一种快速检测稗草抗药性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测稗草抗药性的方法，包括以下步骤：（1）收集稗草种子：收集对除草剂敏感的稗草种子作为材料；（2）稗草的培养：将步骤（1）收集的稗草种子打破休眠后，先用硝酸钾浸泡催芽，再将发芽的稗草放入营养液中培养至2叶待用；（3）稗草的处理：将步骤（2）中培养至2叶的稗草粘在塑料板上，再放入不同梯度浓度的除草剂药液中浸泡30分钟，然后取出自然晾干，放入营养液中继续培养15天，评估稗草在叶片颜色、新叶生长及根系发育的变化，调查稗草死亡率，获取除草剂的甄别浓度，即能快速检测出稗草是否对除草剂产生了抗药性。本发明方法能一次性检测大批量的稗草样品，且具有时间短、准确可靠的优点。
【专利说明】一种快速检测稗草抗药性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物保护【技术领域】，特别涉及一种快速检测稗草对除草剂是否产生抗药性的方法。
【背景技术】
[0002]蜗尊(Bchinochloa是世界性十大恶性杂草之一,也是我国主要作物上危害最严重的杂草之一。对水稻生产危害尤为严重，不仅危害面积大，而且造成水稻减产也最显著。
[0003]目前化学防除仍然是防除稗草的最主要途径。由于稗草在世界范围内的农田中分布面积广，危害大。因此，除草剂的开发大部分是以稗草为主要防除目标，各种不同类型、不同作用机制的除稗剂相继被开发。
[0004]但随着使用年限的增加及选择压的增大，稗草对部分长期大量使用的除草剂均产生了抗药性。尤其在湖南省的洞庭湖稻区，由于直播稻发展历史悠久，除草剂的使用频率高，选择压大，稗草抗药性发展迅速。自1991年起，二氯喹啉酸在该地区大面积推广使用，至2002年，该地区的稻田稗草已对二氯喹啉酸产生了严重的抗药性。后来二氯喹啉酸停用，逐渐被三唑嘧啶磺酰胺类的五氟磺草胺所替代。近两年据当地农民反应，五氟磺草胺对稗草的防效急剧下降，翻倍增加使用剂量也很难凑效。此外，江西、安徽、江苏、浙江、上海等省均发现稗草对二氯喹啉酸的抗药性生物型。辽宁和广东稻区的稗草对丁草胺和禾草丹也产生了明显的抗药性。
[0005]目前稗草抗药性的检测方法很多，最常用的方法是温室整株植物测定法，基本步骤为，首先从长期单一使用过除草剂并怀疑有抗药性的杂草种子采回，播种于温室的盆内，在播后苗前或苗后进行常规施药处理，药剂设置不同浓度梯度，然后调查不同剂量下杂草的出苗率、发芽和死亡率、叶面积、干重等指标，并与空白对照进行比较，运用不同的除草剂浓度处理抗性和敏感种子，并根据剂量与防效关系做出回归曲线计算出ED5tl,以确定抗性倍数此方法技术简便易行，大批量植株同时进行，重复性好，常被利用。但该方法存在的一个大问题是整个试验周期太长，花费时间多，工作量极大。其它的还有诸多的方法，如靶标酶活性测定法、叶绿体抗性测定法、荧光信号检测法以及靶标抗性分子检测法等等。但有的方法用到的检测仪器昂贵，如叶绿体抗性测定法和荧光信号检测法。还有部分方法涉及到的试验试剂贵，需要专业的技术人员才能完成，如靶标抗性分子检测法。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速检测稗草抗药性的方法，该方法简单可靠，能快速的检测出大量稗草样本对茎叶处理剂(如二氯喹啉酸、氰氟草酯和五氟磺草胺等)的抗药性水平。
[0007]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为:
一种快速检测稗草抗药性的方法，包括以下步骤: (1)收集稗草种子:收集对除草剂敏感的稗草种子作为材料；
(2)稗草的培养:将步骤(I)收集的稗草种子用硝酸钾浸泡催芽，再将发芽的稗草放入营养液中培养至2叶待用；
(3)稗草的处理:将步骤(2)中培养至2叶的稗草粘在塑料板上，放入不同梯度浓度的除草剂药液中浸泡30分钟，然后取出自然晾干，再放入营养液中继续培养15天，评估稗草在叶片颜色、新叶生长及根系发育的变化，调查稗草死亡率，获取除草剂药液的甄别浓度。
[0008]优选的，所述步骤(2)中稗草的培养具体是:将收集后的稗草种子打破休眠后，先用0.25%硝酸钾常温浸泡I天，然后过滤掉多余的水分，置于培养箱内培养，待其发芽后放入营养液中继续培养，培养至I叶期时，将稗草苗10株贴于一张长15cm,宽7cm的塑料板上，再将塑料板放置于装有营养液的杯中继续生长至2叶。
[0009]优选的，所述营养液为浓度0.526ml/ml的肥万稼营养液，稗草培养时让塑料板斜放于杯中，以保证植物根部浸入杯中营养液里。
[0010]优选的，所述除草剂药液的甄别浓度为稗草死亡率为95%时所对应的除草剂浓度。
[0011]与现有技术相比，本发明的优点在于:
本发明的一种快速检测稗草抗药性的方法，能快速、大批量且准确地检测出稗草是否对除草剂产生了抗药性，可及时掌握田间稗草对除草剂的抗药性动态，为科学合理地使用除草剂提供理论依据。该方法适合于禾本科杂草稗草的抗药性监测。
【具体实施方式】
[0012]为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
[0013]一种快速检测稗草抗药性的方法的实施例，包括以下步骤:
(O收集稗草种子:收集对除草剂敏感的稗草种群种子，该敏感种群是由盆栽法确定的；
(2)稗草的培养:将步骤(I)收集的稗草种子打破休眠后，先用0.25%硝酸钾常温浸泡I天，然后过滤掉多余的水分，置于培养箱内培养，待其发芽后放入经摸索确定的浓度为0.526ml/ml的肥万稼(设为标准浓度，此浓度下稗草的生长最好)营养液中继续培养，培养至I叶期时，将稗草苗10株贴于一张长15cm，宽7cm的塑料板上，再将塑料板斜放置于装有肥万稼营养液的杯中继续生长，培养时保持植物根部浸入杯中营养液里，待稗草培养至2叶后，待用；
(3)稗草的处理:将步骤(2)中培养至2叶的稗草放入不同梯度浓度的除草剂药液中浸泡30分钟，然后取出自然晾干,再放入营养液中继续培养15天，评估稗草在叶片颜色、新叶生长及根系发育的变化，调查稗草死亡率，获取稗草死亡率为95%时所对应的除草剂浓度，该浓度即为除草剂药液的甄别浓度。
[0014]实施例一
稗草对二氯喹啉酸的抗药性快速检测方法
先将收集的稗草种子打破休眠后，用0.25%硝酸钾常温浸泡I天，过滤掉多余的水分，再置于培养箱内培养，待其发芽后放入浓度为0.526ml/ml肥万稼营养液中继续培养,培养至I叶期时，将稗草苗10株贴于一张长15cm，宽7cm的塑料板上，再将塑料板斜放置于装有肥万稼营养液的杯中继续生长，培养时保持植物根部浸入水中，待稗草培养至2叶后,待用。
[0015]甄别浓度的筛选:
以二氯喹啉酸的田间剂量为参考，先以10倍量梯度设6个处理0，0.05，0.5，5，50，500，5000g a.1./hm2,每个处理重复3次，将粘有10株稗草的塑料板斜放入二氯喹啉酸药液中浸泡30分钟，取出让其自然晾干，再放入营养液中继续培养15天，评估稗草在叶片颜色、新叶生长及根系发育的变化，调查稗草死亡率。结果显示:6个处理0，0.05，0.5，5，50，500，5000g a.1./hm2的死亡率分别为0，0，0，35%，65%，100%, 100%。确定第一次甄别浓度范围在5_500g a.1./hm2 之间。
[0016]根据上述范围5-500g a.1./hm2 第二次设 6 个处理 0，31.25，62.5，125，250，500ga.1./hm2,每个处理重复3次,稗草培养和处理同上。结果显不:6个处理O, 31.25, 62.5,125，250，500g a.1./hm2 的死亡率分别为 0,41%, 72%, 100%, 100%, 100%。确定第二次甄别浓度范围在62.5-125 g a.1./hm2之间。
[0017]根据上述范围62.5-125 g a.1./hm2 第三次设 6 个处理 0，50，70，90，110，130 g
a.1./hm2,每个处理重复3次,稗草培养和处理同上。结果显不:6个处理O, 50, 70,90,110,130g a.1./hm2的死亡率分别为0,67%,89%,98%, 100%, 100%。确定第三次甄别浓度范围在70_90g a.1./hm2 之间。
[0018]根据上述范围70-90g a.1./hm2 第四次设 6 个处理 0，60，70，80，90，10g a.1./hm2，每个处理重复3次，稗草培养同上，这次每块板粘20株稗草，处理同上。结果显示:6个处理 0，60，70，80，90，10g a.1./hm2 的死亡率分别为 O, 75%, 90%, 95%, 100%, 100%。确定第四次甄别浓度为80g a.1./hm2。
[0019]用第四次的甄别浓度80g a.1./hm2处理抗二氯喹啉酸的稗草样品1、样品2和样品3 (用盆栽法确定的抗性倍数分别为397.1，125.7和95.8)结果发现:3个样品经甄别浓度处理后死亡率分别为15%，37%和65%。与传统的盆栽法结果一致。
[0020]实施例二
稗草对五氟磺草胺的抗药性快速检测方法
先将收集的稗草种子打破休眠后，用0.25%硝酸钾常温浸泡I天，过滤掉多余的水分，再置于培养箱内培养，待其发芽后放入浓度为0.526ml/ml肥万稼营养液中继续培养,培养至I叶期时，将稗草苗10株贴于一张长15cm，宽7cm的塑料板上，再将塑料板斜放置于装有肥万稼营养液的杯中继续生长，培养时保持植物根部浸入水中，待稗草培养至2叶后,待用。
[0021]甄别浓度的筛选:
以五氟磺草胺的田间剂量为参考，先以10倍量梯度设6个处理0，0.0025,0.025，0.25，
2.5，25，250 g a.1./hm2，每个处理重复3次，将粘有10株稗草的塑料板斜放入五氟磺草胺药液中浸泡30分钟,取出让其自然晾干,再放入营养液中继续培养15天，评估稗草在叶片颜色、新叶生长及根系发育的变化，调查稗草死亡率。结果显示:6个处理0，0.0025，0.025，
0.25，2.5，25，250 g a.1./hm2 的株防效分别为 0,0,0,0,55%, 100%, 100%。确定第一次的甄别浓度范围在2.5-25 g a.1./hm2之间。
[0022]根据上述范围2.5-25 g a.1./hm2 第二次设 6 个处理 O, 3.125,6.25，12.5,25,50g a.1./hm2,每个处理重复3次,稗草培养和处理同上。结果显不:6个处理O, 3.125,6.25,12.5，25，50 g a.1./hm2 的死亡率分别为 O, 51%，63%，90%, 100%, 100%。确定第二次的甄别浓度范围在12.5-25 g a.1./hm2之间。
[0023]根据上述范围12.5-25 g a.1./hm2 第三次设 6 个处理 0，5，10，15，20，25 g a.1./hm2,每个处理重复3次，稗草培养和处理同上。结果显不:6个处理0,5,10,15, 20, 25ga.1./hm2的死亡率分别为0，61%，87%，91%，100%, 100%。确定第三次甄别浓度范围在15_20ga.1./hm2 之间。
[0024]根据上述范围15_20g &.1./111112第四次设6个处理0，14，16，18，20，228 a.1./hm2,每个处理重复3次，稗草培养同上，这次每块板粘20株稗草，处理同上。结果显示:6处理0,14，16，18，20，22g a.1./hm2 的死亡率分别为 0,85%, 89%, 92%, 95%, 100%。确定第四次的聖瓦别浓度为20g a.1./hm2。
[0025]用第四次的甄别浓度20g a.1./hm2处理抗性稗草样品1、样品2和样品3(用盆栽法确定的抗性倍数分别为354.7，119.7和112.1)结果发现:3个样品经甄别浓度处理后死亡率分别为19.7%，36.2%和47.8%。与传统的盆栽法结果一致。
【权利要求】
1.一种快速检测稗草抗药性的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)收集稗草种子:收集对除草剂敏感的稗草种子作为材料； (2)稗草的培养:将步骤(I)收集的稗草种子用硝酸钾浸泡催芽，再将发芽的稗草放入营养液中培养至2叶待用； (3)稗草的处理:将步骤(2)中培养至2叶的稗草粘在塑料板上，放入不同梯度浓度的除草剂药液中浸泡30分钟，然后取出自然晾干，再放入营养液中继续培养15天，评估稗草在叶片颜色、新叶生长及根系发育的变化，调查稗草死亡率，获取除草剂药液的甄别浓度。
2.根据权利要求1所述的快速检测稗草抗药性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中稗草的培养具体是:将收集后的稗草种子打破休眠后，先用0.25%硝酸钾常温浸泡I天，然后过滤掉多余的水分，置于培养箱内培养，待其发芽后放入营养液中继续培养，培养至I叶期时，将稗草苗10株贴于一张长15cm,宽7cm的塑料板上,再将塑料板放置于装有营养液的杯中继续生长至2叶。
3.根据权利要求2所述的快速检测稗草抗药性的方法，其特征在于，所述营养液为浓度0.526ml/ml的肥万稼营养液，稗草培养时让塑料板斜放于杯中，以保证植物根部浸入杯中营养液里。
4.根据权利要求1所述的快速检测稗草抗药性的方法，其特征在于，所述除草剂的甄别浓度为稗草死亡率为95%时所对应的除草剂浓度。
【文档编号】G01N33/00GK104267152SQ201410517531
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】马国兰, 李巳夫, 刘都才, 刘雪源, 唐涛, 彭亚军 申请人:湖南省植物保护研究所