一种afp、gp73、pivka-ⅱ联合检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种定量检测甲胎蛋白AFP、高尔基体糖蛋白-73GP73、维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ的检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明所述检测试剂盒，包括互相独立的甲胎蛋白AFP检测试纸卡、高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA-Ⅱ检测试纸卡，所述检测试纸卡均各自包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。本发明所提供试剂盒首次将AFP、GP73和PIVKA-Ⅱ通过荧光微球免疫层析技术进行检测，兼具灵敏性和特异性，具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。
【专利说明】-种AFP、GP73、PIVKA- II联合检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种AFP、GP73、PIVKA- II联合检测试剂盒 及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP)是胎儿发育早期由肝脏和卵黄囊合成的一种 糖蛋白，随着胎儿发育和出生后年龄的增长，血液中AFP水平逐渐下降，成人血清AFP浓度 的参考区间为1_20 iig/L。AFP是肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC)的敏感特 异的标志物，血清AFP浓度超过400 ii g/L持续4周或者200-400 ii g/L持续5周以上，高度 怀疑肝细胞肝癌；同时血清AFP水平还有可用肝癌的大小判断、肝癌的疗效评估和预后判 断。但据统计，大约20% -30%的肝细胞肝癌患者血清AFP水平不高；部分良性肝病，包括 急性肝炎、慢性肝炎和大面积的肝坏死，也会有血清AFP的升高。因此，用血清AFP作为肝 细胞肝癌的标志物存在一定程度的假阳性和假阴性。
[0003] 高尔基体糖蛋白-73 (GolgiProtein 73, GP73)又称II型高尔基体膜蛋白 (Golgiphosphoprotein2, GOLPH 2)，其在慢性肝炎、肝硬化等病人血清中浓度升高，而在肝 细胞肝癌病人血清中升高更加明显，和正常人或良性肝病病人之间呈显著差异。有研究表 明，血清GP73用于肝癌的诊断，优于血清AFP检测。据文献报道，GP73检测肝癌的灵敏度 为69%，特异性为75%。对于早期肝癌的诊断，GP73的敏感性为62%，而AFP敏感性仅 为25%。AFP水平低于20 yg/L的肝癌患者中，有57%的人群GP73水平显著升高。这表 明，GP73的应用能够大大提高对AFP阴性的肝癌患者的检出率。
[0004] 维生素 K缺乏或拮抗剂-II诱导的蛋白质（Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist_II，PIVKA- II )，又叫脱 羧基凝血酶原（Des-gamma-carboxy prothrombin,DCP)或异常凝血酶原，1984年首次被认定为原发性肝癌的标志物。肝细胞肝 癌患者血清中PIVKA- II浓度水平远高于肝硬化和转移性肝癌患者，而且其血清浓度变化 和患者肝细胞癌的动态变化（手术、治疗和复发等）相关。后来的研究证实，PIVKA- II和 AFP检测可以互为补充，二者的联合检测可以将肝细胞肝癌的诊断率提高到84%，仅大约 16%的肝细胞肝癌患者两者都呈阴性结果。目前PIVKA- II检测已被列入《日本肝癌学会肝 癌诊疗规范2009年版》中，用于肝细胞癌高危人群的筛查及原发性肝癌的辅助诊断；我国 卫生部发布的《原发性肝癌诊疗规范（2011年版）》中用于肝细胞癌辅助诊断的标志物也包 括 PIVKA-II。
[0005] 综上，AFP是经典的肝细胞肝癌的生化标志物，GP73和PIVKA- II是新型肝癌标志 物的典型代表。相对而言，GP73的敏感性更高，而PIVKA- II的特异性更好，三种指标单独 应用时都存在一定程度的假阴性和假阳性，如果通过恰当的方式和手段，同时联合检测三 项指标，互为补充，将有助于进一步降低肝细胞肝癌临床诊断的假阴性和假阳性，提高这些 标志物对肝细胞肝癌的诊断性能，更好地为临床和患者服务。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种定量检测甲胎蛋白 AFP、高尔基体糖蛋白-73GP73、维生素 K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II的检 测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
[0007] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种定量检测甲胎蛋白AFP、高尔 基体糖蛋白-73GP73、维生素 K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II的检测试剂 盒，包括互相独立的甲胎蛋白AFP检测试纸卡、高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡和维 生素 K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II检测试纸卡，所述检测试纸卡均各自 包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸 水垫，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的金标垫上包含甲胎蛋白AFP抗体，所述高尔基体糖 蛋白-73GP73检测试纸卡的金标垫上包含高尔基体糖蛋白-73GP73抗体，所述维生素 K缺 乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II检测试纸卡的金标垫上包含维生素 K缺乏或拮 抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II抗体，所述各硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线， 所述金标垫上的甲胎蛋白AFP抗体、高尔基体糖蛋白-73GP73抗体和维生素 K缺乏或拮抗 剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II抗体采用荧光微球标记。
[0008] 优选的，各个金标垫上的抗体采用180nm突光微球标记，EX(nm) = 650/Em(nm)= 670,具有信号受背景干扰小，检测灵敏度高，结果重复性好的优点。
[0009] 优选的，所述底板为PVC底板。
[0010] 优选的，所述各硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加 样端较远一侧。
[0011] 优选的，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的检测线上包被有甲胎蛋白AFP抗体；所述 高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡的检测线上包被有高尔基体糖蛋白-73GP73抗体；所 述维生素 K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II检测试纸卡的检测线上包被有维 生素 K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II抗体。
[0012] 每个检测卡中金标垫上的抗体与检测线上的抗体可以是相同的抗体，也可以是不 同的抗体。
[0013] 优选的，各质控线上包被羊抗鼠抗体。
[0014] 优选的，所述各样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、TriS-HCl缓 冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲 液的浓度为20-200mM。
[0015] 优选的，本发明所述的各金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液 选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为 5_50mM〇
[0016] 优选的，所述缓冲液还包括反应增强剂，所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、 PEG8000和PEG20000中的任意一种，所述反应增强剂的浓度为10?50g/L。
[0017] 优选的，所述缓冲溶液还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自S-19TWEEN 20、 S-20TWEEN 80、S-13TRIT0N X-45、S-14TRIT0N X-100、S-15TRIT0N X305 中的任意一种或多 种的组合，所述表面活性剂的浓度为10?50g/L。
[0018] 优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明所述的各金标垫 在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸 钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3. 5 - 7. 5g/ L，缓冲液的pH值为7. 2 -7.6。
[0019] 优选的，各组分在缓冲液中的浓度为：
[0020]
【权利要求】
1. 一种定量检测甲胎蛋白AFP、高尔基体糖蛋白-73GP73、维生素K缺乏或拮抗剂-II 诱导产生的蛋白PIVKA- II的检测试剂盒，包括互相独立的甲胎蛋白AFP检测试纸卡、高尔 基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II 检测试纸卡，所述检测试纸卡均各自包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列 的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的金标垫上包含 甲胎蛋白AFP抗体，所述高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡的金标垫上包含高尔基体糖 蛋白-73GP73抗体，所述维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II检测试纸 卡的金标垫上包含维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II抗体，所述各硝 酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的甲胎蛋白AFP抗体、高尔基体糖蛋 白-73GP73抗体和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II抗体采用荧光微 球标记。
2. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述各硝酸纤维素膜上，检测线位于 离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。
3. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述甲胎蛋白AFP检测试纸卡的 检测线上包被有甲胎蛋白AFP抗体；所述高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡的检测线 上包被有高尔基体糖蛋白-73GP73抗体；所述维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋 白PIVKA- II检测试纸卡的检测线上包被有维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白 PIVKA- II 抗体。
4. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，各质控线上包被羊抗鼠抗体。
5. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述各样品垫采用缓冲液处理，所述 缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐 缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为20-200mM。
6. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述各金标垫采用缓冲液处理，所述 缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的 浓度为5-50mM。
7. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液中还包括反应增强剂， 所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一种，所述反应增强 剂的浓度为10?50g/L。
8. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上 盖，所述背卡设有三个平行的试纸卡卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设 有三个测试窗和三个加样孔，所述三个测试窗的位置分别与三个试纸卡的检测线和质控线 的位置相配合，所述三个加样孔的位置与三个试纸卡的样品垫的位置相配合。
9. 如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述三个加样孔之间还设有连接三 个加样孔的横槽。
10. 根据权利要求1?9任一权利要求所述的检测试剂盒的制备方法，具体包括如下步 骤： 1)用荧光微球标记的甲胎蛋白AFP抗体、高尔基体糖蛋白-73GP73抗体和维生素K缺 乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II抗体溶液分别喷涂各自对应的金标垫，制得分别 包含甲胎蛋白AFP抗体、高尔基体糖蛋白-73GP73抗体和维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导 产生的蛋白PIVKA- II抗体的金标垫； 2) 在甲胎蛋白AFP检测试纸卡的硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂甲胎蛋 白AFP抗体及羊抗鼠抗体；在高尔基体糖蛋白-73GP73检测试纸卡的硝酸纤维素膜的检测 线和质控线上分别喷涂高尔基体糖蛋白-73GP73抗体及羊抗鼠抗体；在维生素K缺乏或拮 抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II检测试纸卡的硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别 喷涂维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导产生的蛋白PIVKA- II抗体及羊抗鼠抗体； 3) 将三套样品垫、步骤1)制备的三套金标垫、步骤2)制备的三套硝酸纤维素膜、三套 吸水垫依次粘贴在底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试 剂盒。
【文档编号】G01N33/68GK104407155SQ201410736252
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】潘能科 申请人:重庆乾德生物技术有限公司