一种检测邻苯二甲酸二甲酯的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测邻苯二甲酸二甲酯的方法及试剂盒，属于生物检测领域。本发明通过化学方法合成了DMP人工抗原，再用DMP人工抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合筛选得到分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株；再以合成的DMP人工抗原作为包被抗原、DMP单克隆抗体作为一抗创建了检测DMP的间接竞争ELISA方法和试剂盒，可用于样品中的DMP测定，该方法具有操作简单、费用低廉、快速灵敏等优点。
【专利说明】-种检测邻苯二甲酸二甲醒的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及一种简便、费用低廉、快速灵敏检测邻苯二甲酸二 甲醋（DMP)的免疫学方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二甲醋（DMP)，又称1,2-苯二甲酸二甲醋，駄酸二甲醋，英文名是 Dimeth}d地地313*6,分子式(：1化。〇4,分子量为194. 19,密度为1. 191g/mL。DMP是一种无 色透明，微黄色油状的液体，稍微有点芳香味，其沸点为283. 7C，能与己醇、己離等一般有 机溶剂混溶，不溶于水和石油離。邻苯二甲酸醋类与塑料分子的相容性很化它们之间由氨 键或范德华力连接，彼此保留各自相对独立的化学性质，常常作为增塑剂广泛应用于食品 包装、医疗设备制造、建筑装修、农业用品等生活的各个领域，随着使用时间由塑料转移到 环境中，造成空气、水和±壤的污染。美国环保局巧PA)将6种邻苯二甲酸醋类（PAEs)类 化合物列入129种重点控制的污染物名单中，包括邻苯二甲酸二甲醋（DMP)、邻苯二甲酸二 己醋值EP)、邻苯二甲酸二下醋值BP)、邻苯二甲酸二辛醋值OP)、邻苯二甲酸下予醋炬BP) 和邻苯二甲酸二（2-己基）己醋值EHP)，我国环境优先污染物黑名单中也包括3种PAEs化 合物；邻苯二甲酸二甲醋（DMP)、邻苯二甲酸二下醋值BP)、邻苯二甲酸二辛醋值OP)。
[0003] 我国食品接触材料中DMP的使用限量为3%，仅能用于非接触、非脂肪性食品的 材料，不得用于接触婴幼儿食品用材料。我国对食品塑料包装材料进行提取、净化后经气 相色谱-质谱联用（GC-M巧测定，采用特征选择离子监测扫描模式检测，DMP最低可检出 0.05mg/kg。贾丽等运用高效液相色谱法OPLC)测定邻苯二甲酸二甲醋，用己醇提取样品 中的邻苯二甲酸醋类，再用己膳-水作为淋洗液，测定DMP的检出限为0. 14 y g/L。
[0004] 目前，国内外对DMP的监测方法主要是色谱法，包括气相和液相色谱法，此外，还 有色谱-质谱的联用技术。虽然该些方法都能精确地检测DMP的含量，但此法对仪器条件 要求高，前处理的操作相对复杂、耗时也较长。现已有基于多克隆抗体的PAEs免疫检测研 究，但多克隆抗体的制备受动物免疫时间、免疫批次限制而不能无限量生产。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于提供一种分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明的目的 还在于提供一种检测DMP的间接竞争化ISA方法及试剂盒。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] -种分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过包含如下步骤的方法制备得到：
[0008] (1)取用DMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞息液混合。
[0009] (2)离也弃上清，加入PEG使细胞融合，再加入1640培养基终止阳G的作用；重复 该步骤。
[0010] (3)离也弃上清，加入HAT培养基，铺至细胞板中进行培养。
[0011] (4)融合后第7天观察，标出有融合细胞的孔，记录位置和克隆数，补加HAT培养 基；2周后，用HAT培养基全量换液，待细胞长至板底1/10时做检测。
[0012] (5)选择效价最高的并且对DMP具有特异性的阳性细胞进行克隆，克隆化结束后， 建株得到分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0013] 步骤（1)中所述的DMP人工抗原优选通过包含如下步骤的方法制备得到：
[0014] 1)半抗原的合成
[00巧]往10血甲醇中加入IOg 4-硝基邻苯二甲酸，揽拌下加入1血浓硫酸（98% )作催 化剂，12CTC回流化。反应结束后，继续升温，蒸出剩余的甲醇。抽滤除去催化剂，得到粗产 品。粗产品用氨氧化轴中和，减压蒸觸收集180?185C /7. 3kPa的觸分，得到纯净的4-硝 基邻苯二甲酸二甲醋。用甲醇作溶剂，溶解4-硝基邻苯二甲酸二甲醋，按照每3mmol 4-硝 基邻苯二甲酸二甲醋加0. 〇5g把碳的比例加入把碳，加氨气还原24小时。除去未参加反应 的把碳和甲醇，得到4-氨基邻苯二甲酸二甲醋（DMAP)晶体。
[001引。人工抗原的合成
[0017] 将40mg(0. 2mmol)DMAP溶于2血二氧六环中，揽拌条件下缓慢加入2血Imol/L 肥1。待冷却至4。滴加200iiL 7%的NaN〇2溶液，揽拌反应30min得到重氮盐溶液。再 将10血含60mg载体蛋白的0. 2mol/L pH9. 0测酸盐缓冲液加入到重氮盐溶液中，继续反应 池。IOOOOg离也5min，取上清，放于0. Imol/L抑7. 4PBS中透析，得到DMP人工抗原。所 述的载体蛋白优选为牛血清白蛋白炬SA)或卵清蛋白（OVA)，相应得到的DMP人工抗原为 DMAP-BSA 或 DMAP-OVA。
[0018] 一种检测DMP的间接竞争化ISA方法，包括如下步骤：
[001引 （1)试剂1用试剂2稀释至0.5 yg/血，100 UL/孔包被酶标板，空白对照孔加 IOOy L试剂2,4°C过夜。
[0020] 似每孔加入200 y L试剂3,轻晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，每孔加入 250 Ul试剂4,放于37 °C比。
[002。 做每孔加入200 y L试剂3,摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，按如下 处理加样；DDMP标准品；用试剂5梯度稀释的不同浓度的DMP标准品50 UL 2)检测样品： 用试剂5溶解的检测样品50 y L，扣阳性对照；50 y L试剂5 ;各处理分别再加入50 y L试剂 6 (浓度为250ng/mL)，放于37C比；
[002引 （4)每孔加入200 y L试剂3,轻晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，每孔加入 IOOy L 试齐U 7,放于 370C Ih。
[002引 妨每孔加入200 y L试剂3,轻晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，新鲜配制 试剂8,100 y L/孔加入酶标板，室温避光25min。
[0024] (6)每孔加50 U L试剂9,终止反应，用酶标仪测定492皿处的吸光值。
[0025] (7) W DMP标准品的浓度对数log[C]为横坐标狂)，对应的抑制率I (%)为纵坐 标（Y)，可得一条Y = bX+a直线，抑制率I (%)通过如下公式计算得到：
[0026] 1(%)=令^xlOO A-A.,,
[0027] 式中；A为阳性对照孔的吸光值，Ai为含有浓度i的DMP孔的吸光值，A。为空白对 照孔的吸光值。
[0028] 根据检测样品的吸光值计算抑制率Y，代入直线，可得X，取反对数，即可得出检测 样品中DMP的浓度。
[0029] 上述步骤中试剂1-9分别为：人工抗原DMAP-0VA，0. 05mol/L pH9. 6碳酸盐缓 冲液，含0.05% Tween-20的PBS ;1%卵清蛋白，含1%牛血清白蛋白的PBS，DMP单克隆 抗体，HRP标记的羊抗小鼠IgG, OPD显色剂，2mol/L略〇4。所述的DMP单克隆抗体由W DMAP-BSA作为DMP人工抗原通过上述方法制备的杂交瘤细胞株分泌得到，具体方法为：将 约为1-2 X IO6个杂交瘤细胞用0. Olmol/L抑7. 4PBS漂洗2次，小也将细胞吹下，200g离也 5min弃上清，再用0. 4mL PBS息浮细胞沉淀，注射到已提前用石蜡处理过的BALB/c小鼠腹 腔内。10-12天后无菌操作收集小鼠腹水，200g离也5min，沉淀细胞可冻存，上清中含有大 量单克隆抗体。通过二氧化娃吸附法除去腹水中的小颗粒物质、残渣和脂肪滴。辛酸/硫 酸馈沉淀法纯化腹水，在PBS中透析4-5天，得到纯化腹水，获得DMP单克隆抗体。
[0030] 一种检测DMP的间接竞争化ISA试剂盒，包含上述试剂1-9和DMP标准品。
[0031] 为了更好地检测DMP的污染水平W及评价暴露于DMP产生的潜在不利影响，本发 明制备出一株能稳定分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过间接竞争化ISA方法检测 DMP在环境、生活用品、医疗器械、人体血液W及尿液中的含量，与色谱法相比，操作简单、费 用低廉、快速灵敏等优点。
[0032] 采用本发明方法和试剂盒，根据所建立的标准曲线y = 19. 68X+20. 71，R2 = 0. 993(图1)，当抑制率达到10%时，得到邻苯二甲酸二甲醋的最低检测限（LD)即ICi。为 0. 28 U g/Lo
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1是通过本发明方法测定DMP的标准曲线。
【具体实施方式】
[0034] W下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指 明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0035] 实施例IDMP人工抗原的合成
[003引 1、半抗原的合成
[0037] 在装有温度计、分水器、冷凝管的H颈烧瓶中，加入IOg 4-硝基邻苯二甲酸和 IOmL甲醇，在磁力揽拌器的作用下，加入ImL浓硫酸（98% )催化剂，控制反应温度在12CTC 左右，回流化。反应结束后，继续升温，蒸出剩余的甲醇。抽滤除去催化剂，得到粗产品。粗 产品用氨氧化轴中和，减压蒸觸收集180?185C /7. 3kPa的觸分，得到纯净的4-硝基邻苯 二甲酸二甲醋，是一种淡黄色晶体。用甲醇作溶剂，完全溶解4-硝基邻苯二甲酸二甲醋，按 照每3mmol样品加0. 05g把碳的比例加入把碳，加氨气还原24小时。除去未参加反应的把 碳和甲醇，得到4-氨基邻苯二甲酸二甲醋（DMAP)晶体。
[0038] 2、人工抗原的合成
[0039] 将40mg(0. 2mmol)DMAP溶于2血二氧六环中，揽拌条件下缓慢加入2血Imol/L 肥1。待冷却至4。滴加200iiL 7%的NaN〇2溶液，揽拌反应30min得到重氮盐溶液。再 将10血含60mg载体蛋白炬SA或OVA)的0. 2mol/L pH9. 0测酸盐缓冲液加入到重氮盐溶 液中，继续反应化。IOOOOg离也5min，取上清，放于0. Imol/L抑7. 4PBS中透析，得到人工 抗原 DMAP-BSA 或 DMAP-OVA。
[0040] 实施例2分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
[0041] 1、小鼠的免疫及抗体效价的检测
[0042] 将人工抗原DMAP-BSA用PBS均稀释到Img/mU加入等体积的完全佐剂（FCA)或不 完全佐剂（FICA)，充分混匀，采用颈背部皮下注射和加强免疫的方式对小鼠进行免疫，免疫 方案表1。免疫结束后7-10天后，BALB/c小鼠尾部取血，30(K)巧m离也lOmin，上清即为抗 血清，采用间接化ISA测定抗血清效价，选择效价为64000的小鼠取脾细胞。
[0043] 表1免疫方案
[0044]
【权利要求】
1. 一种分泌邻苯二甲酸二甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：通过包含如 下步骤的方法制备得到： (1) 取用DMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞悬液混合； (2) 离心弃上清，加入PEG使细胞融合，再加入1640培养基终止PEG的作用；重复该步 骤； (3) 离心弃上清，加入HAT培养基，铺至细胞板中进行培养； (4) 融合后第7天观察，标出有融合细胞的孔，记录位置和克隆数，补加HAT培养基；2 周后，用HAT培养基全量换液，待细胞长至板底1/10时做检测； (5) 选择效价最高的并且对DMP具有特异性的阳性细胞进行克隆，克隆化结束后，建株 得到分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2. 根据权利要求1所述的分泌邻苯二甲酸二甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征 在于：步骤（1)中所述的DMP人工抗原通过包含如下步骤的方法制备得到： 1) 半抗原的合成 往IOmL甲醇中加入IOg 4-硝基邻苯二甲酸，搅拌下加入ImL浓硫酸作催化剂，120°C 回流7h ;反应结束后，继续升温，蒸出剩余的甲醇；抽滤除去催化剂，得到粗产品；粗产品用 氢氧化钠中和，减压蒸馏收集180?185°C /7. 3kPa的馏分，得到纯净的4-硝基邻苯二甲 酸二甲酯；用甲醇作溶剂，溶解4-硝基邻苯二甲酸二甲酯，按照每3_〇1 4-硝基邻苯二甲 酸二甲酯加〇. 〇5g钯碳的比例加入钯碳，加氢气还原24小时；除去未参加反应的钯碳和甲 醇，得到DMP晶体； 2) 人工抗原的合成 将40mg DMAP溶于2mL二氧六环中，搅拌条件下加入2mL lmol/L HCl ;待冷却至4°C， 滴加200 ii L 7%的NaNO2溶液，搅拌反应30min得到重氮盐溶液；再将IOmL含60mg载体蛋 白的0. 2mol/L pH9. 0硼酸盐缓冲液加入到重氮盐溶液中，继续反应3h ; IOOOOg离心5min， 取上清，放于0. lmol/L pH7. 4 PBS中透析，得到DMP人工抗原。
3. 根据权利要求2所述的分泌邻苯二甲酸二甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征 在于：所述的载体蛋白为BSA或0VA，相应得到的DMP人工抗原为DMP-BSA或DMAP-0VA。
4. 一种检测邻苯二甲酸二甲酯的间接竞争ELISA方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 试剂1用试剂2稀释至0. 5 ii g/mL，100 ii L/孔包被酶标板，空白对照孔加100 ii L 试剂2,4°C过夜； (2) 每孔加入200 ii L试剂3,摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，每孔加入 25〇1^试剂4，放于371：111; (3) 每孔加入200 ii L试剂3,摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，按如下处理加 样：1) DMP标准品：用试剂5梯度稀释的不同浓度的DMP标准品50 y L，2)检测样品：用试 齐U 5溶解的检测样品50 ii L，3)阳性对照：50 ii L试剂5 ;各处理分别再加入50 ii L试剂6， 放于 37°C Ih; (4) 每孔加入200 ii L试剂3,摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，每孔加入 100 UL 试剂 7,放于 37 °C Ih ; (5) 每孔加入200 ii L试剂3,摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，新鲜配制试剂 8,100 ii L/孔加入酶标板，室温避光25min ; (6) 每孔加50 ii L试剂9,终止反应，用酶标仪测定492nm处的吸光值； (7) 以DMP标准品的浓度对数log[c]为横坐标（X)，对应的抑制率I (%)为纵坐标（Y)， 可得一条Y=bX+a直线，抑制率I (%)通过如下公式计算得到：
式中：A为阳性对照孔的吸光值，Ai为含有浓度i的DMP孔的吸光值，Atl为空白对照孔 的吸光值； 根据检测样品的吸光值计算抑制率Y，代入直线，可得X，取反对数，即可得出检测样品 中DMP的浓度； 上述步骤中试剂1-9分别为：人工抗原DMAP-0VA，0. 05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液，含 0. 05% Tween-20的PBS ; 1%卵清蛋白，含1%牛血清白蛋白的PBS，DMP单克隆抗体，HRP标 记的羊抗小鼠IgG，OPD显色剂，2mol/L H2S04。
5. 根据权利要求4所述的检测邻苯二甲酸二甲酯的间接竞争ELISA方法，其特征在于：所述的DMP单克隆抗体通过包含如下步骤的方法制备得到：将1-2 X IO6个以DMP-BSA作为 DMP人工抗原通过权利要求1所述的方法制备的杂交瘤细胞用0.01m〇l/L pH7.4 PBS漂洗2 次，将细胞吹下，200g离心5min弃上清，再用0. 4mL PBS悬浮细胞沉淀，注射到已提前用石 蜡处理过的BALB/c小鼠腹腔内；10-12天后无菌操作收集小鼠腹水，200g离心5min，上清 中含有单克隆抗体；通过二氧化硅吸附法除去腹水中的小颗粒物质、残渣和脂肪滴；辛酸/ 硫酸铵沉淀法纯化腹水，在PBS中透析4-5天，得到纯化腹水，获得DMP单克隆抗体。
6. -种检测邻苯二甲酸二甲酯的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于：包含权利要求4 中所述的试剂1-9和DMP标准品。
【文档编号】G01N33/577GK104357405SQ201410689857
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】李慧, 李潇潇, 袁均林, 丁书茂, 杨旭, 张铭 申请人:华中师范大学