mL:50mL的比例混合进行反应30min，所得的反应液用浓度为0.05?0.lmol/L的碳酸钾水溶液调节pH值为6.5?8.0，即得纳米银溶液；
②、纳米稀土溶液的制备
用质量百分比浓度为I %的单宁酸溶液与浓度为I?5mg/mL的稀土硝酸盐溶液或浓度为I?5mg/mL的稀土氯酸盐水溶液按体积比计算，即I %单宁酸溶液:I?5mg/mL的稀土硝酸盐溶液或I?5mg/mL的稀土氯酸盐水溶液为1mL:1?0.2mL的比例进行还原反应30min，所得的反应液用浓度为0.05?0.lmol/L的碳酸钾水溶液调节pH值为6.5?8.0，即得纳米稀土溶液；
③、将步骤①所得的纳米银溶液与步骤②所得的纳米稀土溶液按体积比的比例混合，得到纳米银和纳米稀土的混合溶液；
④、在步骤③所得的纳米银和纳米稀土的混合溶液中加入步骤(2)所得的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液，得到纳米银-纳米稀土 -羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液；
纳米银-纳米稀土-羊抗鼠lgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米稀土:羊抗鼠IgG(H+L)抗体为6.4?1.2:1?1.6:0.2?0.24 ;
(5)、甘油的PBS缓冲液的制备
将甘油加入到PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀即得甘油的PBS缓冲液，其中甘油的体积百分比浓度为30% ；
(6)、带有的小圈的载体的制备； 用打孔器在载体上压印出小圈；
所述的载体为孔径< 0.25 μ m的多孔的聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯膜或乙酸纤维素膜；
所述的小圈的直径为6mm、深度为0.5mm。
[0010]利用上述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒对血中TNNI3K的浓度进行检测的方法，具体步骤如下:
(1)、将甘油的PBS缓冲液从载体的正面滴加到载体的小圈中；
(2)、待步骤(I)的甘油的PBS缓冲液渗入到载体后，再将鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液从载体的正面滴加到载体的小圈中；
待鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液渗入到载体后，将阻断剂从载体的正面加入到载体的小圈中；
待阻断剂渗入到载体后，将载体依次用洗液、蒸馏水洗涤3次；
所述的阻断剂为质量百分比浓度为0.2-1%的牛血清白蛋白、明胶或牛奶的水溶液；所述的洗液为PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的质量百分比浓度为0.5%，NaCl的质量百分比浓度为10% ；
(3)、在两边有开口的塑料支撑体的上面放上吸水材料，然后再将步骤(2)洗涤后的载体的正面朝上，放在吸水材料上；
所述的吸水材料为滤纸、脱脂棉、海绵、吸水纤维中的一种或两种以上的混合物；
(4)、用蒸馏水将待测的血样稀释60倍，将稀释后的血样从步骤(3)所得的载体的正面缓慢滴加于到载体的小圈中；
待血样渗入到载体后，将与稀释后的血样等体积的纳米银-纳米稀土 -羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液从载体的正面缓慢加入到载体的小圈中；
待纳米银-纳米稀土 -羊抗鼠IgG (H+L)抗体的混合液渗入到载体后，将载体依次用洗液、蒸馏水洗涤3次，然后将为稀释后的血样5倍体积的银染剂从载体的正面迅速加入到载体的小圈中，避光反应lmin，然后用蒸馏水洗去银染剂；
所述的银染剂为含有硝酸银和对苯二酚的水溶液，其中硝酸银的浓度为0.015mol/L和对苯二酚的浓度为0.075mol/L ；
根据载体的小圈中出现均匀一致的灰黑色斑点颜色的深度，用比色法可得出血中TNNI3K的浓度。
[0011]本发明的有益效果
本发明的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，由于采用了对鼠抗人TNNI3K单克隆抗体吸附能力强的载体、银标银染技术、用动态吸附取代静态吸附，研究发现纳米稀土可大幅度提高银标银染方法的灵敏度，从而解决了目前采用酶标法测定血中TNNI3K浓度的检测方法耗时较长、需要较多的血样及特殊的仪器等技术问题。
[0012]利用本发明的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒对血液中的TNNI3K进行检测，其耗时较短，从固定鼠抗人TNNI3K单克隆抗体开始，到出结果仅需三分钟；需用的血样较少，仅需0.033 μ L ;不需要检测的仪器；能检出0.008ngTNNI3K/点。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图la、带有的小圈的载体的结构示意图，其中I为载体，2为载体上的小圈；
图lb、带有的小圈的载体的A-A向的示意图；
图2、载体I的正面示意图；
图3、塑料支撑体4、吸水材料3和载体I的放置关系示意图，自下而上依次为塑料支撑体4、吸水材料3和载体I ;
图4、两边有开口的塑料支撑体的结构示意图。
【具体实施方式】
[0014]下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
[0015]实施例1
一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括:
(1)、浓度为0.01 μ g/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
(2)、浓度为0.1 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液；
(3)、钕浓度为lmg/mL的硝酸钕溶液；
(4)、纳米银-纳米钕-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液
所述的纳米银-纳米钕-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米钕:羊抗鼠lgG(H+L)抗体为6.4:1:0.2 ；
(4)、甘油的PBS缓冲液
所述的甘油的PBS缓冲液，即将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀而得，其中甘油的体积百分比浓度为30% ；
(5)、带有的小圈的载体
所述的带有的小圈的载体的结构示意图如图1a所示，其中I为载体，2为载体上的小圈；其A-A向的示意图如图1b所示；
所述的载体I为孔径为0.25 μ m的多孔聚偏氟乙烯膜；
所述的小圈2的深度和直径分别为0.5mm和6mm。
[0016]上述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下:
(1)、用蒸馏水将鼠抗人TNNI3K单克隆抗体溶解，配成浓度为0.01 μ g/mL鼠抗人 TNNI3K单克隆抗体水溶液，步骤如下:
将Img的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体于50mL小烧杯中，加蒸馏水使其溶解，移至10mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
取25 μ L的浓度为10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体溶液于25mL容量瓶中，用蒸馏水定容至25ml，得浓度为0.01 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体溶液；
(2)、用蒸馏水将羊抗鼠IgG(H+L)抗体溶解，配成浓度为0.1 μ g/mL羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液，步骤如下:
将Img的羊抗鼠IgG (H+L)抗体于50mL小烧杯中，加蒸懼水使其溶解,移至10mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为10 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液；
取1.0OmL的浓度为10 μ g/mL羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为0.1 μ g/mL的羊抗鼠IgG (H+L)抗体水溶液； (3)、将0.2333g氧化钕溶于3mL浓硝酸中，加热,使其溶解,用蒸馏水定容至100ml，即得到钕浓度为lmg/mL的硝酸钕溶液；
(4)、纳米银-纳米钕-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液的制备
①、纳米银溶液的制备
用16.5mL的质量百分比浓度为I %的单宁酸溶液与50ml的质量百分比浓度为0.04%硝酸银水溶液进行混合后，搅拌条件下进行反应30min，所得的反应液用浓度为0.05mol/L的碳酸钾水溶液调节PH值为6.5，然后用蒸馏水定容至100ml，即得纳米银溶液；
②、纳米钕溶液的制备
用1ml质量百分比浓度为I %的单宁酸溶液与1.0ml钕浓度为lmg/mL的硝酸钕溶液混合后进行还原反应30min，所得的反应液用浓度为0.05mol/L的碳酸钾水溶液调节pH值为6.5，用蒸馏水定容至50ml，即得纳米钕溶液；
③、将步骤①所得的62.5 μ L纳米银溶液与步骤②所得的62.5 μ L纳米钕溶液按纳米银:纳米稀土钕的质量比为6.4:1的比例进行混合，得到纳米银和纳米钕的混合溶液；
④、在步骤③所得的纳米银和纳米钕的混合溶液中加入2.5mL步骤(2)所得的浓度为0.1 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液，然后用浓度为0.01mol/L的磷酸氢二钠水溶液定容至25ml，得到纳米银-纳米钕-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液；
纳米银-纳米钕-羊抗鼠lgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米稀土钕:羊抗鼠lgG(H+L)抗体为6.4:1:0.2 ；
(5)、甘油的PBS缓冲液的制备
将甘油加入到PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀即得甘油的PBS缓冲液，其中甘油的体积百分比浓度为30% ；
(6)、带有的小圈2的载体I的制备
用打孔器在载体I上压印出小圈2 ;
其中载体I为孔径为0.25 μ m的多孔聚偏氟乙烯膜；
所述的小圈2,其深度和直径分别为0.5mm和6_。
[0017]利用上述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒对血中TNNI3K的浓度进行检测的方法，具体步骤如下:
(1)、将10μ L甘油的PBS缓冲液从载体I的正面滴加到载体I的小圈2中；
(2)、待步骤(I)的甘油的PBS缓冲液渗入到载体I后，再将2μ L浓度为0.01 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液从载体I的正面滴加到载体I的小圈2中，所述的载体I的正面见图2所示；
待浓度为0.01 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液渗入到载体I后，将2 μ L阻断剂从载体I的正面加入到载体I的小圈2中；
待阻断剂渗入到载体I后，将载体I依次用洗液、蒸馏水洗涤3次；
所述的阻断剂为质量百分比浓度为0.2%的牛血清白蛋白的水溶液；
所述的洗液为PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的质量百分比浓度为0.5%，NaCl的质量百分比浓度为10% ；
(3)、在两边有开口的塑料支撑体4的上面放上吸水材料3，然后再将步骤(2)洗涤后的载体I的正面朝上，放在吸水材料3上，具体的放置示意图如图3所示，即自下而上依次为塑料支撑体4、吸水材料3和载体I ;
所述的两边有开口的塑料支撑体4的结构示意图如图4所示；
所述的吸水材料3为滤纸；
(4)、用蒸馏水将待测的血样稀释60倍，将2 μ L稀释后的血样从步骤(3)所得的载体I的正面缓慢滴加到载体I的小圈2中；
待血样渗入到载体I后，将2 μ L纳米银-纳米钕-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液从载体I的正面缓慢加入到载体I的小圈2中；
待纳米银-纳米钕-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液渗入到载体I后，将载体I依次用洗液、蒸馏水洗涤3次，然后将10 μ L银染剂从载体I的正面迅速加入到载体I的小圈2中，避光反应lmin，然后用100 μ L蒸馏水洗去银染剂；
所述的洗液为PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的质量百分比浓度为0.5%，NaCl的质量百分比浓度为10% ；
所述的银染剂为含有硝酸银和对苯二酚的水溶液，其中硝酸银的浓度为0.015mol/L和对苯二酚的浓度为0.075mol/L ；
根据载体I的小圈2中出现均匀一致的灰黑色斑点颜色的深度，用比色法得出每点TNNI3K 的量为 0.085ngTNNI3K/ 点，血中 TNNI3K 的浓度 2550ng/mL。
[0018]实施例2
一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括:
(1)、浓度为0.3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
(2)、浓度为2μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液；
(3)、钇浓度为5mg/mL的氯化钇溶液；
(4)、纳米银-纳米钇-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液
所述的纳米银-纳米钇-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米钇:羊抗鼠IgG(H+L)抗体为1.2:1.6:0.24；
(5)、甘油的PBS缓冲液
所述的甘油的PBS缓冲液，即将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀而得，其中甘油的体积百分比浓度为30% ；
(6)、带有的小圈的载体
所述的载体为孔径为0.22 μ m的多孔的硝酸纤维素膜；
所述的小圈，其深度和直径分别为0.5mm和6_。
[0019]上述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下:
(1)、用蒸馏水将鼠抗人TNNI3K单克隆抗体溶解，配成浓度为0.Syg/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液，步骤如下:
将Img的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体于50mL小烧杯中，加蒸馏水使其溶解，移至10mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
取0.75mL浓度为10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液于25mL容量瓶中，用蒸馏水定容至25ml，得浓度为0.3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
(2)、用蒸馏水将羊抗鼠IgG(H+L)抗体溶解，配成浓度为2μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液，步骤如下:
将Img的羊抗鼠IgG(H+L)抗体于50mL小烧杯中，加蒸懼水使其溶解,移至50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至50ml，得浓度为20 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液；
取10.0OmL浓度为20 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为2 μ g/mL的羊抗鼠IgG (H+L)抗体水溶液；
(3)、将0.6350g氧化钇与3mL的质量百分比浓度为37%的盐酸水溶液混合，加热使其溶解，然后用蒸馏水定容至10mL,得到钇浓度为5mg/mL的氯化钇溶液；
(4)、纳米银-纳米钇-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液的制备
①、纳米银溶液的制备
用16.5mL的质量百分比浓度为I %的单宁酸溶液与50ml的质量百分比浓度为0.04%硝酸银水溶液进行混合后，搅拌条件下进行反应30min，所得的反应液用浓度为0.05mol/L的碳酸钾水溶液调节PH值为8.0，然后用蒸馏水定容至100ml，即得纳米银溶液；
②、纳米钇溶液的制备
用1ml质量百分比浓度为I %的单宁酸溶液与0.20ml钇浓度为5mg/mL的氯化钇溶液混合后进行还原反应30min，所得的反应液用浓度为0.05mol/L的碳酸钾水溶液调节pH值为8，用蒸馏水定容至50ml，即得纳米钇溶液；
③、将步骤①所得的11，SyL纳米银溶液与步骤②所得的100μ L纳米钇溶液按纳米银:纳米钇的质量比为1.2:1.6的比例进行混合，得到纳米银和纳米钇的混合溶液；
④、在步骤③所得的纳米银和纳米钇的混合溶液中加入0.15mL步骤(2)所得的浓度为2 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液，然后用浓度为0.01mol/L的磷酸氢二钠水溶液定容至25ml，得到纳米银-纳米钇-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液；
纳米银-纳米钇-羊抗鼠lgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米钇:羊抗鼠 IgG(H+L)抗体为 1.2:1.6:0.24 ；
(5)、甘油的PBS缓冲液的制备
将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀即得甘油的PBS缓冲液，其中甘油的体积百分比浓度为30% ；
(6)、带有的小圈的载体的制备
用打孔器在载体上压印出小圈；
所述的载体为孔径为0.22 μ m的多孔的硝酸纤维素膜；
所述的小圈，其深度和直径分别为0.5mm和6_。
[0020]利用上述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒对血中TNNI3K的浓度进行检测的方法，具体步骤如下:
(1)、将10μ L甘油的PBS缓冲液从正面滴加于载体的小圈中；
(2)、待步骤(I)的甘油的PBS缓冲液渗入到载体后，再将2μ L浓度为0.3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体溶液从载体的正面滴加到载体的小圈中；
待浓度为0.3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液渗入到载体后，将2 μ L阻断剂从载体的正面加入到载体的小圈中；
待阻断剂渗入到载体后，将载体依次用洗液、蒸馏水洗涤3次；
所述的阻断剂为质量百分比浓度为1%的牛奶的水溶液； 所述的洗液为PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的质量百分比浓度为0.5%，NaCl的质量百分比浓度为10% ；
(3)、在两边有开口的塑料支撑体的上面放上吸水材料，然后再将步骤(2)洗涤后的载体的正面朝上，放在吸水材料上；
所述的吸水材料为脱脂棉；
(4)、用蒸馏水将待测的血样稀释60倍，将2μ L稀释后的血样缓慢滴加于步骤(3)小圈中，待血样渗入到载体后缓慢加纳米银-纳米钇-羊抗鼠IgG (H+L)抗体的混合液，待纳米银-纳米钇-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液渗入到载体后依次用洗液、蒸馏水洗涤3次，然后迅速加入10 μ L银染剂，避光反应lmin，然后用100 μ L蒸馏水洗去银染剂；
所述的洗液为PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的质量百分比浓度为0.5%，NaCl的质量百分比浓度为10% ；
所述的银染剂为含有硝酸银和对苯二酚的水溶液，其中硝酸银的浓度为0.015mol/L和对苯二酚的浓度为0.075mol/L ；
根据小圈中出现均匀一致的灰黑色斑点颜色的深度，用比色法得出每点TNNI3K的量为 0.008ngTNNI3K/ 点，血中 TNNI3K 的浓度 240ng/mL。
[0021]实施例3
一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括:
(1)、浓度为0.15 μ g/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
(2)、浓度为Iμ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液；
(3)、钐浓度为2.5mg/mL的硝酸钐溶液和铒浓度为2mg/mL的硝酸铒溶液；
(4)、纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液
所述的纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米钐和铒:羊抗鼠lgG(H+L)抗体为3.8:1.34:0.22 ；
(4)、甘油的PBS缓冲液
所述的甘油的PBS缓冲液，即将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀而得，其中甘油的体积百分比浓度为30% ；
(5)、带有的小圈的载体
所述的载体为孔径为0.20 μ m的多孔乙酸纤维素膜；
所述的小圈，其深度和直径分别为0.5mm和6_。
[0022]上述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下:
(1)、用蒸馏水将鼠抗人TNNI3K单克隆抗体溶解，配成浓度为0.15 μ g/mL鼠抗人 TNNI3K单克隆抗体水溶液，步骤如下:
将Img的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体于50mL小烧杯中，加蒸馏水使其溶解，移至10mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
取375 μ L的浓度为10 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液于25mL容量瓶中，用蒸馏水定容至25ml，得浓度为0.15 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
(2)、用蒸馏水将羊抗鼠IgG(H+L)抗体溶解，配成浓度为Iμ g/mL羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液，步骤如下: 将Img的羊抗鼠IgG (H+L)抗体于50mL小烧杯中，加蒸懼水使其溶解,移至10mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为10 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液；
取5.0OmL浓度为10 μ g/mL的羊抗鼠IgG (H+L)抗体水溶液于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至50ml，得浓度为I μ g/mLd羊抗鼠IgG (H+L)抗体水溶液；
(3 )、硝酸铒和硝酸钐溶液的配制
将0.2287g氧化铒与5mL浓硝酸混合，加热使其溶解，待其冷却后，用蒸馏水定容至10mL,即得铒浓度为2mg/mL的硝酸铒溶液；
将0.2899g氧化钐与5mL浓硝酸混合,加热使其溶解,待其冷却后，用蒸馏水定容至10mL,即得钐浓度为2.5mg/mL的硝酸钐溶液；
(4)、纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液的制备
①、纳米银溶液的制备
用16.5mL的质量百分比浓度为I %的单宁酸溶液与50.0mL的质量百分比浓度为0.04%硝酸银水溶液进行混合后，搅拌条件下进行反应30min，所得的反应液用浓度为0.05mol/L的碳酸钾水溶液调节pH值为7.5，然后用蒸馏水定容至100ml，即得纳米银溶液；
②、纳米钐和铒溶液的制备
用1mL质量百分比浓度为I %的单宁酸溶液与0.25mL铒浓度为2mg/mL的硝酸铒溶液和0.20mL钐浓度为2.5mg/mL的硝酸钐溶液进行混合后，搅拌条件下进行还原反应30min，所得的反应液用浓度为0.05mol/L的碳酸钾水溶液调节pH值为7.5，然后用蒸馏水定容至50mL,即得纳米钐和铒的溶液；
③、将步骤①所得的37.4 μ L纳米银溶液与步骤②所得的83.7 μ L纳米钐和铒的溶液按纳米银:纳米钐和铒的质量比为3.8:1.34的比例混合，得到纳米银和纳米钐和铒的混合溶液；
④、在步骤③所得的纳米银和纳米钐和铒的混合溶液中加入0.275mL步骤(2)所得的浓度为I μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液，然后用浓度为0.01mol/L的磷酸氢二钠水溶液定容至25ml，即得纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液；
纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠lgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米钐和铒:羊抗鼠lgG(H+L)抗体为3.8:1.34:0.22 ；
(5)、甘油的PBS缓冲液的制备
将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀即得甘油的PBS缓冲液，其中甘油的体积百分比浓度为30% ；
(6)、带有的小圈的载体的制备
用打孔器在载体上压印出小圈；
其中载体为孔径为0.20 μ m的多孔乙酸纤维素膜；
所述的小圈，其深度和直径分别为0.5mm和6_。
[0023]利用上述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒对血中TNNI3K的浓度进行检测的方法，具体步骤如下:
(1)、将10μ L甘油的PBS缓冲液从载体的正面滴加到载体的小圈中；
(2)、待步骤(I)的甘油的PBS缓冲液渗入到载体后，再将2μ L浓度为0.15 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液从载体的正面滴加到载体的小圈中；
待浓度为0.15 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液渗入到载体后，将2 μ L阻断剂从载体的正面加入到载体的小圈中；
待阻断剂渗入到载体后，将载体依次用洗液、蒸馏水洗涤3次；
所述的阻断剂为质量百分比浓度为0.5%的明胶的水溶液；
所述的洗液为PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的质量百分比浓度为0.5%，NaCl的质量百分比浓度为10% ；
(3)、在两边有开口的塑料支撑体的上面放上吸水材料，然后再将步骤(2)处理后的载体的正面朝上，放在吸水材料上；
所述的吸水材料为海绵；
(4)、用蒸馏水将待测的血样稀释60倍，将2μL稀释后的血样从步骤(3)所得的载体的正面缓慢滴加到载体的小圈中；
待血样渗入到载体后，将2 μ L纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠IgG (H+L)抗体的混合液从载体的正面缓慢加入到载体的小圈中；
待纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液渗入到载体后，将载体依次用洗液、蒸馏水洗涤3次，然后将10 μ L银染剂从载体的正面迅速加入到载体的小圈中，避光反应lmin，然后用100 μ L蒸馏水洗去银染剂；
所述的洗液为PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的质量百分比浓度为0.5%，NaCl的质量百分比浓度为10% ；
所述的银染剂为含有硝酸银和对苯二酚的水溶液，其中硝酸银的浓度为0.015mol/L和对苯二酚的浓度为0.075mol/L ；
根据载体的小圈中出现均匀一致的灰黑色斑点颜色的深度，用比色法得出每点TNNI3K的量为 0.065ngTNNI3K/ 点，血中 TNNI3K 的浓度 1950ng/mL。
[0024]实施例4
实施例4与实施例3的实验条件相同，只是将TNNI3K的浓度为1950ng/mL的标准溶液替代血样，做3个平行实验。即用蒸馏水览TNNI3K的浓度为1950ng/mL的标准溶液稀释60倍，用2yL稀释后的TNNI3K的溶液进行实验。根据小圈中出现均匀一致的灰黑色斑点颜色的深度用比色法得出每点TNNI3K的量分别为0.064,0.064,0.064ngTNNI3K/点，血中TNNI3K 的浓度 1920、1920、1920ng/mL，TNNI3K 的回收率分别为 98.46%,98.46% 和 98.46%。
[0025]从上述的实验结果表明，用本发明的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒对血中TNNI3K的浓度进行检测的方法是可靠和稳定的。
[0026]对照实施例1 (用酶标法测定实施例3血样中TNNI3K的浓度)
用 Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.的“Protein Detector? ELISA Kit，，进行测试，具体步骤如下:
(1)、将25mg的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体于50mL小烧杯中，加蒸馏水使其溶解，移至25mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至25ml，得浓度为lmg/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液；
(2)、用移液器取88μL浓度为lmg/mL的鼠抗人ΤΝΝΙ3Κ单克隆抗体水溶液于96孔板的一孔中，加10yL固定液，放置120min，倒去未固定的溶液，用150 μ L洗液清洗，洗3遍； (3)、加300μ L阻断剂，放置60min，倒去多余的阻断剂；
(4)、加2.5μ L血样，放置120min，用150 μ L洗液清洗，洗4遍；
(5)、加10(^1^二抗溶液，放置6011^11，用100μ L洗液清洗，洗4遍；
(5)、加100μ L酶染剂，放置30min ；
(6)、加100μL停止剂，用MTP-310Lab型酶标仪测定出该血样中TNNI3K的浓度为1947ng/mL。
[0027]通过上述对照实施例1与实施例3的检测结果进行对比，可以看出，利用本发明试剂盒进行检测，所得的检测结果与传统的酶标法进行相比，其检测结果准确，精确度高。进一步，可以看出利用本发明试剂盒进行检测，其耗时较短，从固定鼠抗人TNNI3K单克隆抗体开始，到出结果仅需三分钟，而对照实施例1中传统的酶标法，从固定鼠抗人TNNI3K单克隆抗体开始，到出结果需390分钟。并且利用本发明的试剂盒进行检测，所需的血样较少，仅需0.033 μ L，而传统的酶标法，需2.5μ L。进一步，利用本发明的试剂盒对血样进行检测，不需要特殊的检测仪器，而传统的酶标法需用酶标仪。
[0028]以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，其特征在于所述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括: (I)、浓度为0.0l?0.3 μ g/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液； (1)、浓度为0.1?2μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液； (2)、浓度为I?5mg/mL的稀土盐溶液； 其中稀土为镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钦、铒、铥、镱、镥、钇、钪氧化物中的一种或两种以上的稀土混合物； (3)、纳米银-纳米稀土-羊抗鼠lgG(H+L)抗体的混合液 所述的纳米银-纳米稀土-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米稀土:羊抗鼠lgG(H+L)抗体为6.4?1.2:1?1.6:0.2?0.24 ; (4)、甘油的PBS缓冲液 所述的甘油的PBS缓冲液，即将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀而得，其中甘油的体积百分比浓度为30% ； (5)、带有的小圈的载体 所述的载体为孔径< 0.25 μ m的多孔的聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯膜或乙酸纤维素膜； 所述的小圈的直径为6mm、深度为0.5mm。
2.如权利要求1所述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，其特征在于所述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括: (1)、浓度为0.01 μ g/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液； (2)、浓度为0.1 μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液； (3)、钕浓度为lmg/mL的硝酸钕溶液； (4)、纳米银-纳米钕-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液 所述的纳米银-纳米钕-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米钕:羊抗鼠IgG(H+L)抗体为6.4:1:0.2 ； (4)、甘油的PBS缓冲液 所述的甘油的PBS缓冲液，即将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀而得，其中甘油的体积百分比浓度为30% ； (5)、带有的小圈的载体 所述的载体为孔径为0.25 μ m的多孔聚偏氟乙烯膜； 所述的小圈的深度和直径分别为0.5mm和6mm。
3.如权利要求1所述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，其特征在于所述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括: (1)、浓度为0.3 μ g/mL的鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液； (2)、浓度为2μ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液； (3)、钇浓度为5mg/mL的氯化钇溶液； (4)、纳米银-纳米钇-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液 所述的纳米银-纳米钇-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米钇:羊抗鼠IgG(H+L)抗体为1.2:1.6:0.24 ； (5)、甘油的PBS缓冲液 所述的甘油的PBS缓冲液，即将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀而得，其中甘油的体积百分比浓度为30% ； (6)、带有的小圈的载体 所述的载体为孔径为0.22 μ m的多孔的硝酸纤维素膜； 所述的小圈，其深度和直径分别为0.5mm和6_。
4.如权利要求1所述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，其特征在于所述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒，包括: (1)、浓度为0.15 μ g/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液； (2)、浓度为Iμ g/mL的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液； (3)、钐浓度为2.5mg/mL的硝酸钐溶液和铒浓度为2mg/mL的硝酸铒溶液； (4)、纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液 所述的纳米银-纳米钐和铒-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米钐和铒:羊抗鼠IgG(H+L)抗体为3.8:1.34:0.22 ； (4)、甘油的PBS缓冲液 所述的甘油的PBS缓冲液，即将甘油加入到pH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀而得，其中甘油的体积百分比浓度为30% ； (5)、带有的小圈的载体 所述的载体为孔径为0.20 μ m的多孔乙酸纤维素膜； 所述的小圈，其深度和直径分别为0.5mm和6_。
5.如权利要求1所述的一种血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤: (1)、用蒸馏水将鼠抗人TNNI3K单克隆抗体溶解，配成浓度为0.01?0.3 μ g/mL鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液； (2)、用蒸馏水将羊抗鼠lgG(H+L)抗体溶解，配成浓度为0.1?2yg/mL羊抗鼠lgG(H+L)抗体水溶液； (3)、稀土盐溶液的配制 将稀土氧化物溶于浓硝酸或体积百分比浓度为37%的盐酸水溶液中，得到浓度为I?5mg/mL的稀土盐溶液； 其中稀土氧化物为镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钦、铒、铥、镱、镥、乾、钪氧化物中的一种或两以上的稀土氧化物； (4)、纳米银-纳米稀土-羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液的制备 ①、纳米银溶液的制备 用质量百分比浓度为1%的单宁酸溶液与质量百分比浓度为0.04%硝酸银水溶液按体积比计算，即1%单宁酸溶液:0.04%硝酸银溶液为16.5mL:50mL的比例混合，搅拌条件下进行反应30min，所得的反应液用浓度为0.05?0.lmol/L的碳酸钾水溶液调节pH值为6.5?8.0，即得纳米银溶液； ②、纳米稀土溶液的制备 用质量百分比浓度为I %的单宁酸溶液与浓度为I?5mg/mL的稀土盐溶液按体积比计算，即1%单宁酸溶液:I?5mg/mL的稀土盐溶液为1mL:1?0.2mL的比例,搅拌条件下进行还原反应30min，所得的反应液用浓度为0.05?0.lmol/L的碳酸钾水溶液调节pH值为6.5?8.0，即得纳米稀土溶液； ③、将步骤①所得的纳米银溶液与步骤②所得的纳米稀土溶液按体积比混合，得到纳米银和纳米稀土的混合溶液； ④、在步骤③所得的纳米银和纳米稀土的混合溶液中加入步骤(2)所得的羊抗鼠IgG(H+L)抗体水溶液，得到纳米银-纳米稀土 -羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液； 纳米银-纳米稀土-羊抗鼠lgG(H+L)抗体的混合液中，按质量比计算，即纳米银:纳米稀土:羊抗鼠IgG(H+L)抗体为6.4?1.2:1?1.6:0.2?0.24 ; (5)、甘油的PBS缓冲液的制备 将甘油加入到PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中混合均匀即得甘油的PBS缓冲液，其中甘油的体积百分比浓度为30% ； (6)、带有的小圈的载体的制备 用打孔器在载体上压印出小圈； 所述的载体为孔径< 0.25 μ m的多孔的聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯膜或乙酸纤维素膜； 所述的小圈的直径为6mm、深度为0.5mm。
6.如权利要求1-4所述的血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒用于对血中TNNI3K的浓度进行检测。
7.如权利要求6所述的利用血中TNNI3K的浓度的检测试剂盒对血中TNNI3K的浓度进行检测的方法，其特征在于具体包括如下步骤: (1)、将甘油的PBS缓冲液从载体的正面滴加到载体的小圈中； (2)、待步骤(I)的甘油的PBS缓冲液渗入到载体后，再将鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液从载体的正面滴加到载体的小圈中； 待鼠抗人TNNI3K单克隆抗体水溶液渗入到载体后，将阻断剂从载体的正面加入到载体的小圈中； 待阻断剂渗入到载体后，将载体依次用洗液、蒸馏水洗涤3次； 所述的阻断剂为质量百分比浓度为0.2-1%的牛血清白蛋白、明胶或牛奶的水溶液中的一种； 所述的洗液为PH值为7.4磷酸氢二钠水溶液中加入TWeen80、NaCl而得到的溶液，其中TWeen80的质量百分比浓度为0.5%，NaCl的质量百分比浓度为10% ； (3)、在两边有开口的塑料支撑体的上面放上吸水材料，然后再将步骤(2)洗涤后的载体的正面朝上，放在吸水材料上； 所述的吸水材料为滤纸、脱脂棉、海绵、吸水纤维中的一种或两种以上的混合物； (4)、用蒸馏水将待测的血样稀释60倍，将稀释后的血样从步骤(3)所得的载体的正面缓慢滴加于到载体的小圈中； 待血样渗入到载体后，将与稀释后的血样等体积的纳米银-纳米稀土 -羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液从载体的正面缓慢加入到载体的小圈中； 待纳米银-纳米稀土 -羊抗鼠IgG(H+L)抗体的混合液渗入到载体后，将载体依次用洗液、蒸馏水洗涤3次，然后将为稀释后的血样5倍体积的银染剂从载体的正面迅速加入到载体的小圈中，避光反应lmin，然后用蒸馏水洗去银染剂； 所述的银染剂为含有硝酸银和对苯二酚的水溶液，其中硝酸银的浓度为0.015mol/L和对苯二酚的浓度为0.075mol/L ； 根据载体的小圈中出现均匀一致的灰黑色斑点颜色的深度，用比色法得出血中TNNI3K的浓度。
【文档编号】G01N33/544GK104165993SQ201410391757
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】刘小珍, 任晓辉, 刘小舟, 陈捷 申请人:上海应用技术学院