用于相互作用分析的方法和系统与流程

本发明涉及在感测表面处评估分子结合相互作用的方法，并且更特别地涉及用于评估流体样品中分析物和固定在生物传感器的传感器表面上的配体之间相互作用的方法，这不依赖于相互作用模型。

技术背景

能够实时地监测分子(例如生物分子)间相互作用的分析传感器系统，正获得越来越多的关注。这些系统经常基于光学生物传感器，并且通常被称为相互作用分析传感器或生物特异性相互作用分析传感器。代表性的这种生物传感器系统是由GE Healthcare售出的仪器，其使用表面等离子共振(SPR)用于检测样品中分子和固定在感测表面上的分子结构间的相互作用。当样品经过该传感器表面，结合的过程直接反映发生相互作用的速率。样品注射跟随缓冲液流，在其期间检测器响应反映出表面上的复合物的分离速率。来自系统的典型输出是描述分子相互作用随时间的进展的图表或曲线，包括联合阶段部分和分离阶段部分。该结合曲线，其通常被显示在计算机屏幕上，经常被称为结合曲线或“传感图”。

采用系统(和模拟传感器系统)，因此有可能在不使用标记并且经常不纯化涉及的物质的情况下实时地不仅确定样品中的特定分子(分析物)的存在和浓度，还确定附加的相互作用参数，包括分子相互作用的结合(联合)和分离的动力学速率常数，以及表面相互作用的亲和性。联合速率常数(k_a)和分离速率常数(k_d)可以通过使多个不同的样品分析物浓度的得到的动力学数据适合以不同方程形式的相互作用模型的数学描述来获得。亲和性(表达为亲和性常数KA或分离常数K_D)可以从联合和分离速率常数计算得到。

为了将上述相互作用参数从记录的结合曲线中推导出，已经发展了一系列不同的试验和模型，其涉及或多或少的复杂计算，其已经被证明给出多种类型的相互作用的非常可靠的结果。然而，许多这些计算基于特定的相互作用模型，并且因此限制于落入该模型下的特定类型的相互作用，并且存在一系列相互作用，其不容易根据特定模型进行分类。因此，并不总是有可能提供可靠的相互作用参数用于评估一些分析物配体相互作用。图3公开了结合曲线的两种示意示例，其中基于模型的评估(虚线)不能够提供可靠的结果。

评估该类型相互作用的一个备选方法是依赖于结合曲线中的预定点处的报告点。但是在基于报告点的分析中，仅关于在特定报告点处的相互作用的信息被用于表征相互作用，反之结合曲线中的多数信息被丢弃。

技术实现要素：

本发明的目的是提供新的方法和生物传感器系统用于评估流体样品中分析物和固定在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用，所述方法和生物传感器系统克服了现有技术的一种或多种缺陷。这通过如独立权利要求中限定的方法和生物传感器系统实现。

使用本发明的方法和生物传感器系统的一个优点是其允许分析物配体相互作用的评估，其独立于理论相互作用模型，同时仍然考虑所有记录(register)数据点。另一个优点是与现有技术的评估方法相比评估不太复杂，并且因此要求更少的计算能力。

本发明的更完全的理解，以及其进一步的特征和优点，将通过参考以下的详细描述和附图而获得。

附图说明

图1是基于SPR的生物传感器系统的示意侧视图。

图2是代表性传感图，其中结合曲线具有可见的联合和分离阶段。

图3示出两种结合曲线的示例，两种结合曲线难以适合理论模型。

图4示出根据本发明的一个实施例的方法的示意框图。

图5-9图示本发明的一个实施例。

图10-17图示示例1。

图18-20图示示例2。

图21-22图示示例3。

具体实施方式

如以上提到的，本发明涉及一种方法和生物传感器系统，其用于评估流体样品中的分析物和固定在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用。

通常，实验结合数据通过基于传感器的技术获得，其研究分子相互作用并且实时呈现结果作为相互作用进展。然而在更详细描述本发明之前，将描述意图使用本发明的一般上下文。

除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与由相关于本发明的领域的技术人员普遍的理解的相同含义。而且，单数形式“一”、“一个”和“该”意味着包括复数参考，除非其另有规定。

本文提到的所有出版物、专利申请、专利、和其他参考通过引用全部并入本文。

化学传感器或生物传感器通常基于无标记技术，检测传感器表面的性质变化，例如固定层的质量、折射率、或厚度，但是还存在依赖于某种类标记的传感器。典型的传感器检测技术包括，但是不限于，质量检测方法例如光学、热-光和压电或声波方法(包括例如表面声波(SAW)和石英晶体微天平(QCM)方法)，和电化学方法，例如测定电位、测定电导、测定电流和电容/阻抗方法。关于光学检测方法，代表性的方法包括检测质量表面浓度的那些方法，例如反射-光学方法，包括外部和内部反射方法，其为角度、波长、偏振或相位解析，例如倏逝波椭偏仪和倏逝波光谱(EWS，或内反射谱)，其两者可以包括经由表面等离子共振(SPR)，布鲁斯特角折射仪，临界角测折射仪，受抑全反射(FTR)，散射全内全反射(STIR)(其可以包括散射增强标记)，光波导传感器；外部反射成像，基于倏逝波成像例如临界角解析成像，布鲁斯特角解析成像，SPR角解析成像等的倏逝场增强。另外此外，测定光度测定和成像/显微方法，“本身”或和与反射方法结合，基于例如表面增强拉曼光谱(SERS)，表面增强共振拉曼光谱(SERRS)，倏逝波荧光(TIRF)和磷光可以被涉及提到，以及波导干涉仪(例如如由实现的Bio-Layer干涉法)，波导漏模光谱，反射干涉光谱(RIfS)，透射干涉法，全息光谱，和原子力显微镜(AFR)。

商业可用的生物传感器包括前面提到的系统仪器，由GE Healthcare制造和出售，其基于表面等离子共振(SPR)并且准许实时监测结合的配体和感兴趣的分析物之间的表面结合相互作用。在该上下文中，“配体”是一种分子，其对给定的分析物具有已知的或未知的亲和性(affinity)，并且包括固定在表面上的任意俘获或捕获试剂，反之“分析物”包括任何与此相关的特定结合伴侣(partner)。

虽然在接下来的详细描述和示例中，本发明在SPR光谱并且更特别的系统的上下文中图示，应该理解本发明不限于这种检测方法。而是，任何基于亲和性的检测方法，其中分析物结合到固定在传感表面上的配体可以被使用，假设可以测量感测表面处的变化，其定量指示分析物与其上固定的配体的结合。

SPR现象是公知的，简单的说当光在某些条件下在具有不同折射率的两种媒体之间的界面处反射时SPR出现，并且界面被金属膜涂敷，通常为银或金。在仪器，媒体是样品和传感器芯片的玻璃，其通过微流体流动系统与样品接触。金属膜是芯片表面上的金的薄层。SPR引起了以反射特定角度的反射光强度的减少。该最小反射光强度的角度随着邻近与所述反射光相对侧(在系统中是样品侧)上的表面的折射率而变化。

系统的示意图在图1中显示。传感器芯片1具有金膜2，其支承捕获分子(配体)3，例如抗体，通过流动通道5暴露于具有分析物4例如抗原的样品流。来自光源7(LED)的单色p偏振光6被棱镜8耦合到玻璃/金属界面9，在此光被完全反射。反射光束10的强度被光检测单元11(光电检测器阵列)检测。

仪器和SPR现象的技术方面的详细讨论可以在美国专利No.5313264中找到。关于生物传感器感测表面的基涂层的更多详细的信息在例如美国专利No.5242828和5436161中给出。另外，与仪器结合使用的生物传感器芯片的技术方面的详细讨论可以在美国专利No.5492840中找到。

当样品中的分子结合到传感器芯片表面上的捕获分子时，浓度和因此的所述表面处折射率变化并且检测到SPR响应。在相互作用进程期间标绘响应对时间，将提供该相互作用进展的定量测量。这种标绘图、或动力学或曲线(结合等温线)，通常被称为结合曲线或传感图，有时在本领域也称为“亲和痕迹”或“亲和图(affinogram)”。在系统中，SPR响应值被表达为共振单位(RU)。一个RU表示在最小反射光强度的角度的0.0001°变化，其对于多数蛋白质和其他生物分子来说对应于在传感器表面上的大约1pg/mm²的浓度变化。当含有分析物的样品接触所述传感器表面时，结合到传感器表面的捕获分子(配体)在称为“联合”的步骤中与分析物相互作用。该步骤在结合曲线中通过当样品开始与传感器表面接触时RU的增加来指示。相反，通常当样品流被例如缓冲液流替代时发生“分离”。该步骤在结合曲线上通过当分析物从表面结合配体分离时随时间的RU的降低来指示。

图2呈现在传感器芯片表面处的可逆的相互作用的代表性结合曲线(传感图)，所述感测表面具有固定的捕获分子，或配体，例如抗体，其因此与结合伴侣或例如样品中的分析物相互作用。通过基于以上提到的其他检测原理的生物传感器系统产生的结合曲线将具有类似的外观。垂直轴(y轴)指示响应(这里是共振单位，RU)和水平轴(x轴)指示时间(这里是以秒为单位)。在水平轴下方，采集结合曲线的采集周期被示意性公开为分成不同的时间段，其中传感器表面与不同流体接触。开始，从t₁到t₂，缓冲液(B)通过所述感测表面，给出了结合曲线上的基线响应I。接着从t₂到t₃期间，传感器表面接触含有浓度为C₁的分析物的样品，因而由此观察到由于分析物结合导致的信号增加。结合曲线的该部分II被通常称为“联合阶段”。最终，在联合阶段的结束或接近结束时到达了稳定状态条件，其中在III处的共振信号稳定时期(该状态可以然而并不总是被获得)。要注意本文中的术语“稳定状态”与术语“平衡”(在其他上下文中术语“平衡”可以保留以描述理想的相互作用模型，因为实际上结合可以随时间是恒定的，即使系统不处于平衡)同义使用。在联合阶段的结尾，在t₃，样品经常被缓冲液(B)的连续流代替，并且信号的减小反映了分析物从表面的分离或释放。结合曲线的该部分IV通常称为“分离阶段”。分析可任选地通过再生步骤在t₄结束，其中能够从表面去除结合分析物同时(理想地)保持配体的活性的溶液(R)，被注入传感器表面上。这在传感图上的部分V中指示。在t₅缓冲液(B)的注入恢复到基线I，并且表面现在准备新的分析。在一些情况下省略重生再生步骤V并且现在在没有再生的情况下开始新的注射周期可以是方便的。这样的类情况的示例包括相同分析物的浓度系列，采用足够高的分离速率筛查分析物以允许基本完全的分离等。

分别从联合和分离阶段II和IV的轮廓，获得关于结合和分离动力学的信息，并且结合曲线在III处的高度表示亲和性(起因于相互作用的响应与表面上质量浓度的变化相关)。

本发明

要理解，本发明不限于本发明上述的特定实施例，本发明的范围将通过所附的权利要求限定。

如上所述，本发明涉及一种评估流体样品中分析物和固定在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的方法和生物传感器系统。所述生物传感器可以基于任意类型的亲和性检测方法，其中分析物结合到固定在感测表面上的配体，假设感测表面处的变化可以被检测，其定量指示了分析物与在其上固定的配体的结合。根据示意性公开于图4的一个实施例，所述方法包括以下步骤：

提供参考结合曲线10，表示预定采集周期的参考相互作用，

使用生物传感器采集预定采集周期的分析物配体相互作用的样品结合曲线20，

记录样品结合曲线和参考结合曲线的偏差40，以及

当记录的偏差小于预定的偏差标准时，将分析物配体相互作用50分类为等效于参考相互作用。

如图4的虚线框指示的，所述方法可以任选地包括在偏差被记录前，相对于参考结合曲线30将样品结合曲线归一化的步骤。这种归一化可以被用于补偿传感器表面上的配体活性的变化。

遍及本公开，术语参考结合曲线指的是这样的结合曲线，其表征参考相互作用，例如：

具体分析物-配体对之间的相互作用，

特定相互作用类型，其可为两个或多个的分析物-配体对的组共用，

指示具体相互作用机制的特定相互作用行为，

等等。

参考结合曲线可以以基本上任何合适方式提供，并且它可以是如使用生物传感器所采集的直接使用的特定相互作用的直接结合曲线，或它可以是精炼的结合曲线，其通过操控一种或多种结合曲线提供，如将被更详细地公开。在一个实施例中，参考结合曲线通过在预定采集条件下，使用生物传感器采集参考分析物配体相互作用的一种或多种结合曲线来提供。在一些实施例中，参考结合曲线可以是一种理论结合曲线，其不直接基于通过生物传感器采集的结合曲线，而是基于理论或经验模型，例如结合曲线，其特定设计成表征具体相互作用机制等。理论结合曲线可以例如使用理论模型和合适的动力学和亲和性常数进行模拟。

在本方法中，参考结合曲线表示预定采集周期的参考相互作用，并且待评估分析物配体相互作用的样品结合曲线使用相同的预定采集周期采集，由此得到的结合曲线可以通过直接比较进行评估，而不是将响应适合理论模型等以提取用于评估的具体相互作用参数。

遍及本公开，术语预定采集周期包括收集步骤和生物传感器设置以及一个或多个样品流体中的分析物浓度，其对采用生物传感器记录的结合曲线的形状有影响。根据一个实施例，预定采集周期包括至少一个联合阶段，其中传感器表面与包含以预定浓度的分析物的流体样品接触。在一个实施例中，预定采集周期包括用于不同分析物浓度的至少两个联合阶段，由此来自分析物配体相互作用的动力学特性的贡献在得到的结合曲线中增大。预定采集周期可以包括至少一个分离阶段，其中传感器表面与无分析物的流体接触。图5示出预定采集周期的示例和参考曲线的示例，包括浓度为C₁到C₅的分析物的5个联合阶段，带有中间的分离阶段B，其中传感器表面与不含无分析物的缓冲液接触。在图5中采集周期被在特定时间点t_n被分成不同段的过程时间轴图示，在特定时间点t_n被分成不同段。如可以从联合参考结合曲线看到的，C₁＜C₂＜C₃＜C₄＜C₅。然而，应该注意的是，预定采集周期决不应被限定到图5的示例，并且预定采集周期可以以任何适合的方式设计成利于分析物配体的相互作用的评估和分类。预定采集周期可以例如包括：

具有分析物浓度C₁的一个单个联合阶段，

以相同的分析物浓度C₁的几个联合阶段，

没有中间分离阶段的两个或多个连续的联合阶段，

一个或多个再生相，

高分析物浓度之后是较低的分析物浓度，

将同样的分析物通过两个或多个具有在其上固定的不同配体的生物传感器表面，例如传递到分析生物特异性和多特异性结合物，例如抗体等，

竞争型试验，

……

一些通过预定采集周期限定的参数可以与使用的生物传感器的类型并且相同的设置相关。例如当生物传感器的传感器表面提供在流动池中，然后预定采集周期也可以限定流体通过流动池的流动速率，因为在一些条件下的联合和分离速率取决于流动速率。可能相关的其他参数是生物传感器处的温度，配体活性的衰减等。

分析物浓度C₁到C₅可以离线制备，并且提供于单独的样品容器中或浓度通过能够将高浓度样品原液与缓冲液等混合为以预定浓度分析物的样品流体的在线混合单元提供。

在图5a中参考结合曲线被显示为虚线曲线，其指示参考相互作用，分析物配体相互作用将相对于它进行评估。根据一个实施方式，记录样品结合曲线和参考结合曲线的偏差的步骤40通过从参考结合曲线的偏差的直接计算来执行，并且由此相对于偏差量的直接阈值可以为分类步骤50设置。根据其他实施例，更多特定阈值标准可以为分类步骤提供，例如通过相对于在预定采集周期中的它的一个或多个相或部分的偏差的权重等。

根据一个实施例，如图5a示意性示出的，上限和/或下限的参考阈值曲线可以被提供为了限定相对于参考结合曲线的可接收阈值，并且其中偏差标准相对于一个或多个参考阈值曲线限定。在图5a中上限和/或下限的参考阈值曲线被公开为细的实线并且它们各表示参考结合曲线沿着y轴分别在正向和负向上的线性位移，即：

上限阈值曲线＝参考结合曲线+预定上限阈值参数

下限阈值曲线＝参考结合曲线-预定下限阈值参数

图5b是图5a的采集周期和对应参考曲线，其中样品结合曲线被绘制为细虚线用于分类。图5b中公开的样品结合周期整体落入上限和下限的阈值曲线的边界内并且可以因此被分类为等效于预定阈值的参考相互作用。根据一个实施例，分类可以基于单个的上限或下限的阈值曲线，其中当它满足一个阈值曲线时样品结合曲线被分类为等效于参考相互作用。如下面将详细地和结合示例公开的，以上限和下限的阈值曲线形式的偏差标准可以基于从多个参考结合曲线的捕捉中计算的统计信息来提供。在这种方式中，用于分析物配体结合曲线的分类的阈值可以对于真实的相互作用偏差等更具代表性。根据一个实施例，用于分析物配体相互作用的分类的预定偏差标准响应于预定采集周期的不同相或部分加权。

图6到9示出建立统计限定的参考结合曲线以及上限和下限的阈值曲线的一种方式。为了提供统计相关的参考结合曲线，采集了两个或多个结合曲线用于预定采集周期的参考分析物配体相互作用。在图6中，5个参考-分析物配体相互作用结合曲线被示意性公开用于预定采集周期。由于生物传感器响应和样品制备等的变化，在参考-分析物配体相互作用结合曲线间的一定量的偏差可以被预期，并且因此根据本方法的评估可以被布置为考虑这类偏差。根据一个实施例，参考结合曲线然后限定为所述两个或多个结合曲线的平均或中间曲线并且在步骤40样品结合曲线相对于平均或中间曲线的偏差被记录。对于一些参考-分析物配体相互作用，记录的结合曲线之间的偏差通过偏差/衰减类型模式被表征。在这类情况中，参考-分析物配体相互作用结合曲线可以在统计地限定的参考结合曲线的计算之前被归一化。归一化可以根据特定的偏差/衰减模式以任何合适的方式执行，并且根据一个实施例，它可以通过在预定采集周期中选择适合的归一化的点t_N和在y方向上行将参考-分析物配体相互作用结合曲线重新标度(这样使得所有的曲线或在一系列曲线的情况下，使得所有曲线或曲线系列在所述点t_N具有相同值)来实施执行。归一化的点优选地根据预定采集周期进行选择，并且在一个实施例中它被选为在联合阶段的结束之前具有最高响应的短时帧的点。图7示意性地公开了相对于归一化的点t_N归一化图6的参考-分析物配体相互作用结合曲线。另一实施例是选择两个或多个归一化点t_N，并且例如基于所述归一化点t_N处的平均响应来归一化曲线。

在图8中，参考结合曲线被示意性图示为基于图7的归一化的参考-分析物配体相互作用结合曲线的平均曲线。备选地，参考结合曲线可以被提供为中间曲线或以任何其他适合的统计学方法，其将会提供表示预定采集周期的参考相互作用的参考结合曲线。通过使用用于限定参考结合曲线的统计学方法，还提供了关于与例如平均曲线的偏差的信息，并且这种信息可以被使用以提供参考阈值曲线，其例如允许相对于预定采集周期的一个或多个相或部分的更宽的阈值范围，其中记录的参考-分析物配体相互作用结合曲线示出更宽的偏差范围。在一个实施例中上限和下限的参考阈值曲线分别被所述两个或多个参考-分析物配体相互作用的最小和最大限定。在一个实施例中，上限和下限的参考阈值曲线通过从参考结合曲线等中选择预定百分比的偏差来限定。在一个实施例中，上限和下限参考阈值曲线可以通过使用合适的动力学和亲和性常数参考结合曲线等的理论模拟来限定。在一个实施例中，上限和下限的参考阈值曲线可以由用户通过图形用户界面等来操控，用户可以例如能够进行以下的一种或多种：

相对于参考曲线移动一个或多个阈值曲线。移动可以是自由的或限制的以保持对准参考曲线。

使用绘制工具绘制自定义的阈值曲线。

使用绘制工具等修改现有的阈值曲线。

在一个实施例中，其被示意性地公开于图8，并且将在示例中更详细地公开，上限和下限参考阈值曲线被通过与平均曲线的预定标准偏差限定。通过使用标准偏差的概念，评估的相关性可以建立到高等级的确定性。根据本发明的使用标准偏差限定评估的阈值的概念进一步使得呈现以标准偏差图的形式的评估结果，以清晰图示样品结合曲线与限定的参考阈值曲线的配合，如参考示例1的图14所图示的。根据一个实施例，所述方法包括以下步骤：

在图形显示器上显示，用于视觉检查，以下的一个或多个：

参考结合曲线，一个或多个样品结合曲线和任选的上限阈值曲线，下限阈值曲线和控制结合曲线的重叠图，

偏差图，其中记录的与参考记录曲线的偏差被显示用于一个或多个样品结合曲线，以及

参考阈值曲线图，其中一个或多个样品结合曲线被显示在参考阈值标度上。

另外，如已经提及的，一个或多个样品结合曲线可以相对于参考结合曲线被归一化，以便避免来自例如生物传感器波动等的影响。而且，为了验证生物传感器和涉及的分析物配体相互作用的功能是相关的，所述方法可以包括以下步骤：

与样品结合曲线联合采集控制-分析物配体相互作用的控制结合曲线，

记录控制结合曲线与参考结合曲线的偏差，以及

当控制结合曲线的偏差小于预定控制限定时验证样品结合曲线的采集。

如以上的，控制结合曲线也可以相对于参考结合曲线被归一化。在一个实施例中，预定的控制限定可以与参考阈值曲线相同。控制-分析物配体相互作用可以方便地与参考相互作用相同。

根据一个实施例，将分析物配体相互作用分类的步骤包括计算样品结合曲线的数据点的百分比，数据点位于参考阈值曲线外部并且其中偏差标准是允许位于参考阈值曲线外部的数据点的最大百分比。根据一个实施例，将分析物配体相互作用分类的步骤包括计算阈值参考结合曲线和/或样品结合曲线的平方和，其中参考曲线已经首先被减去，并且其中偏差标准是允许的最大平方和。根据一个实施例，分类的步骤包括基于被识别的位于阈值曲线内部的点的百分比和阈值曲线外部的计算的限定距离和样品距离之间的比率平方和计算类似性分数。因此类似性分数等于内部点的百分比加上外部点的百分比乘以SSQ(限定距离)除以SSQ(样品距离)。在该实施例中内部点被给出值100，并且外部点基于到参考曲线的距离被缩放。

在一个实施例中，示意性公开于图9，本发明包括从记录偏差的步骤和接下来的步骤中排除结合曲线的一个或多个段的步骤。从结合曲线中的一个或多个段的排除可以对排除包括干扰如尖峰等的区域是有用的。在一个实施例中，所述方法包括识别干扰以自动排除这类段的步骤。在一个实施例中，要被排除的段是基于分析物配体相互作用的现有技术和预定的采集条件确定的，并且在公开于图9的实施例中，排除的段包括在如通过预定采集周期限定的联合和分离阶段之间的转变。

所述方法由此可以被用于评估流体样品中的分析物和固定在生物传感器的传感器表面上的配体之间的任何相互作用，其中有可能提供相关的参考结合曲线，表示参考相互作用，并且其中期望快速和可靠的相关评估。应用领域的示例包括：

过程质量控制，由此方法用来验证最终或中间过程结果，

筛选分析物/配体库以识别某一类型的结合行为等，例如片段筛选，

解离率筛选，

热力学筛选，

单相结合物的筛选，

与无校正浓度分析CFCA结合的效能测定，其中响应曲线的评估确保靶标/受体结合的相似性，其为效能分析的基础。

根据一个实施例，配体和分析物中的至少一个被从以下组中选出：药物靶标和天然的它们的结合伴侣或用于表征药物靶标的试剂。

根据一个实施例，提供了生物传感器，其布置成执行根据以上的方法。所述生物传感器系统，可以例如是基于SPR的系统，如系统或例如波导干涉仪如系统等。仍进一步地，提供了计算机程序，其布置成当在计算机上运行时，控制生物传感器系统的操作以执行根据以上的方法。

示例1

图10-17示出根据本发明的一个实施例的评估流体样品中的分析物和固定在生物传感器的传感器表面上的配体之间的相互作用的一个示例。在该示例中他(his)的标记Fc受体，FcγRIIIaVal158被捕获在抗组氨酸生物传感器表面并且抗体，利妥昔单抗到生物传感器表面的结合被记录。图示出对于以增加的抗体浓度的具有5个联合阶段的采集周期的相互作用收集的参考结合曲线的范围，每个具有后续分离阶段。可以看到在不同的参考结合曲线之间的响应具有大的变化。图11公开了使用在最后联合阶段的结束前几秒钟的数据作为归一化的基础所归一化参考结合曲线。

在图12中，中间曲线表示图11的归一化的参考结合曲线的平均，并且上限和下限的曲线分别表示平均+/-三个标准偏差。图13示出平均参考结合曲线和上限和下限曲线之间的对应不同点，其清楚地示出其中存在在记录的参考结合曲线中的不确定性，反之图14示出在标准偏差比例上重新绘制的记录的参考结合曲线。

图15示出平均和标准偏差曲线，其中在联合和分离阶段之间的转变的某些区段被排除，以减少在那些片段中不确定性的影响。图16示出在图15的参考结合曲线图上绘制的样品结合曲线，如可以看到的，不是所有数据都落入+/-三个标准偏差曲线内。图17示出在标准偏差比例上重新绘制的样品结合曲线，并且可以看到样品结合曲线在若干时间点处与参考结合曲线明显地偏离多于三个标准偏差。然而，对于相互作用所记录的控制样品被推断如期望地表现，并且很好地处于与所有时间点处参考结合曲线的三个标准偏差内。

示例2

图18到20公开了示例，其中MabX-ECR试剂3154根据本发明被评估。在该示例中包括增加水平的加压(stressed)MabX的MabX-ECR试剂3154被评估。图18a示出对于具有一个联合阶段和后续分离阶段的采集周期的野生型MabX-ECR试剂3154的相互作用所收集的参考结合曲线的范围。可以看到在不同结合曲线之间的响应存在适度的变化。图18b公开了归一化的参考结合曲线并且图18c示出了对应的SD限定曲线。图19到20示出增加水平的加压MabX的评估，其中图19公开了对于pH加压刺状MabX所获得的结果并且图20公开了对于氧化加压MabX所获得的结果。在图19和20中，图19a和20a示出已经减去空白运行后的记录的响应曲线，图19b和20b示出跟随归一化的响应曲线，19c和20c示出在SD图中覆盖的记录的响应曲线中的每个的标准偏差，并且19d和20d示出在SD图中以时间连续的记录的响应曲线的标准偏差。该示例给出由本发明提供的直观评估的良好图示。

示例3

类似于示例2，图21和22公开了示例，其中根据本发明评估了MabX-ECR试剂2994。在该示例中包括增加水平的加压MabX的MabX-ECR试剂2994被评估。图21和22示出增加水平的加压MabX的评估，其中图21公开了对于pH加压刺状MabX所获得的结果并且图22公开了对于氧化加压MabX所获得的结果。在图21和22中，图21a和22a示出跟随归一化的响应曲线，并且图21b和22b示出在SD图中一时间连续的记录的响应曲线的标准偏差。