检测多糖结合蛋白(lbp)的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种定量检测脂多糖结合蛋白（LBP）的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联LBP抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与LBP抗体之间以共价交联方式连接。本发明检测试剂盒制备成本低廉，稳定性好，易于保存，数据重复性好，检测灵敏度高，可广泛应用于临床生化仪。
【专利说明】检测多糖结合蛋白（LBP)的胶乳增强免疫比浊试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种定量检测脓度症标志应急蛋白脂多糖 结合蛋白（LBP)的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein, LBP)是一种分子量为 60kDa，456个氨基酸组成的糖蛋白，以单链多肽的形式在肝细胞内合成，它属于I型急性期 反应蛋白，存在于人和动物的血清中。LBP既可将细菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS) 多聚体转换为单聚体，加速LPS与其受体CD14结合，显著放大LPS的致炎作用；也可加速 LPS与靶细胞膜上的清除受体结合，使LPS被靶细胞清除；还可催化LPS与脂蛋白结合，后 者可中和LPS的生物学活性，加速体内LPS的清除。LBP的不同作用可能是由不同功能位 点决定的。当LBP的某一功能位点与LPS的类脂A结合时，表现为对LPS的增敏作用；而 当另一功能位点与LPS的类脂A结合时，贝U可增强LPS的内化，表现为对LPS的抑制性调 理作用。生理条件下，血浆LBP的浓度很低仅达100ng/L，在LPS等致炎因子的作用下，LBP 的浓度可升高100-1000倍，如儿童急性胰腺炎和细菌感染时，LBP的浓度可显著升高。LBP 可在几种体液中检测到，在急性反应期腹腔的浓度是血浆的1%。经研究证实，LBP血浆水 平的升高是炎症细胞因子IL-1，IL-6, TNFa介导的LBP基因转录水平的激活而引起的。因 而，与常规用于炎症诊断的指标相比，LBP的早期检测是预测全身炎症反应和脓毒症的标志 指标之一。该检测可能在细菌性感染的严重程度或脓毒症的早期诊断，肝病晚期合并细菌 感染，高危患者（如I⑶，器官移植术后或免疫抑制治疗的患者）感染性疾病的监测，疾病转 归的评估，以及指导治疗方案的选择等方面有很高的价值。LBP检测可广泛用于ICU病房、 外科、感染科、创伤科及新生儿监护室、器官移植科、急诊科和治疗实验室等。
[0003] 对于LBP检测，现有检测方法主要有定量方法和定性检测方法，定量检测方法有 双抗夹心法（ELISA)、放射免疫分析法、免疫层析法等，其中放射免疫分析法在临床中有一 定的限制。目前通常应用ELISA方法检测，检测范围：0. 312-20pg/mL，灵敏度：最小可测 0. 15pg/mL，特异性：可同检测重组或天然的待测物质，且与其它相关蛋白无交叉反应，重复 性：板内，板间变异系数均〈10%。尽管ELISA的灵敏度较高，但其操作复杂，需要较多时间， 一般结果为定性或半定量，定量时偏差较大，且线性范围窄，对于样品稀释度不好控制。定 性方法主要有免疫层析法，其可以作为定性或半定量检测方法，可以快速给出结果，定性时 不需要特殊仪器，但是不能给出定量数据，而且主观误差较大。
【发明内容】
[0004] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种制备成本低廉，稳定 性好，易于保存，数据重复性好，检测灵敏度高，可广泛应用于临床生化仪的LBP检测试剂 盒，用于解决现有技术中的问题。
[0005] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种定量检测脂多糖结合蛋白 (LBP)的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括彼此独立的试剂Rl和试剂R2,所述试剂Rl主要由 缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联LBP 抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳 微球与LBP抗体之间以共价交联方式连接。
[0006] 本发明中的防腐剂1和2是指可以抑制试剂中细菌和微生物污染的一类试剂，对 试剂具有防腐杀菌的作用。试剂R2中的保护剂2是一类能够保护胶乳颗粒表面的抗体的 试剂。稳定剂1和2可以保持试剂内的电荷平衡。
[0007] 本技术方案中的LBP胶乳增强免疫比浊试剂盒，将LBP抗体交联在聚苯乙烯胶乳 微球表面，当血液中的LBP与LBP抗体反应时，带动聚苯乙烯胶乳微球聚集产生一定浊度， 而浊度与血液中的LBP含量在一定范围成正比，可以用全自动生化仪在400-800nm波长下 检测血液中LBP的含量。
[0008] 优选地，所述试剂Rl中的缓冲液1选自Ifepes缓冲液、TriS-HCl缓冲液、MOPS缓 冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其pH为7. 0? 9. 0,浓度为25?500mmol/L ;所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘 氨酸缓冲液、Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中任意一种或多种的组合，其pH为 7. 0 ?9. 0,浓度为 25 ?500mmol/L。
[0009] 优选地，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明对所述试剂Rl中 的缓冲液1进行了改进，所述试剂Rl中的缓冲液1包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷 酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度 为3. 5 - 7. 5g/L，生物缓冲液1的pH值为7. 2 - 7. 6。
[0010] 优选地，各组分在缓冲液1中的浓度为：
【权利要求】
1. 一种脂多糖结合蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,所述试剂R1 主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交 联LBP抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙 烯胶乳微球与LBP抗体之间以共价交联方式连接。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液1选自Hepes 缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一 种或多种的组合，其pH为7. 0?9. 0,浓度为25?500mmol/L ;所述试剂R2中的缓冲液2 选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液、Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中 任意一种或多种的组合，其pH为7. 0?9. 0,浓度为25?500mmol/L。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液1包括下列组 分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六 偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，生物缓冲液1的pH值为7. 2 - 7. 6。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的稳定剂1选自KC1、 似(：1、0&(：12中的任意一种或多种的组合，其质量浓度为0.5%?10% ;所述试剂1?2中的 稳定剂2采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用；其中离子稳定剂为NaCl、KC1、Na2C03、 Na2S04或者K2S04,悬浮稳定剂为PEG8000、鹿糖、甘油或者葡萄糖。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫 柳汞或者ProClin300 ;所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的增凝剂为PEG8000或 者葡聚糖。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的聚苯乙烯乳胶微球 的表面官能团为氨基、羧基、酰肼、醛基或环氧基，聚苯乙烯乳胶微球的的粒径在100? 600nm〇
8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的保护剂1为牛血清白 蛋白；所述试剂R2中的保护剂2为牛血清白蛋白。
9. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的EDTA的浓度为10? 100mmol/L〇
10. 根据权利要求1?9任一权利要求所述的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在 于，具体包括如下步骤： (1) 试剂R1的制备： 在缓冲液1中加入稳定剂1、增凝剂、防腐剂1、保护剂1和EDTA，搅拌混合均匀，即得试 剂R1 ; (2) 试剂R2的制备： 步骤一：将LBP抗体进行4°C透析，再用缓冲液2将LBP抗体稀释至2mg/ml，得到LBP 抗体稀释液；将聚苯乙烯胶乳微球用蒸馏水离心、洗涤3次； 步骤二：用缓冲液2将经过步骤一洗涤后的聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%， 再加入质量浓度为〇. 01 % _〇. 1 %的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm 离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入步骤一得到的LBP抗体稀释液，室温下搅拌反应 30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用缓冲液2洗涤沉淀，重复 离心洗涤3次，最后加入缓冲液2、防腐剂2、稳定剂2、保护剂2搅拌混合均匀即得试剂R2。
【文档编号】G01N33/68GK104407156SQ201410736344
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】吴勇泉 申请人:重庆中元生物技术有限公司