孔雀石绿残留检测elisa试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种孔雀石绿残留检测ELISA试剂盒。试剂盒包括盒体、盒盖、设置于盒体内的底部固定座和顶部固定座，所述的底部固定座上有各种试剂瓶下凹瓶位，用于放置孔雀石绿抗体工作液、酶标二抗工作液、显色液、终止液、浓缩洗涤液、孔雀石绿标准液、基质稀释液和Tween-20备用液，所述的顶部固定座上有各种卡槽或凹槽，用于放置酶标板、微孔条、吸管、比色卡和pH试纸。该实用新型采用间接竞争ELISA方法进行孔雀石绿残留的定性、定量检测，具有操作简单、灵敏度高、成本低廉等优点，适合大批量样品的现场快速检测。
【专利说明】 孔雀石绿残留检测ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种医药生物领域的检测试剂盒，具体涉及一种用于测定样品溶液中孔雀石绿残留含量的ELISA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]孔雀石绿(Malachite Green, MG)又名碱性绿、苯胺绿、维多利亚绿或中国绿等，属于三苯甲烷类染料，是一分子苯甲醛与两分子二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌存在的条件下聚合而形成的深绿色晶体。孔雀石绿在细胞分裂时阻碍蛋白肽的形成，使细胞内的氨基酸无法转化为蛋白肽，细胞分裂受到抑制，从而产生抗菌杀虫作用。最早在1913年有人发现孔雀石绿可使某些组织着色，破坏病原菌而不引起宿主损害，于是将孔雀石绿用做防腐齐U、杀锥虫药和其它医疗用途。由于抗菌效果好、价格便宜，孔雀石绿被广泛用作驱虫剂和杀菌剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫、原生动物和鱼卵中的霉菌，预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等。有时为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。
[0003]但孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿容易在生物体内积累，不易代谢。研究还发现:孔雀石绿及隐性孔雀石绿具有多重毒性，包括致癌性、致基因突变、引起染色体断裂、致畸胎及呼吸道毒性等。鉴于此，美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家均已禁止将孔雀石绿用作鱼类的抗真菌药物，我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化全物清单》中。
[0004]孔雀石绿理化检测方法包括气相色谱(GC)、高效液性色谱(HPLC)、气质联用(GC-MS)和液质联用(HPLC-MS)等，这些方法灵敏准确、特异性强，分离度好，但需要昂贵的仪器设备，样品前处理复杂、繁琐费时、检测成本高，不能现场操作，而且需要专业技术人员；与之相比，酶联免疫方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国水产养殖、食品加工企业、政府职能监管部门等开展检测工作。
【发明内容】
[0005]本实用新型的目的是提供了一种小巧轻便的孔雀石绿残留检测ELISA试剂盒，使用该试剂盒操作简便，灵敏度高，成本低，稳定性好，可进行一次连续多个样品中孔雀石绿含量的测定，减少了样品检测所需要的时间。
[0006]本实用新型的技术方案是:
[0007]一种孔雀石绿残留检测ELISA试剂盒，包括盒体和连接于盒体上的盒盖，开口一侧的盒盖与盒体上分别设有相对应的盒盖卡头和盒体卡槽，其特征在于:所述的盒体内部由上到下依次设有顶部固定座和底部固定座,其中底部固定座由底部间隔分为A、B两部分，A部分设有7个试剂瓶下凹瓶位，B部分设有5个试剂瓶下凹瓶位，A部分的7个试剂瓶下凹瓶位内分别放置有孔雀石绿抗体工作液、酶标二抗工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、浓缩洗涤液和孔雀石绿标准液，B部分的5个试剂瓶下凹瓶位内分别放置有淡水鱼稀释液、海水鱼稀释液、虾肉稀释液、饲料稀释液和Tween-20备用液，所述的顶部固定座由手柄分为A、B两部分，A部分设有2个卡槽，B部分设有6个凹槽，A部分的2个卡槽内分别放置有96孔酶标板和酶标反应微孔条，B部分的6个凹槽内分别放置有1.0mL吸管、100 μ L微吸管、60 μ L微吸管、50 μ L微吸管、比色卡和pH试纸，在顶部固定座B部分的上方放置有基质标准曲线和说明书。
[0008]所述的酶标板由聚苯乙烯制成，采用96孔试剂板作为固相载体，放于铝钼袋内，并置于酶标板卡槽中，且酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有12个反应孔，其上预包被孔雀石绿偶联抗原。
[0009]本实用新型的有益效果是:试剂盒所需仪器较少，操作简单易行，且能快速、准确、批量地用于样品溶液中孔雀石绿含量的定量、定性检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是本实用新型的结构示意图，图2是本实用新型中底部固定座的结构示意图，图3是本实用新型中顶部固定座的结构示意图。
[0011]图面说明:1、盒体,2、盒盖，3、底部固定座，4、顶部固定座；5、盒体卡槽，6、盒盖卡头，7、底座间隔，8、孔雀石绿抗体工作液瓶位，9、酶标二抗工作液瓶位，10、显色剂A液瓶位，11、显色剂B液瓶位，12、终止液瓶位，13、浓缩洗涤液瓶位，14、孔雀石绿标准液瓶位，15、淡水鱼稀释液瓶位，16、海水鱼稀释液瓶位，17、虾肉稀释液瓶位，18、饲料稀释液瓶位，19、Tween-20备用液瓶位，20、手柄，21、酶标板卡槽，22、酶标反应微孔条卡槽，23、1.0ml吸管凹槽，24、ΙΟΟμΙ微吸管凹槽，25、60μ1微吸管凹槽，26、50μ1微吸管凹槽，27、比色卡凹槽，28、pH试纸凹槽。
【具体实施方式】
[0012]结合附图详细描述实施例。一种孔雀石绿残留检测ELISA试剂盒，包括盒体1、盒盖2、设置盒体I内的底部固定座3和顶部固定座4，所述的盒体I上有盒体卡槽5，与盒盖2上的盒盖卡头6相对应，用于开关试剂盒。
[0013]所述的底部固定座3由底部间隔7分为A、B两部分，A部分设有7个试剂瓶下凹瓶位，B部分设有5个试剂瓶下凹瓶位。A部分孔雀石绿抗体工作液瓶位8放置有白色塑料试剂瓶封装的6ml孔雀石绿抗体工作液，酶标二抗工作液瓶位9放置有红色塑料试剂瓶封装的6ml兔抗鼠酶标二抗(RaMIgG-HRP)，显色剂A液瓶位10放置有黑色塑料试剂瓶封装的4ml底物显色剂A液，显色剂B液瓶位11放置有绿色塑料试剂瓶封装的4ml底物显色剂B液，终止液瓶位12放置有黄色塑料试剂瓶封装的7ml 2M硫酸溶液，浓缩洗涤液瓶位13放置有半透明塑料试剂瓶封装的40ml浓缩洗涤液(10 X )，孔雀石绿标准液瓶位14放置有白色透明塑料试剂瓶封装的2ml孔雀石绿标准品溶液(lmg/ml)。B部分淡水鱼稀释液瓶位15放置有红色帽的半透明塑料试剂瓶封装的50ml淡水鱼样品稀释液，海水鱼稀释液瓶位16放置有黄色帽的半透明塑料试剂瓶封装的50ml海水鱼样品稀释液，虾肉稀释液瓶位17放置有白色帽的半透明塑料试剂瓶封装的20ml虾肉样品稀释液，饲料稀释液瓶位18放置有灰色帽的半透明塑料试剂瓶封装的20ml饲料样品稀释液，Tween-20备用液瓶位19放置有黑色帽的黑色塑料试剂瓶封装的3ml Tween-20表面活性剂。
[0014]所述的顶部固定座4由手柄20分为A、B两部分，A部分设有2个卡槽，B部分设有6个凹槽。A部分的酶标板卡槽21放置一块由聚苯乙烯制成的酶标板，采用96孔试剂板作为固相载体，放于铝钼袋内，且酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有12个反应孔，其上预包被孔雀石绿偶联抗原，酶标反应微孔条卡槽22放置有24-36条散装酶标反应微孔条，使用时安装在酶标板外框支撑架上，使试剂盒检测容量扩大2-3倍。B部分的1.0ml吸管凹槽23放置有50根1.0ml容量的吸管，用于样品基质的采样，ΙΟΟμΙ微吸管凹槽24放置有50根ΙΟΟμΙ容量的微吸管，用于添加终止液，60μ1微吸管凹槽25放置有50根60μ1容量的微吸管，用于添加显色剂溶液，50μ1微吸管凹槽26放置有50根50μ1容量的微吸管，用于添加孔雀石绿抗体工作液和酶标二抗工作液，比色卡凹槽27放置有不同基质条件下的比色卡，显示不同颜色试剂孔对应的吸光度值和孔雀石绿残留含量，用于样品含量的大概推算，PH试纸凹槽28放置不同种类的PH试纸，用来测定不同溶液的pH值。B部分凹槽的表面还放置有基质标准曲线和说明书，将酶标仪测定的吸光度值代入标准曲线，可准确测定样品溶液中孔雀石绿残留含量。
[0015]鱼、虾可食组织中孔雀石绿含量测定:
[0016]I)样品前处理:取鱼、虾等水产样品中可食性肌肉部分，均质器均浆；准确称取2g均质后样品于15ml离心管中，再加入Iml混合提取液(对甲苯磺酸0.2g，盐酸羟胺0.1g,乙酸胺0.2g，加蒸馏水溶解，定容至500ml，再用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH4.5)至离心管中，振荡Imin ;将3ml乙腈加入到离心管中，剧烈振荡2min ;室温下4000r/min离心5min,吸取100 μ I上清液待检。
[0017]2)试剂盒的操作步骤:①将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡20min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀取出所需数量的微孔条，将不用的微孔条放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8°C 编号:将样品对应微孔按序编号，每个样品做2孔平行，并记录样品孔所在的位置加样品:加样品50 μ I到对应的微孔中，随即加入酶标二抗工作液50 μ I /孔，再加入孔雀石绿抗体工作液50 μ I /孔，轻轻振荡混匀，置37°C避光环境中反应30min 洗板:将孔内液体甩干，用洗涤工作液300 μ I/孔，充分洗涤5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；?显色:加入底物显色剂溶液60 μ I/孔(A液和B液各30 μ I )，轻轻振荡混勻，置37°C避光环境反应15_20min ；?测定:加入终止液100 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值。
[0018]3)测定样品溶液中孔雀石绿含量:
[0019]①定性测定:底物显色15_20min后，将样品孔蓝色深浅与比色卡对比，获得不同样品基质中孔雀石绿残留大概含量。
[0020]②定量测定:加入终止液100 μ I/孔后，将酶标仪测定的吸光度值代入标准曲线，可准确测定样品溶液中孔雀石绿残留含量。
【权利要求】
1.一种孔雀石绿残留检测ELISA试剂盒，包括盒体和连接于盒体上的盒盖，开口一侧的盒盖与盒体上分别设有相对应的盒盖卡头和盒体卡槽，其特征在于:所述的盒体内部由上到下依次设有顶部固定座和底部固定座,其中底部固定座由底部间隔分为A、B两部分，A部分设有7个试剂瓶下凹瓶位，B部分设有5个试剂瓶下凹瓶位，A部分的7个试剂瓶下凹瓶位内分别放置有孔雀石绿抗体工作液、酶标二抗工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、浓缩洗涤液和孔雀石绿标准液，B部分的5个试剂瓶下凹瓶位内分别放置有淡水鱼稀释液、海水鱼稀释液、虾肉稀释液、饲料稀释液和Tween-20备用液，所述的顶部固定座由手柄分为A、B两部分，A部分设有2个卡槽，B部分设有6个凹槽，A部分的2个卡槽内分别放置有96孔酶标板和酶标反应微孔条，B部分的6个凹槽内分别放置有1.0mL吸管、100 μ L微吸管、60 μ L微吸管、50 μ L微吸管、比色卡和pH试纸，在顶部固定座B部分的上方放置有基质标准曲线和说明书。
2.根据权利要求1所述的孔雀石绿残留检测ELISA试剂盒，其特征在于:所述的酶标板由聚苯乙烯制成，采用96孔试剂板作为固相载体，放于铝钼袋内，并置于酶标板卡槽中，且酶标板由外框支撑架和放置其上的可拆装酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有12个反应孔，其上预包被孔雀石绿偶联抗原。
【文档编号】G01N33/543GK203981679SQ201420336230
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】王秋霞, 杨英军, 李新朋, 杜凤山, 怀文辉, 孙志文 申请人:河南知微生物工程有限公司, 河南科技学院