原发性高血压基因无创检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测原发性高血压基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测ACE基因上I/D、AGTR1基因上A1166C、NOS3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Arg16Gly以及CYP11B2基因上C-344T的6个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与原发性高血压发生密切相关的6个单核苷酸多态性位点的基因型从基因层面来评估人群原发性高血压发病的风险级别，提早预防疾病的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
【专利说明】原发性高血压基因无创检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种原发性高血压的基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估人群原发性高血压发生的风险级别，并且指导原发性高血压高危人群提早预防和治疗。
【背景技术】
[0002]原发性高血压是危害人类生命健康的世界性公共卫生问题之一。作为主要危险因素，它所导 致的脑卒中、冠心病、心功能不全、肾脏疾病等，在总患病率和总死亡率中所占的比例日趋增高，已上升为各类疾病死亡率的首位，给家庭和社会带来了很大的经济负担。预计到2020年，冠心病和脑卒中将成为全球排名第一位和第四位的疾病，因此，深入探索高血压病因，开展高血压易感基因的研究是十分重要的现实课题。
[0003]人血管紧张素转化酶(ACE)基因全长21kb，包含26个外显子，在16号内含子存在插入(I)或缺失(D)多态性，血清ACE活性高低不同在不同ACE基因型人群中依次为DD>DI>II型。血中的ACE影响着血管紧张素I (Ang I)向活性较强的血管紧张素II (AngII)转换，其结果不但影响内环境的稳定，而且对于血管弹性的维持也具有重要作用。ACE基因还能灭活缓激肽、速激肽等，而这两种多肽可以降低血压。
[0004]AGTRl基因能够介导血管收缩、促进血管平滑肌细胞增殖，使血管变厚。当A1166C位点为AC基因型时，AGTRl蛋白表达量增加，血管壁张力增加、血管壁厚度增加，增加高血压的发病风险。
[0005]内源性一氧化氮合酶(eN0S3/N0S3)是一氧化氮(NO)合成的限速酶，NO是外周与中枢神经系统的神经递质，在心血管系统具有维持血管张力，调节血压等功能。一旦eN0S3基因突变，NO生成不足，即可引起高血压。
[0006]血管紧张素原(AGT)基因定位于lq42 _43，是目前最有代表性、研究最多的血压调节候选基因。能够介导血管收缩、促进血管平滑肌细胞增殖，使血管变厚。1992年Jeunemaitre等使用原发性高血压家系中同胞患者配对的方法(sib - pair),最先证实AGT基因M235T多态性与高血压相关基因连锁。
[0007]ADRB2基因通过改变血管紧张性，调节肾素释放，影响水盐代谢等途径调节血压。当Argl6Gly位点为AG基因型时，ADRB2蛋白活性降低，血管扩张反应减弱，导致血管阻力增加，增加高血压的发病风险。
[0008]血中醛固酮水平与醛固酮合成酶活性密切相关，该酶是体内合成醛固酮的重要催化酶。其基因CYP11B2定位于8号染色体上(8q22)，总长约7kb，含8个内含子和9个外显子。常见的变异位于启动子区域-344处，发生C与T的交换。研究表明，CYP11B2基因C-334T多态性与血中醛固酮水平，高血压病等密切相关。
[0009]因此，建立简单、快速的原发性高血压易感基因无创检测方法，能够检测出人群原发性高血压疾病发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患原发性高血压的高危人群，有针对性的进行指导和预防，对于降低疾病发生、保障人群的安全健康具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0010]基于ACE 基因上 I/D、AGTR1 基因上 A1166C、N0S3 基因上 G894T、AGT 基因上 M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYPl 1B2基因上C-344T的6个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估原发性高血压发病风险级别，本发明提供一种原发性高血压基因无创检测试剂盒。
[0011]该试剂盒包括:
检测ACE基因上I/D、AGTRl基因上A1166C、N0S3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYPl 1B2基因上C-344T的6个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0012]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；测序反应体系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0013]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。
[0014]
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0016]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0017]
实施例1.检测试剂盒的使用
1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0018]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(1)ACE (Ι/D)正向引物:5’ GAGCCACTCCCATCCTTTCT3’
ACE (Ι/D)反向引物:5’ CCAGCCCTTAGCTCACCTCT3’
(2)AGTRl (A1166C)正向引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’AGTRl (A1166C)反向引物:5’GTGGCTTTGCTTTGTCTTGTT3’
(3 ) N0S3 (G894T)正向引物:5’ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’
N0S3 (G894T)反向引物:5’CCTCACCTCCAGGATGTTGT3’
(4)AGT (M235T)正向引物:5’ CTGACAGGCTACAGGCAATC3’
AGT (M235T)反向引物:5’ CACATAGTAGGGCAGCAGGT3’
(5)ADRB2 (Argl6Gly)正向引物:5’ CACATAACGGTGCAGAACG3’
ADRB2 (Argl6Gly)反向引物:5’AGCACATTGCCAAACACG3’
(6)CYP11B2 (C-344T)正向引物:5’AAACCCACAGCATGTTGACC3’
CYPl 1B2 (C-344T)反向引物:5’ CTCCTTTCTCCAGGGCTGA3’
PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ul ;25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq 酶 0.125ul、DNA 模板 lul (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ul、ddH2019.175ul ；
反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0019]3、PCR扩增产物纯化 使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0020]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0021]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)ACE(Ι/D)测序引物:5’GAGCCACTCCCATCCTTTCT3’
(2)AGTRl (A1166C)测序引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’
(3)N0S3 (G894T)测序引物:5’ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’
(4)AGT (M235T)测序引物:5’CTGACAGGCTACAGGCAATC3’
(5)ADRB2 (Argl6Gly)测序引物:5’CACATAACGGTGCAGAACG3’
(6)CYP11B2 (C-344T)测序引物:5’ AAACCCACAGCATGTTGACC3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0022]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的960C 30s，55°C 30s,60°C 4min。
[0023]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0024]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0025]实施例2.为人群进行预防原发性高血压基因无创检测的服务
1.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提
2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的ACE基因上I/D、AGTRl基因上A1166C、N0S3 基因上 G894T、AGT 基因上 M235T、ADRB2 基因上 Argl6Gly 以及 CYPl 1B2 基因上C-344T的6个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这6个SNPs位点的基因型。
[0026]3.原发性高血压高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具原发性高血压风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者ACE基因上I/D、AG TRl基因上A1166C、N0S3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYPl 1B2基因上C-344T的6个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读人群原发性高血压基因无创检测报告单。
【权利要求】
1.一种筛查原发性高血压高危人群的基因无创检测试剂盒，其特征在于:检测ACE基因上I/D、AGTRl基因上Al 166C、N0S3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYP11B2基因上C-344T的6个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性引物对是指针对ACE基因上I/D、AGTRl基因上Al 166C、N0S3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYP11B2基因上C-344T的6个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这6个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的DNA测序引物是针对ACE基因上I/D、AGTRl 基因上 A1166C、N0S3 基因上 G894T、AGT 基因上 M235T、ADRB2 基因上 Argl6Gly以及CYPl 1B2基因上C-344T的6个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述6个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的6对特异性引物序列如下: (1)ACE (Ι/D)正向引物:5’ GAGCCACTCCCATCCTTTCT3’ ACE (Ι/D)反向引物:5’ CCAGCCCTTAGCTCACCTCT3’ (2)AGTRl (A1166C)正向引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’ AGTRl (A1166C)反向引物:5’GTGGCTTTGCTTTGTCTTGTT3’
(3 ) N0S3 (G894 T)正向引物:5’ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’
N0S3 (G894T)反向引物:5’CCTCACCTCCAGGATGTTGT3’ (4)AGT (M235T)正向引物:5’ CTGACAGGCTACAGGCAATC3’
AGT (M235T)反向引物:5’ CACATAGTAGGGCAGCAGGT3’ (5)ADRB2 (Argl6Gly)正向引物:5’ CACATAACGGTGCAGAACG3’
ADRB2 (Argl6Gly)反向引物:5’AGCACATTGCCAAACACG3’ (6)CYP11B2 (C-344T)正向引物:5’AAACCCACAGCATGTTGACC3’ CYPl 1B2 (C-344T)反向引物:5’ CTCCTTTCTCCAGGGCTGA3’。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的6条DNA测序引物序列如下: (1)ACE(Ι/D)测序引物:5’GAGCCACTCCCATCCTTTCT3’ (2)AGTRl (A1166C)测序引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’ (3)N0S3 (G894T)测序引物:5’ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’ (4)AGT (M235T)测序引物:5’CTGACAGGCTACAGGCAATC3’ (5)ADRB2 (Argl6Gly)测序引物:5’CACATAACGGTGCAGAACG3’ (6)CYP11B2 (C-344T)测序引物:5’AAACCCACAGCATGTTGACC3’。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括: (1)?0?反应体系:10父？0?反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 产物纯化体系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH20.3.875ul ； (3)测序反应体系:25%BigDye mixlul, 3.2uM DNA测序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本试剂盒供一 人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
【文档编号】C12Q1/68GK103468782SQ201210184472
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月6日 优先权日:2012年6月6日
【发明者】郑俊斌 申请人:解码（上海）生物医药科技有限公司